专利名称：二次结晶的超纯天花粉蛋白的制备和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及有机化学领域，特别是涉及到生物化学领域中二次结晶的超纯天花粉蛋白的制备和应用。
在本发明中，天花粉蛋白是指从栝蒌属植物栝蒌的块根——天花粉(中药)采用有机试剂沉淀或盐沉淀等方法提取出的一种核糖体失活蛋白。研究表明，天花粉蛋白是一种单链核糖体失活蛋白，具有RNA N-糖苷酶活性、引产蛋白活性、抗肿瘤抗病毒特别是抗艾滋病毒活性。该蛋白是寡聚的单肽链的简单蛋白。
二次丙酮沉淀所得到的粗制天花粉蛋白，经二次CM-葡聚糖凝胶C-25分离得到层析天花粉蛋白，但分离周期长且易变性(汪猷主编，天花粉蛋白(第二版)P24)。粗制天花粉蛋白的冻干粉可以在巴比妥缓冲液或柠檬酸缓冲液中结晶，结晶天花粉蛋白已获得高分辩率结果(潘克桢、林玉娟、周康靖、傅珠玑、陈明晃，Pure & Appl.Chem.1994，66(1)，57-64；周康靖、傅珠玑、陈明晃等，PROTEINSStruct Funct.Genet.1994，19(1)4-13)。同时从天花粉块根中，Sylvia et at又分离到TAP29(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.1991，88 6570-6574)和金善炜等又分离到Trichobitacin(Chinese J.chemistry.1997，15(2)160-168)。
本发明的目的，就是首先优化了天花粉蛋白的结晶条件，获得一次结晶天花粉蛋白，结晶天花粉蛋白再经离子交换结合亲和色谱方法，可以纯化到二个以上单组分的更高纯度的结晶天花粉蛋白，而这二个组分又可以分别结晶得到二次结晶的超纯天花粉蛋白。
在本发明中，天花粉蛋白的一次结晶是指提纯的天花粉蛋白在醋酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、磷酸缓冲液、巴比妥缓冲液中，以NaCl、NaNO3、KCl、朽檬酸钠等为沉淀剂而获得的结晶天花粉蛋白。
在本发明中，一次结晶的天花粉蛋白经溶解后，经SP-琼脂糖、S-琼脂糖、CM-琼脂糖、CM-纤维素等阳离子交换介质和Blue、Red染料亲和介质的层析分离，可以分离到二个以上单组分更高纯度的结晶天花粉蛋白。
在本发明中，上述二种单组分更高纯度的结晶天花粉蛋白，在醋酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、磷酸缓冲液、巴比妥缓冲液中，以NaCl、NaNO3、KCl、柠檬酸钠等为沉淀剂，可以获得二次结晶的超纯天花粉蛋白。
使用本发明的纯化和结晶技术，可以从括蒌块根(天花粉)中分离出二种以上单组分二次结晶的超纯天花粉蛋白制剂。
本发明的二次结晶的超纯天花粉蛋白具有结晶天花粉的各项生物学活性，在引产、治疗肿瘤及艾滋病方面具有潜在的应用价值，同时，由于纯度更高，可以减轻或消除天花粉蛋白在临床试验和应用中的副作用。
本发明与现有技术相比，具有以下积极效果1.本发明是在结晶天花粉蛋白的工作基础上，经温和离子交换结合亲和层析，分离到二种以上更高纯度的单组分的结晶天花粉蛋白。并在此基础上，采用结晶技术，可以获得这二种单组分的二次结晶的超纯天花粉蛋白；2.二种单组分的二次结晶的超纯天花粉蛋白已分别培养出大单晶，可以深入开展X-射线分析和结构分析工作，可以探讨这二个组分的细微差别——包括个别氨基酸残基的胺酰化或脱胺酰等作用；3.活性蛋白能够获得二次结晶，增加了活性蛋白的稳定性。并且可以选择适当的缓冲液和盐类型，以利于应用。
附图
是结晶天花粉蛋白的层析洗脱图。
