专利名称：大熊猫核糖体蛋白亚基基因RPL23a重组蛋白及其在制备抗癌药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及大熊猫核糖体蛋白亚基基因RPL23a重组蛋白及其在制备抗癌药物中的应用，属于生物技术领域。
背景技术：
哺乳动物的核糖体是由4种RNA和大约80个不同的蛋白质组成，其中核糖体蛋白的命名与蛋白在核糖体的大小亚基有关，小亚基核糖体蛋白命名为Sl至S31，大亚基核糖体蛋白命名为Ll至LA4。RPL23a蛋白是60s核糖体蛋白的组成部分，由rpl23a基因编码。目前，rpl23a基因在人类及部分动植物中的研究有报道，大熊猫的核糖体蛋白亚基S7、S12、S15、S20、S24、S28以及LSM3等基因的克隆与分析也有报道(罗晓燕等，2008 ；杜玉杰等，2009 ；郝彦泽等，2009 ；侯怡铃等，2009 ；张田等，2009 ；Hou W R et al.，2009 ；Zhang etal.，2009)，而大熊猫rpl23a基因及其RPL23a蛋白在国内外尚未见报道。尤其是大熊猫核糖体蛋白亚基基因RPL23a重组蛋白的抗癌功能在国内外更无任何报道。大熊猫是我国特有珍稀物种，属国家一级保护动物，它具有极高的生态、科研、经济、文化和美学价值。国内外学者从不同角度和领域对大熊猫进行了大量的研究。目前，大熊猫功能基因的研究在国内外已成为研究的热点(汪晓晶等，2002;侯万儒等，2007 ；Hou WR et al.，2007 ；Hou Y L et al.，2009 ；Qiao et al.，2009 ；Xu et al.，2009 ；Wan et al.，2009 ；Tao et al.，2010)。
发明内容
本发明根据人(Homosapiens)、牛(Bos Taurus)、野猪(Sus scrofa)、、小家鼠(Mus mUSCUlUS)4个哺乳动物物种已知的序列设计引物，以大熊猫骨骼肌为材料，运用RT-PCR和PCR技术分别对大熊猫rpl23a基因的表达序列进行了扩增，克隆和测序；对其序列进行比较、分析，并且构建了含有rpl23acDNA的重组表达载体，转化进入E. coliBL21进行超表达；对超表达产物进行纯化获得大熊猫核糖体蛋白亚基基因RPL23a重组蛋白；用大熊猫核糖体蛋白亚基基因RPL23a重组蛋白作用于H印-2细胞，观察其大熊猫核糖体蛋白亚基基因RPL23a重组蛋白对H印-2细胞生长抑制效应，旨在揭示大熊猫核糖体蛋白亚基基因RPL23a重组蛋白的抗癌功能，为抗癌蛋白药物的研发与抗癌机理的研究提供科学基础和资源。
图1大熊猫核糖体蛋白亚基基因RPL23a重组蛋白对H印-2细胞生长的影响；(1-8 分别为 0，7. 4，2. 96,1.48,0. 74，0. 37，0. 185,0. 148 μ g/mL 大熊猫核糖体蛋白亚基基因RPL23a重组蛋白浓度)；图2大熊猫核糖体蛋白亚基基因RPL23a重组蛋白对H印-2细胞的形态影响；(1-8 分别为 0,7. 4,2. 96，1. 48，0. 74，0. 37，0. 185,0. 148 μ g/mL 大熊猫核糖体蛋白亚基基因RPL23a重组蛋白浓度)。
具体实施例方式以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。1. 1材料和方法1. 1. 1材料及试剂大熊猫骨骼肌组织取自四川卧龙中国保护大熊猫研究中心死亡的大熊猫，为防止RNA降解，所取组织立即冻存于液氮中；人喉癌!fep-2细胞(购于川北医学院生化与分子免疫研究所)。