专利名称：绞股蓝核糖体失活蛋白分离方法、产品及其编码基因的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种绞股蓝(Gynostemma pentaphyllum)活性蛋白以及蛋白的编码基因，属生物技术领域，特别相关的领域是生物农药和生物医药领域背景技术根据文献报道，核糖体失活蛋白(ribosome-inactivating proteins，RIP)具有抗肿瘤和抗病毒等医用价值，以及抗植物病毒和病原真菌等农用价值，它是一种多活性的物质，已成为国内外研究的热点；但不同RIP具有各自独特的功能，其中的典型代表是国外从美洲商陆(Phytollaca american)中分离的商陆抗病毒蛋白(pokeweed antiviralprotein，PAP)和国内从栝楼(Trichosanthes kirilowii)中分离的天花粉蛋白(trichosanthin，TCS)。绞股蓝具有抗癌和抗衰老等特殊功效，其中的皂甙和黄酮成分的研究已有大量报道，但有关绞股蓝活性蛋白(下称绞股蓝RIP)分离方法、产品及其RIP的编码基因未见报道。
发明内容
本发明提供一种从绞股蓝中分离的具有药用价值的RIP的方法，RIP及其编码基因，为全面开发绞股蓝的药用价值做出贡献。
1、绞股蓝RIP的分离方法建立了一套以蓝色染料假配基Cibacron Blue 3GA亲和层析为主，结合硫酸铵分级沉淀和阳离子交换层析的快速分离纯化体系。
工艺流程为试剂配制浸提缓冲液含0.14M NaCl的5mM PBS，pH7.4亲和缓冲液20mM Tris-HCl，pH7.5离子交换缓冲液10mM PBS，pH6.5取样、冼净、凉干、破碎，加浸提缓冲液，在4℃下放置1d→过滤、离心得浸提液→缓慢加入NH4SO4固体使溶液的NH4SO4最终饱和度达60％，在4℃下过夜，10000rpm离心10min得上清→再加入NH4SO4固体使溶液的NH4SO4最终饱和度达70％，4℃下过夜，10000rpm离心10min得沉淀→溶于蒸馏水中，对蒸馏水透析至无SO2-4，再对亲和缓冲液充分平衡透析，离心10min得上清→过亲和层析柱(Blue Sepharose 6 Fast Flow)→大量亲和缓冲液充分洗脱至A280＜0.02→0.4M NaCl亲和缓冲液洗脱→测定A280，收集有明显A280吸收值的洗脱液→在离子交换缓冲液中充分透析，高速离心，得上清→过阳离子交换柱(离子交换CM Sepharose Fast Flow)→用离子交换缓冲液洗脱至A280＜0.02→0～0.3M NaCl梯度洗脱，1ml/min，3ml/管→测定A280，收集高抗TMV活性的洗脱峰→透析浓缩，得纯化RIP。
2、绞股蓝RIP的特性及功能特性分子量约为27 kDa，其N-端19个氨基酸序列DINFSLAGADGQTYNTFIA，与其它植物RIP的同源性为10％～73％，与葫芦科RIP的同源性为37％～73％。
编码RIP的氨基酸序列为MRVARFCTVVAILLYFGFHIAECDINFSLAGAGGQTYKTFIAKLRQELSIGTQKVANIAVLKHHVYVVGFLTGTNSYIFKEAPDLAYNKSLLFPGSVRENLSYTGGYDDLERRGAGREDIPLGLLPLDTAITNLFRRDSTSFRRSFIVIIQMVSEAARFKIIEAKIAKNLYGENTFKPDQAIISLENNWGALSKQIQKAQDRGGVFPNLVTLTTSSGKPLIIRNDSDPLVQNGIALLKYMSERSVEYSITDDTVNESNGAFLEIMEIHDLM功能与作用采用半叶法接种试验，测得其抗烟草花叶病毒(TMV)效果为99％；采用MTT法试验，测得其对胃癌细胞MGC803有抑制增殖和细胞毒作用，说明绞股蓝RIP有抗烟草花叶病毒(TMV)，对胃癌细胞MGC803有抑制作用。
绞股蓝RIP编码基因通过其DNA片段克隆、RACE扩增、cDNA克隆和DNA克隆，从绞股蓝中分离了RIP基因，与葫芦科RIP的同源性碱基水平为47％～61％，氨基酸水平为37％～49％。
