专利名称：：一种刺激隐核虫幼虫膜蛋白油佐剂疫苗及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及疫苗制备领域，具体涉及制备方法和应用。种剌激隐核虫幼虫膜蛋白油佐剂疫苗及其
背景技术：
：束lj激隐核虫(CryptocaryonirritansBrown，1951)，又称咸水小瓜虫(Ichthyophthiriusmarinus)，是一种鱼类专性寄生虫，寄生于热带、亚热带海水鱼身体，使宿主发生"白点病"。剌激隐核虫的宿主范围很广泛，除软骨鱼类对剌激隐核虫有较强抵抗力外，海水硬骨鱼类普遍能被剌激隐核虫感染，严重感染会导致鱼类大量死亡。近年来剌激隐核虫病在世界各地频繁爆发，危害日益严重，我国南海海水养殖区也年年爆发"白点病"，造成了很大的经济损失。但目前防治海水鱼类"白点病"的方法很有限，虽然一些物理和化学方法能起到一定效果，但它们都或多或少存在一些缺陷，如对鱼有毒性、效果不确定或者不适用于大水体等等。Colorni(1985)曾提出鱼类对剌激隐核虫可能会产生获得性免疫保护，此后他进一步提出由于剌激隐核虫生长于宿主的上皮层内，与宿主有着更密切的关系，合适的疫苗可能成为防治剌激隐核虫的有效方法。但是要对某种鱼采用免疫预防措施，首先就要弄清楚该种鱼是否能对剌激隐核虫的感染产生获得性免疫力，是否能得到足够的免疫保护。Burgess等(1995)首次证明了鲻鱼(Chelonlabrosus)可以对剌激隐核虫产生获得性免疫保护，且保护力与感染强度成正比。Yoshinaga等(1997)发现经剌激隐核虫免疫后底鏘(Fundulusheteroclitus)能产生抗血清，该血清能使寄生虫的幼虫纤毛聚积成团并发生阻动(Immobiliazation)。在以卵形鲳鰺作为动物模型进行剌激隐核虫标准化传代过程中也发现，随着被感染次数的增加，卵形鲳鰺的抗感染能力逐渐加强，感染上鱼的寄生虫数量逐渐减少。鉴于以上实验已经证实了鱼类对剌激隐核虫的感染能产生获得性免疫力，并得到足够的免疫保护，因此研制剌激隐核虫幼虫的灭活疫苗用以防治该寄生虫具有极大的应用前景。
发明内容本发明的目的在于根据现有技术的不足，提供一种对鱼没有毒性且免疫效果显著的剌激隐核虫幼虫膜蛋白油佐剂疫苗。本发明另一目的在于提供上述剌激隐核虫幼虫膜蛋白油佐剂疫苗的制备方法。本发明还有一个目的是提供上述剌激隐核虫幼虫膜蛋白油佐剂疫苗的应用。本发明上述目的通过以下方案予以实现—种剌激隐核虫幼虫膜蛋白油佐剂疫苗的制备方法，包括如下步骤(1)剌激隐核虫活幼虫的收集；(2)剌激隐核虫幼虫膜蛋白的提取；(3)在幼虫膜蛋白中加入PBS作为水相，10号白油、司本-80和硬脂酸铝混合作为油相，按照水相油相=3:7的体积比进行乳化，得到剌激隐核虫幼虫膜蛋白油佐剂疫苗。其中，步骤(1)中所述剌激隐核虫活幼虫的收集方法优选为剌激隐核虫幼虫孵出后，收集虫液，加入10wt^的蔗糖，离心10min，弃上清，收集沉淀中的活幼虫。步骤(2)中所述剌激隐核虫幼虫膜蛋白的提取是利用非离子去垢剂在ot:时可同时溶解亲水性蛋白质和疏水性蛋白质，而在3(TC时只溶解疏水性蛋白质的特点，逐步将疏水性的膜蛋白分离出来剌激隐核虫幼虫的细胞或纤毛在ot:时溶解于去垢剂中，经离心去掉细胞骨架和纤毛轴丝，将含有去垢剂的上清液加热到3(TC，使亲水性蛋白质和疏水性蛋白质组分分别成为水相和去垢剂相，再经过低速离心，把去垢剂相中的膜蛋白分离出来，最后用有机溶剂将膜蛋白沉淀出来。所述非离子去垢剂优选TritonX-114，所述将膜蛋白沉淀出来的有机溶剂优选丙酮。步骤(3)中，所述油相为白油、司本和硬脂酸铝混合加热至透明，经高压灭菌后处理得到。所述白油优选为10号白油。所述司本优选为司本-80。本发明剌激隐核虫幼虫膜蛋白油佐剂疫苗可用于制备防治海水鱼类的剌激隐核虫病的药物，特别是用于制备防治"白点病"的药物。