总 RNA 抽提试剂盒 Total Tissue/cell RNA Extractiob Kits 购自 Waton公司；逆转录试剂盒Reverse Transcription System购自Promega公司；胶回收试剂盒购自OMEGA公司；T载体试剂盒(PMD-18T Vector Systems)及限制性内切酶Sma I，Pst I，SeaILEcoR I和Ml I均购自宝生物(大连)有限公司；Taqplus聚合酶购自上海生物工程公司，其他试剂均为国产分析纯。宿主菌E. coli Dffia由四川省野生动植物保护与利用重点实验室保存。CW0009 Ni-Agarose His标签蛋白纯化试剂盒购自北京易莱西诺生物科技有限公司；Bradford蛋白浓度测定试剂盒(Mbchem M2031)购自上海美季生物技术有限公司；RPMI1640粉末购于Gibco公司(美国)，胎牛血清购于四季青生物制品公司，双抗(青霉素，链霉素，购于Gibco公司)。1.1. 2 方法1. 1. 2. 1 总 RNA 的提取取600mg左右的样品组织，液氮中充分研磨，按照抽提试剂盒说明书推荐的方法提取总RNA。将所提总RNA溶于经DEPC处理过的水中，于_70°C保存备用。1. 1. 2. 2 引物设计及 RT-PCR从GenBank 数据库中检索到人(NM_000984)、牛(ΝΜ_001045958)、野猪(AK233511)、小家鼠(NM_207523)4个哺乳动物物种RPL23a基因的编码区序列的相关信息，根据编码序列的保守性，利用I^rimer Premier 5. O软件设计上、下游引物(分别为Pd-RPL23a-F,Pd-RPL23a-R)由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，所设计引物编号及序列如下Pd-RPL23a-F 5' -CCTTTTCGAC AAGATGGCGC-3‘ (SEQ ID NO 1)Pd-RPL23a-R 5' -GAATTAGCCA GCTGGACTCA-3‘ (SEQ ID NO 2)以肌肉总RNA为模板，Oiligo (dT)为反转录引物，按逆转录试剂盒操作手册进行cDNA第1链的合成，反应总体积20 μ L，其中含总RNA lug, dNTPs ImM, MgCl25mM,0iligo(dT)15 0. 5 μ g，AMV 反转录酶 15U，RNA 酶抑制剂 IOU/μ L0 反转录条件:42°C 60min ；再以适量第1链产物为模板，采用25μ L PCR反应体系进行PCR扩增，各成分浓度为=MgCl21. 5Mm, dNTP 0. 2mM, Pd-RPL23a_F 和 Pd-RPL23a_R 各 0. 3 μ M，Taq plus 聚合酶 5U。反应条件94°C 5min，94°C lmin，52°C 0. 5min，72°C 1. 5min，32 个循环；72°C IOmin0 然后用质量分数为1 %的琼脂糖凝胶电泳检测RT-PCR产物，并于_20°C保存。1. 1. 2. 3cDNA的克隆及鉴定对PCR产物进行回收纯化，用Sma I限制性内切酶酶切并平端化质粒pUC18片段，将回收产物与酶切并平端化后的质粒片段连接，22°C连接过夜。按常规方法转化感受态细胞，再涂于含氨苄青霉素、IPTG及x-gal的LB培养基上过夜培养，用接种针挑取5个白色菌落，碱裂解法提取质粒，采用双酶切(Pst I和ka II)和PCR这2种方法对重组质粒进行鉴定。经鉴定的阳性重组质粒由北京华大生物科技发展有限公司测序。1.1. 2. 4 数据处理采用Genescan (http://genes, mit. edu/GENSCAN. html)软件，对所克隆的基因序列进行氨基酸序列推定；采用ORF finder软件(http //www. ncbi. nlm. gov/gorf. htlm)进行DNA序列的ORF查找；1. 1. 2. 5RPL23a cDNA 表达片段的克隆1. 1. 2. 5. 1引物的设计分别在RPL23a的正向引物和反向引物中引入限制性内切酶EcoR I识别位点(GAATTC)和Ml I识别位点(GTCGAC)。