其基因序列如下ATGAGAGTTGCTAGATTCTGCACTGTTGTTGCTATTCTTCTCTATTTTGGTTTCCATATCGCCGAATGTGACATTAACTTTAGCCTGGCGGGTGCTGGTGGACAGACTTACAAGACCTTCATTGCAAAACTTCGTCAAGAACTCTCCATTGGCACTCAAAAAGTTGCCAATATAGCTGTGTTGAAGCATCACGTTTACGTTGTGGGATTCCTTACCGGTACCAATTCCTATATATTTAAAGAGGCTCCGGATTTAGCATACAACAAGTCTCTACTTTTCCCTGGTTCCGTACGTGAGAATCTTTCATATACGGGAGGTTATGATGATCTCGAAAGACGAGGAGCTGGAAGAGAAGATATTCCTCTTGGACTCTTACCTTTAGACACAGCTATTACTAACTTGTTTCGTAGAGATTCGACGTCTTTTCGCCGCTCATTTATCGTGATCATTCAAATGGTTTCGGAAGCTGCGAGATTCAAAATTATTGAAGCGAAAATTGCTAAAAATCTTTATGGAGAAAACACGTTTAAGCCAGACCAAGCTATCATAAGTTTGGAAAACAACTGGGGTGCTCTCTCTAAGCAAATTCAGAAAGCACAGGATCGTGGAGGAGTGTTTCCGAATCTGGTTACGCTTACAACTTCTTCGGGTAAGCCGCTTATAATAAGAAATGATTCTGATCCATTAGTTCAGAATGGAATCGCATTGTTGAAATACATGAGTGAAAGAAGTGTTGAATATAGTATTACTGATGACACTGTGAACGAAAGCAATGGGGCTTTTCTGGAGATCATGGAGATTCATGATTTGATGTGA上述绞股蓝RIP的分离方法简单，绞股蓝RIP抗TMV和胃癌细胞MGC803效果显著，其基因的克隆可为大规模表达和应用奠定基础。
实施例1试剂配制浸提缓冲液含0.14M NaCl的5mM PBS，pH7.4亲和缓冲液20mM Tris-HCl，pH7.5离子交换缓冲液10mM PBS，pH6.5取样1000g绞股蓝鲜叶、冼净、凉干、破碎，加浸提缓冲液，在4℃下放置1d→过滤、离心得浸提液→缓慢加入NH4SO4固体使溶液的NH4SO4最终饱和度达60％，在4℃下过夜，10000rpm离心10min得上清→再加入NH4SO4固体使溶液的NH4SO4最终饱和度达70％，4℃下过夜，10000rpm离心10min得沉淀→溶于蒸馏水中，对蒸馏水透析至无SO42-，再对亲和缓冲液充分平衡透析，离心10min得上清→过亲和层析柱(Blue Sepharose 6 FastFlow)→大量亲和缓冲液充分洗脱至A280＜0.02→含0.4M NaCl的亲和缓冲液洗脱→测定A280，收集有明显A280吸收值的洗脱液→在离子交换缓冲液中充分透析，高速离心，得上清→过阳离子交换柱(离子交换CM Sepharose Fast Flow)→用离子交换缓冲液洗脱至A280＜0.02→0～0.3M NaCl梯度洗脱，1ml/min，3ml/管→测定A280，收集高抗TMV活性的洗脱峰→透析浓缩，得纯化绞股蓝RIP。
权利要求
1.一种绞股蓝RIP的分离方法，其特征是建立了一套以蓝色染料假配基Cibacron Blue 3GA亲和层析为主，结合硫酸铵分级沉淀和阳离子交换层析的快速分离纯化方法。
2.根据权利要求1所述的一种绞股蓝RIP的分离方法，其特征是工艺流程为试剂配制浸提缓冲液含0.14M NaCl的5mM PBS，pH7.4亲和缓冲液20mM Tris-HCl，pH7.5离子交换缓冲液10mM PBS，pH6.5取样、冼净、凉干、破碎，加浸提缓冲液，在4℃下放置1d→过滤、离心得浸提液→缓慢加入NH4SO4固体使溶液的NH4SO4最终饱和度达60％，在4℃下过夜，10000rpm离心10min得上清→再加入NH4SO4固体使溶液的NH4SO4最终饱和度达70％，4℃下过夜，10000rpm离心10min得沉淀→溶于蒸馏水中，对蒸馏水透析至无SO2-4，再对亲和缓冲液充分平衡透析，离心10min得上清→过亲和层析柱(Blue Sepharose 6 Fast Flow)→大量亲和缓冲液充分洗脱至A280＜0.02→0.4M NaCl亲和缓冲液洗脱→测定A280，收集有明显A280吸收值的洗脱液→在离子交换缓冲液中充分透析，高速离心，得上清→过阳离子交换柱(离子交换CM Sepharose Fast Flow)→用离子交换缓冲液洗脱至A280＜0.02→0～0.3MNaCl梯度洗脱，1ml/min，3ml/管→测定A280，收集高抗TMV活性的洗脱峰→透析浓缩，得纯化RIP。