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果本发明通过离心获得剌激隐核虫活幼虫并将其膜蛋白作为免疫抗原制备得到的剌激隐核虫幼虫膜蛋白油佐剂疫苗质量好，对鱼类无毒性，安全性高，用本发明剌激隐核虫幼虫膜蛋白油佐剂疫苗免疫海水鱼类，可以使卵形鲳鰺的死亡率降低90%，使斜带石斑鱼的死亡率降低100%。图1为卵形鲳鰺经致死剂量幼虫(3X104个幼虫/鱼)攻毒后的死亡情况；图2为斜带石斑鱼经致死剂量幼虫(4X104个幼虫/鱼)攻毒后的死亡情况。具体实施例方式以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何限定。实施例1剌激隐核虫幼虫膜蛋白油佐剂疫苗的制备1.剌激隐核虫活幼虫的收集用剌激隐核虫幼虫感染卵形鲳鰺，60hr后鱼皮肤和鳃上出现明显可见的滋养体，在接下来的24hr内几乎所有的滋养体都从鱼体上脱落形成包囊，收集脱落的包囊，培养60hr后，包囊开始释放出幼虫，幼虫孵出后，收集虫液，混匀后吸取5份(每份50ul)，加lOul福尔马林杀死幼虫，在显微镜下计数，记算出幼虫的浓度，然后向收集到的虫液中加入10X的蔗糖，混匀，3500rpm离心10min(KUB0TA5100型离心机)，弃上清，沉淀即为收集到的活幼虫。2.剌激隐核虫幼虫膜蛋白的提取所需溶液10mMTris-HCl(pH8.4)，冰预冷的丙酮，10mM/mlPMSF溶于异丙醇，TritonX-114抽提缓冲液(2.0%v/vtritonX_114，300mMNaCl，20mM)，Tris-HCl(pH7.5)，Sucrosecushion(6%(m/v)蔗糖，150mMNaCl，0.06%(v/v)TritonX-114,10mMTris-HClpH7.5)。幼虫膜蛋白提取操作步骤(1)取收集的活幼虫IOO万，保存在冰上，加入10mMTris-HCl至总体积2ml，离心管为厚壁50ml离心管；(2)加入等体积(2ml)的冰预冷的TritonX-114抽提缓冲液；(3)在溶液中加入1/100体积的1MPMSF(终浓度=10mM);(4)振荡样品lmin，在冰上孵育5min;(5)重复步骤(4);(6)16000g/4°C/10min离心，倒出上清液，在冰上保存；(7)加入1mlTritonX-114抽提缓冲液至沉淀中；(8)振荡样品lmin，冰上孵育5min;(9)重复步骤(7);(10)16000g/4°C/10min离心，倒出上清液，冰上保存上清液；(11)混合两种上清液，30。C水浴收集的上清液5min;(12)测定混合的上清液体积，加入等体积的sucrosecushion至一个单独的10ml离心管，3(TC水浴5min;(13)室温下300g离心3min，使上清液分层，将上清液移至另外一个管中，冰上保存去污剂相(浑浊沉淀=去污剂相)；(14)稀释上清液1:3(TritonX-114抽提缓冲液水相)；(15)振荡lmin，冰上孵育5min;(16)重复(14);(17)3(TC温水浴5min使上清液分层，室温下300g离心3min，弃掉水相；(18)沉淀中加入9倍体积的冰预冷的丙酮，冰上孵育30minlhr，_20^储存过夜；(19)16000g/15min/4t:离心，移出丙酮，真空干燥沉淀，-7(TC储存。3.剌激隐核虫幼虫膜蛋白油佐剂疫苗的制备将上述收集到的幼虫膜蛋白加入适量0.15MPBS混合振荡，作为水相；将10号白油(占94wt%)和司本-80(占6wt%)混合，再加入2wt^的硬脂酸铝作为稳定剂，把此混合物混合搅拌加热至透明，高压灭菌处理后作为油相；按水相油相=3:7的比例，以13，000rpm高速搅拌乳化5min，重复3次，在终止搅拌前加入终浓度为0.01%的柳硫汞溶液，即制备成剌激隐核虫幼虫膜蛋白油佐剂疫苗。