所设计的上、下游引物编号及序列如下RPL23abd-F 5，-CAGAATTCATGGCGCCGAAG C_3，(EcoRI) (SEQ ID NO 3)RPL23a bd-R 5，~CGGTCGACTTAGATGATCCCA~3’ (Sail) (SEQ ID NO :4)引物由上海生工生物技术有限公司合成。1. 1. 2. 5. 2PCR 扩增以连接cDNA的重组质粒为模板，用新合成的含有酶切位点的引物RPL23abd_F和RPL23a bd_R进行PCR扩增反应，反应体系如前所述，反应条件为94°C 2min ；94°C 30s,55°C 45s, 72°C lmin,35个循环；72°C 7min, PCR结束后，然后用1. 0%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物并割胶回收目的DNA片段。1. 1. 2. 6RPL23a基因融合表达载体的构建1. 1. 2. 6. lRPL23a基因融合表达片段的获得反应体系为40ul 双酶切目的 DNA片段 IOul，IOxK buffer 4. Oul,EcoR I 1. Oul,Sal I 1.0ul,ddH20 Mul。反应条件37°C过夜充分酶切；酶切后65°C水浴lOmin，冰水浴l-2min ；4°C，12000g，离心Imin ；1. 0%琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物，回收酶切表达片段，回收产物于_20°C保存备用。1. 1. 2. 6. 2 表达载体 pET_28a 的处理1. 1. 2. 6. 2. 1 小量制备 pET_28a 载体利用碱裂解法小量从DH5 α中提取pET_28a质粒，小提质粒的具体步骤如下1. 5ml (750ul X 2)菌液，12000g, 4°C 2min离心，去上清，再瞬时离心，彻底去上清；加入裂解液buffer I 133ul，用枪头吹散，混勻；加入13!3ul 2% SDS, 133ul 0.4MNa0H，颠倒混勻5次(现用现混合)；加入bufferIII 200ul颠倒混勻，冰水浴5min ；取出，12000g4°C，9min离心，将上清转移到新的EP管；12000g，4°C，5min离心，将上清转移新的EP管中；加入2倍体积的无水乙醇(SOOul)，颠倒混勻；放入冰箱(_20°C )，半小时左右(时间可长一些或过夜)；取出12000g，4°C，离心9min，去上清；加入70% C2H5OH IOOOul，12000g，离心3min ；加入70% C2H5OH lOOOul，12000g，离心;3min，用枪头吸净上清(可瞬时离心再吸)；放入超净工作台风干(15min)；用ddH20(20-25ul)溶解，_20°C保存备用。1. 1. 2. 6. 2. 2 表达载体 pET-28a 的准备表达载体的消化反应体系为40ul :pET-28a表达载体IOul，IOxK buffer 4. Oul，EcoR I 1. Oul, Sal I 1. Oul, ddH20 Mul。反应条件37°C过夜充分酶切，取出65°C水浴lOmin，冰水浴l-anin，4°C，12000g，离心Imin用1. 0%琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物，回收酶切表达片段，回收产物于-20°C保存备用。1. 1. 2. 7目的基因与表达载体的连接与转化连接反应体系为20ul :RPL23a酶切片段2ul，IOxligase buffer 2ul，酶切表达载# pET-28a 3ul，T4 连接酶 lul，ddH20 12ul. Total 20ul。反应条件16°C保温过夜，65°C保温lOmin，终止反应。