下面结合附图通过实施例来进一步描述本发明实施例1.结晶天花粉蛋白的制备一定量的丙酮沉淀的天花粉蛋白冻干粉，溶于双蒸馏水中，加入0.01～0.1M柠檬酸缓冲液(含0.5～2M的NaCl或KCl)，静置，结晶天花粉蛋白就会以晶体形式沉淀析出。
实验例2.更高纯度的二个组分的结晶天花粉蛋白的制备将例1得到的结晶天花粉蛋白，用饱和NaCl洗净后，用稀醋酸或稀盐酸溶解，加蒸馏水到20ml，加到经缓冲液平衡的离子交换结合亲和层析柱上，用NaCl梯度洗脱，分离出二个峰，即为二个单组分的更高纯度的结晶天花粉蛋白(见附图)。
实施例3将例2获得的二个单组分的更高纯度的结晶天花粉蛋白收集液，在0.01～0.2M磷酸盐缓冲液(含0.5～2M的NaCl或KCl)，用悬滴法、坐滴法、自由界面扩散法，可以培养出该二个单组分的二次结晶的超纯天花粉蛋白晶体。
实施例4将例3获得的单组分1的蛋白质单晶，在四园衍射仪上以铜靶衍射，测得的晶体学参数为P212121晶型，a＝38.6，b＝76.7，c＝79.7，α＝β＝γ＝90°，与文献(周康靖、傅珠玑、陈明晃等，PROTEINSStruct.Funct.Genet.1994，19(1)，4-13)所报道的天花粉蛋白晶体学参数相当。
实施例5从悬滴法培养的天花粉蛋白(一次)的晶体(例2)中，挑选2颗线度大于1mm的大单晶，加蒸馏水洗后，用少量稀HCl溶解，配成结晶天花粉蛋白溶液，在HPLC上(SP15HR柱，美国Waters公司产品)，以0.02mol/L，pH6.5磷酸盐缓冲液为洗脱液，0～0.5mol/L NaCl进行线性梯度洗脱，流速1ml/min，时间40min，280nM检测，结晶天花粉蛋白溶液在保留时间(RT)22.5’，24.1’，出现二个峰，二个峰面积比为1∶9，与例2的相同。
权利要求
1.一种二次结晶的超纯天花粉蛋白的制备，该超纯天花粉蛋白是从结晶天花粉蛋白制备出来的，其特征在于，该制备方法包括下列步骤(1).结晶天花粉蛋白是从葫芦科植物栝蒌的块根——天花粉的汁中经有机试剂沉淀或盐沉淀后制成的冻干粉，在醋酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、磷酸缓冲液、巴比妥缓冲液中，以NaCl、NaNO3、KCl或朽檬酸钠为沉淀剂而获得的晶体；(2).将(1)所得的结晶天花粉蛋白溶解后，经SP-琼脂糖、S-琼脂糖、CM-琼脂糖或纤维素等阳离子交换介质和Blue、Red染料亲和介质层析，可以分离到二种以上单组分更高纯度的结晶天花粉蛋白；(3).将(2)所得的二种以上单组分更高纯度的结晶天花粉蛋白，在醋酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、磷酸缓冲液、巴比妥缓冲液中，以NaCl、NaNO3、KCl或柠檬酸钠为沉淀剂，可以获得二次结晶的超纯的天花粉蛋白；(4).将(3)所得的二次结晶的超纯天花粉蛋白，可以选择上述某种适当的缓冲液系统和盐类型获得结晶，更适合于应用。
2.一种权利要求1的二次结晶的超纯天花粉蛋白的应用，其特征在于，该蛋白作为药物原料应用于引产、治疗肿瘤和艾滋病方面。
全文摘要
一种二次结晶的超纯天花粉蛋白的制备和应用，涉及到生物化学领域，它是从结晶天花粉蛋白制备出来的。结晶天花粉蛋白经阳离子交换层析或亲和层析可以纯化为二种以上单组分的更高纯度的结晶天花粉蛋白。每一单组分的更高纯度的结晶天花粉蛋白又可经结晶纯化为二次结晶的超纯天花粉蛋白。因为超纯天花粉蛋白稳定性好、纯度高，所以它作为药物原料在引产、治疗肿瘤和艾滋病方面具有更大的应用价值。
文档编号C07K1/14GK1424323SQ0114323
公开日2003年6月18日 申请日期2001年12月14日 优先权日2001年12月14日
发明者陈明晃, 王梓壬, 叶晓明 申请人:中国科学院福建物质结构研究所