实施例2疫苗的质量检测取实施例1制备的疫苗1滴轻轻滴在水中，静止观测30min没有发现油滴散开；取制备疫苗3000rmp离心15min未见分层现象；考马斯亮兰R250(水溶性染料)和苏丹II(油溶性染料)检测，疫苗为苏丹II染料颜色，疫苗为油包水剂型。实施例3疫苗的安全性检测同时用剌激隐核虫活幼虫(2.0乂104幼虫/尾鱼)和含有相同幼虫数量的疫苗浸泡感染卵形鲳鰺(124.5±38.lg)，4天内被剌激隐核虫活幼虫感染的鱼全部死亡，体表和鳃上分布着大量的剌激隐核虫滋养体，而被剌激隐核虫疫苗浸泡过的鱼没有出现死亡现象，体表和鳃上也没有发现有剌激隐核虫滋养体的分布，证明该疫苗在生产上使用是安全的。实施例4疫苗的免疫保护力试验将制备好的疫苗经腹腔注射卵形鲳鰺和斜带石斑鱼，注射剂量为每尾鱼注射含2乂104个幼虫的疫苗0.lml，在免疫后第4周分别用致死剂量的幼虫攻毒(卵形鲳鰺致死剂量为3.OX104幼虫/尾鱼，斜带石斑鱼致死剂量为4.OX104幼虫/尾鱼)，统计各实验组鱼7天内的死亡情况，结果发现，与对照组比较，免疫过的卵形鲳鰺死亡率降低了90%(表1，图1)，免疫过的斜带石斑鱼的死亡率降低了100%(表2，图2)。实验证明该疫苗具有很好的免疫保护效果，完全能满足实际生产的需要。表1用致死剂量的剌激隐核虫幼虫攻毒后卵形鲳鰺的死亡情况实验组死亡鱼数量/实验鱼总数量(尾)死亡率(％)对照组50/50100腹腔注射疫苗组5/5010表2用致死剂量的剌激隐核虫幼虫攻毒后斜带石斑鱼的死亡情况<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>权利要求一种刺激隐核虫幼虫膜蛋白油佐剂疫苗的制备方法，其特征在于包括如下步骤(1)刺激隐核虫活幼虫的收集；(2)刺激隐核虫幼虫膜蛋白的提取；(3)在幼虫膜蛋白中加入PBS作为水相，10号白油、司本-80和硬脂酸铝混合作为油相，按照水相∶油相＝3∶7的体积比进行乳化，得到刺激隐核虫幼虫膜蛋白油佐剂疫苗。2.根据权利要求1所述剌激隐核虫幼虫膜蛋白油佐剂疫苗的制备方法，其特征在于步骤(1)中所述剌激隐核虫活幼虫的收集方法为剌激隐核虫幼虫孵出后，收集虫液，加入10wt%的蔗糖，离心，弃上清，收集沉淀中的活幼虫。3.根据权利要求1所述剌激隐核虫幼虫膜蛋白油佐剂疫苗的制备方法，其特征在于步骤(2)中所述剌激隐核虫幼虫膜蛋白的提取方法如下将剌激隐核虫幼虫的细胞或纤毛在(TC时溶解于非离子去垢剂TritonX-114中，离心；将离心后的上清液加热到30°C，低速离心，用丙酮将膜蛋白沉淀出来。4.根据权利要求1所述剌激隐核虫幼虫膜蛋白油佐剂疫苗的制备方法，其特征在于步骤(3)中所述油相是10号白油、司本-80和硬脂酸铝混合加热至透明，经高压灭菌后处理得到。5.—种剌激隐核虫幼虫膜蛋白油佐剂疫苗，其特征在于由权利要求1所述剌激隐核虫幼虫膜蛋白油佐剂疫苗的制备方法制备而成。6.权利要求5所述剌激隐核虫幼虫膜蛋白油佐剂疫苗的应用，其特征在于该疫苗用于制备防治海水鱼类的剌激隐核虫病的药物。全文摘要本发明公开了一种刺激隐核虫幼虫膜蛋白油佐剂疫苗及其制备方法与应用，该疫苗的制备方法如下(1)刺激隐核虫活幼虫的收集；(2)刺激隐核虫幼虫膜蛋白的提取；(3)在幼虫膜蛋白中加入PBS作为水相，10号白油、司本-80和硬脂酸铝混合作为油相，按照水相∶油相＝3∶7的体积比进行乳化，得到刺激隐核虫幼虫膜蛋白油佐剂疫苗。本发明刺激隐核虫幼虫膜蛋白油佐剂疫苗的制备方法简单易行，得到的刺激隐核虫幼虫膜蛋白油佐剂疫苗安全性高，对鱼没有毒性，免疫保护效果显著，可用于防治海水鱼类的寄生虫感染，完全能满足实际生产的需要。文档编号A61P33/02GK101703766SQ20091019383公开日2010年5月12日申请日期2009年11月10日优先权日2009年11月10日发明者但学明,李安兴,柏建山,王芳华申请人:中山大学