转化感受态细胞Dffia，转化后的细胞悬液铺于LB平板上[含有X-gal (40ug/mL)，IpTG (25ug/mL)和 Amp (100ug/mL) ]，37°C恒温箱培养过夜。1. 1. 2. 7. 1重组子的筛选及重组质粒制备随机挑取5个单菌落(带有转化产物的平板)分别进行PCR和酶切鉴定，以保证筛选的可靠性；同时于5ml/50ml的尖底离心管中，37°C液体培养16h，碱裂解法提取重组质粒，0.8%琼脂糖电泳检测。1. 1. 2. 7. 2pET-RPL23a重组载体在大肠杆菌中的诱导表达1. 1. 2. 7. 3 转化将重组质粒转化入表达菌株BL21 (DE3)，具体操作同1. 1. 2. 3。1. 1. 2. 7. 4诱导表达载体常用的诱导表达方法有温度诱导和药物诱导，本实验采用IPTG(异丙基硫代-β -D-半乳糖苷，isopropyl-b-D-thiogalactopyranoside)诱导外源基因表达，具体操作步骤将菌液转入100ml LB培养基+Kan(80ul/100ml)中，37°C，培养至0D_ = 0. 5-0. 6，收集Iml菌液做为对照；加入最适诱导浓度的诱导剂IPTG 50ul，使其终浓度位0. 2g/L ；诱导培养4h时各收集菌液，为纯化做准备。1. 1. 2. 8大熊猫核糖体蛋白亚基基因RPL23a重组蛋白的纯化1. 1. 2. 8. 1组装层析柱将填料混勻后加入层析柱，室温静止10分钟，待凝胶与溶液分层后，让乙醇通过重力作用缓慢流出。向装填好的柱中加入5倍柱床体积的去离子水将乙醇冲洗干净后，再用8倍柱体积的Binding Buffer平衡柱子，平衡结束后即可上样。1. 1.2. 8. 2蛋白的纯化收集菌体后，每IOOmg菌体(湿重)加入l_5ml细菌裂解液，超声裂解菌体。离心，弃上清，将沉淀重悬于Soluble Binding Buffer中。冰浴1小时，使包涵体溶解。10，000 X g离心20分钟，将上清以孔径为0.45μπι的滤膜过滤。将蛋白溶液负载上柱，流速为10倍柱体积/小时。使用15倍柱体积的hclusion Body Binding Buffer冲洗柱子，收集流穿峰。使用5倍柱体积的hclusion Body Elution Buffer洗脱，收集洗脱峰。合并洗脱液，DS-PAGE检测大熊猫核糖体蛋白亚基基因RPL23a重组蛋白的纯度。用Bradford蛋白浓度测定试剂盒(Mbchem M2031)测定重组蛋白的浓度。1. 1.2.9 细胞培养人喉癌H印-2细胞株用含有10 %的灭活的胎牛血清(f etalbovine serum,FBS) 100U/ml 青霉素、100 μ g/ml 链霉素、pH7. 4 的 RPMI-1640 完全培养液于 37°C、5% CO2 培养箱中进行培养。1. 1. 2. 9. IMTT法检测细胞活性
取对数生长期的细胞，用胰蛋白酶消化后将细胞数调整到1 X IO5个/mL，接种于 96孔板，每孔细胞液量为200 μ L，放入(X)2培养箱内，于37°C ,5% CO2及饱和湿度的条件下孵育至细胞单层铺满孔底(96孔平底板)，然后加入大熊猫核糖体蛋白亚基RPL23a重组蛋白使其终浓度分别为0,7. 4,2. 96、1. 48,0. 74,0. 37,0. 185,0. 148 μ g/mL,每个浓度设6个重复孔，空白组为不含细胞的RPMI1640培养液，放入(X)2培养箱内培养24h后取出96孔板，加入MTT(5mg/mL)溶液10 μ L，继续培养4h后，然后加入150 μ L的二甲基亚砜(DMSO) 振荡lOmin，待蓝紫色结晶完全溶解后，用酶标仪在在490am的波长下测定各孔的吸光度 (OD)值，计算不同浓度下大熊猫核糖体蛋白亚基RPL23a重组蛋白作用Hep_G2细胞的抑制率(％ )，公式如下细胞生长抑制率=(1-A实验组/A对照组)X100% ·1. 