3.一种绞股蓝RIP，其特征是分子量约为27 kDa，其N-端19个氨基酸序列DINFSLAGADGQTYNTFIA，与其它植物RIP的同源性为10％～73％，与葫芦科RIP的同源性为37％～73％，编码RIP的氨基酸序列如下MRVARFCTVVAILLYFGFHIAECDINFSLAGAGGQTYKTFIAKLRQELSIGTQKVANIAVLKHHVYVVGFLTGTNSYIFKEAPDLAYNKSLLFPGSVRENLSYTGGYDDLERRGAGREDIPLGLLPLDTAITNLFRRDSTSFRRSFIVIIQMVSEAARFKIIEAKIAKNLYGENTFKPDQAIISLENNWGALSKQIQKAQDRGGVFPNLVTLTTSSGKPLIIRNDSDPLVQNGIALLKYMSERSVEYSITDDTVNESNGAFLEIMEIHDLM。
4.一种绞股蓝RIP的编码基因，通过其DNA片段克隆、RACE扩增、cDNA克隆和DNA克隆，从绞股蓝中分离得RIP基因，其特征是与葫芦科RIP的同源性碱基水平为47％～61％，氨基酸水平为37％～49％，基因序列为ATGAGAGTTGCTAGATTCTGCACTGTTGTTGCTATTCTTCTCTATTTTGGTTTCCATATCGCCGAATGTGACATTAACTTTAGCCTGGCGGGTGCTGGTGGACAGACTTACAAGACCTTCATTGCAAAACTTCGTCAAGAACTCTCCATTGGCACTCAAAAAGTTGCCAATATAGCTGTGTTGAAGCATCACGTTTACGTTGTGGGATTCCTTACCGGTACCAATTCCTATATATTTAAAGAGGCTCCGGATTTAGCATACAACAAGTCTCTACTTTTCCCTGGTTCCGTACGTGAGAATCTTTCATATACGGGAGGTTATGATGATCTCGAAAGACGAGGAGCTGGAAGAGAAGATATTCCTCTTGGACTCTTACCTTTAGACACAGCTATTACTAACTTGTTTCGTAGAGATTCGACGTCTTTTCGCCGCTCATTTATCGTGATCATTCAAATGGTTTCGGAAGCTGCGAGATTCAAAATTATTGAAGCGAAAATTGCTAAAAATCTTTATGGAGAAAACACGTTTAAGCCAGACCAAGCTATCATAAGTTTGGAAAACAACTGGGGTGCTCTCTCTAAGCAAATTCAGAAAGCACAGGATCGTGGAGGAGTGTTTCCGAATCTGGTTACGCTTACAACTTCTTCGGGTAAGCCGCTTATAATAAGAAATGATTCTGATCCATTAGTTCAGAATGGAATCGCATTGTTGAAATACATGAGTGAAAGAAGTGTTGAATATAGTATTACTGATGACACTGTGAACGAAAGCAATGGGGCTTTTCTGGAGATCATGGAGATTCATGATTTGATGTGA。
全文摘要
本发明涉及一种绞股蓝核糖体失活蛋白(RIP)的分离方法、产品及其RIP编码基因，属生物技术领域；建立了以蓝色染料假配基Cibacron Blue 3GA亲和层析为主，结合硫酸铵分级沉淀和阳离子交换层析的快速分离纯化体系；RIP的分子量约为27kDa，其N－端19个氨基酸序列DINFSLAGADGQTYNTFIA，与其它植物RIP的同源性为10％～73％，与葫芦科RIP的同源性为37％～73％；RIP的抗烟草花叶病毒效果为99％，对胃癌细胞有抑制作用；RIP的编码基因与葫芦科RIP的同源性碱基水平为47％～61％，氨基酸水平为37％～49％；有较为广泛的医用和农用价值。
文档编号C07K14/415GK1482138SQ0314402
公开日2004年3月17日 申请日期2003年7月26日 优先权日2003年7月26日
发明者林奇英, 林毅, 吴祖建, 谢联辉 申请人:福建农林大学, 福州腾龙生物有限公司