1. 2. 9. 2形态学观察将96孔板放在倒置显微镜下观察，拍照记录不同浓度下细胞的形态变化。2 结果2. 1大熊猫核糖体蛋白亚基RPL23a基因的cDNA序列及编码的氨基酸序列将所得到的RT-PCR扩增产物用的琼脂糖凝胶进行电泳，可见1条500bp左右的清晰的特异性扩增条带。重组质粒测序结果显示，所得序列长度为506bp (SEQ ID NO 5))。在NCB I数据库中利用Blast检索软件，进行基因同源性检索，结果发现该序列与人和其他动物RPL23a基因的cDNA序列同源性很高，这证明所克隆的序列为大熊猫RPL23acDNA 序列。该序列的ORF为471bp，起始密码子为ATG，终止密码子为码子TAA.编码156个氨基酸残基(SEQ ID NO :6)，预测大熊猫核糖体蛋白亚基RPL23a的分子量为17. 72KDa，等电点为 10. 44.2. 2大熊猫核糖体蛋白亚基基因RPL23a重组蛋白获得的大熊猫核糖体蛋白亚基基因RPL23a重组蛋白的序列(190个氨基酸残基)， (SEQ ID NO 7)。该重组蛋白的分子量为21. 265KDa ；等电点为10. 57 ；2. 3大熊猫核糖体蛋白亚基基因RPL23a重组蛋白对H印_2细胞生长的影响采用MTT法检测不同浓度的大熊猫核糖体蛋白亚基基因RPL23a重组蛋白在24h 下对H印-2细胞生长活性的影响。从图1可以看出，大熊猫核糖体蛋白亚基基因RPL23a重组蛋白对Hep-2细胞的生长抑制率具有时间和剂量的依赖性。发现在低浓度下的效果优于高浓度下的效果，其中浓度为0. 185 μ g/ml时大熊猫核糖体蛋白亚基基因RPL23a重组蛋白对!fep-2细胞的生长抑制率最好，可以达到36. 31% (见图1)。2. 4大熊猫核糖体蛋白亚基基因RPL23a重组蛋白对H印_2细胞形态的影响用倒置显微镜观察不同浓度大熊猫核糖体蛋白亚基基因RPL23a重组蛋白(0， 7. 4，2. 96，1. 48，0. 74，0. 37，0. 185，0. 148 μ g/mL)处理 24h 的 H印_2 细胞形态变化(图 2)。 从图2可以看到，在Mh的处理时间下，与对照组相比，随着大熊猫核糖体蛋白亚基基因 RPL23a重组蛋白浓度的降低，细胞出现变圆，细胞内颗粒增多，细胞成团，脱落甚至裂解成碎片的现象(图2)，其中浓度为0. 185 μ g/ml时大熊猫核糖体蛋白亚基基因RPL23a重组蛋白对Hep-2细胞的形态影响最大。应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换， 而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
权利要求
1.大熊猫核糖体蛋白亚基基因RPL23a重组蛋白，该重组蛋白的氨基酸序列由SEQIDNO 7所定义。
2.根据权利要求1所述的大熊猫核糖体蛋白亚基基因RPL23a重组蛋白在制备抗癌药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了大熊猫核糖体蛋白亚基基因RPL23a重组蛋白及其在制备抗癌药物中的应用，该重组蛋白的氨基酸序列由SEQ ID NO7所定义。用大熊猫核糖体蛋白亚基基因RPL23a重组蛋白作用于Hep-2细胞，观察其大熊猫核糖体蛋白亚基基因RPL23a重组蛋白对Hep-2细胞生长抑制效应，旨在揭示大熊猫核糖体蛋白亚基基因RPL23a重组蛋白的抗癌功能，为抗癌蛋白药物的研发与抗癌机理的研究提供科学基础和资源。
文档编号C07K14/47GK102558333SQ20111036937
公开日2012年7月11日 申请日期2011年11月21日 优先权日2011年11月21日
发明者丁祥, 伍春莲, 侯万儒, 侯怡铃, 孙冰, 李俊, 王婷, 苏秀兰 申请人:西华师范大学