抗炎蛋白和肽以及它们的制备方法和用图
【专利说明】
[0001] 相关申请
[0002] 本申请要求于2012年6月22日提交的新西兰临时申请NZ600847的权益，通过 引用将其整体并入本文。
技术领域
[0003] 本公开内容涉及抗炎蛋白和肽，它们的用途，以及它们的检测方法。
[0004] 发明背景
[0005] 由于其多种健康益处，蜂蜜已被世界文明使用了几个世纪。蜂蜜的两种最重要 的健康益处是其抗菌性和抗炎性。麦卢卡蜂蜜由从新西兰和南澳洲的原生植物麦卢卡树 (Leptospermumscoparium)采集花蜜的蜜蜂产生，其已被确定为是表现出特别有效的抗 菌性和抗炎性的多种蜂蜜。松红梅蜂蜜（JellyBushhoney)由从澳洲的原生植物澳洲茶 (Leptospermumpolygalifolium)采集花蜜的蜜蜂产生，其已被确定为是表现出特别有效 的抗菌性和抗炎性的多种蜂蜜。
[0006] 最近，据发现，化学物质甲基乙二醛（MG0,也称为2-氧代丙醛和丙酮醛）是薄子 木属（Leptospermum)来源的蜂蜜（如麦卢卡蜂蜜和松红梅蜂蜜）的抗菌活性的组要成分。 麦卢卡蜂蜜和松红梅蜂蜜样品含有较高浓度的MG0,并且相比含具有较低浓度的MG0的蜂 蜜样品具有更高量的抗菌活性。据信，MG0能赋予蜂蜜抗菌性，因为MG0是高化学反应性化 合物，并且MG0可容易地与细胞分子反应。MG0与细菌中的细胞分子之间的化学反应破坏细 菌的对于其生存力重要的分子。以此方式，MG0作为抗菌剂发挥功能。
[0007] 蜂蜜中存在高水平的MG0是区分麦卢卡蜂蜜及松红梅蜂蜜与其他多种蜂蜜的特 征。虽然大多数种类的蜂蜜表现出一些抗菌活性，但是大多数种类的蜂蜜中的抗菌活性主 要是由于蜂蜜中存在过氧化氢而导致的。与之不同的是，薄木子属来源的蜂蜜主要是由于 蜂蜜中存在MG0而表现出抗菌活性。
[0008] 在2004年，Kohnoet等在细胞因子水平检查了蜂王浆的抗炎效果或作用。结果显 示，蜂王浆具有通过抑制活化的巨噬细胞的促炎性细胞因子（如TNF-a、IL-6和IL-1)产 生而得到的抗炎作用。该研究还显示，来自蜂王浆提取物的活性级份或组分的大小为5kDa 至30kDa。因此，大多数蜂蜜由于蜂蜜中存在的蜂王浆蛋白而具有弱抗炎效果。
[0009] 虽然已经阐明了麦卢卡蜂蜜的抗菌活性的多种作用机制，但是麦卢卡蜂蜜作为抗 炎剂发挥功能的机制仍然是未知的。由于现有的许多抗炎剂具有许多使用缺陷，需要开发 基于蜂蜜的抗炎剂。例如，非甾体抗炎药（NSAID)形式的C0X-2抑制剂可增加患者的心脏 病和中风风险，并且阿司匹林可增加胃肠出血的风险。此外，据报道，皮质类留醇抑制上皮 细胞的生长，并且据报道，NSAID具有细胞毒性，因此这两类抗炎剂都不适合用于伤口护理。 与现有药物相比，由蜂蜜衍生的抗炎剂可在一个或多个区域具有更小的毒副作用，并且还 可提供与现有抗炎药物不同的可能用途。
[0010] 共同待决申请PCT/NZ/2011/000271中描述了来自麦卢卡蜂蜜的约55kDa至75kDa 的经修饰的王楽主蛋白（apalbumin)，其产生自麦卢卡蜂蜜中发现的高水平的甲基乙二醒。 本发明人已鉴定，经修饰的王浆主蛋白或蜂王浆主蛋白比未经修饰的王浆主蛋白或蜂王浆 主蛋白具有显著更高的抗炎性。
[0011] 发明概述
[0012] 本文描述了王楽主蛋白（apalbumin,也被称为蜂王楽主蛋白）及其功能片段，其 具有经甲基乙二醛（MG0)化学修饰的至少一个赖氨酸或精氨酸并且表现出增强的抗炎效 果王浆主蛋白。
[0013] 本发明的第一方面提供了减少细胞组织炎症的方法，其包括使所述细胞组织与蜂 王浆主蛋白（MRJP)的功能片段接触的步骤；其中所述功能片段已被分离、富集、合成或重 组制备；其中所述功能片段包含所述蛋白C端最后20个氨基酸中的2-20个氨基酸；并且 其中所述功能片段的赖氨酸残基已被甲基乙二醛（MG0)化学修饰。在一个实施方案中，所 述蜂王浆主蛋白（MRJP)选自MRJP1(SEQIDN0:1)、MRJP2(SEQIDN0:2)、MRJP3(SEQID N0:3),MRJP4(SEQIDNO: 4),MRJP5(SEQIDNO: 5),MRJP6(SEQIDNO: 6),MRJP7(SEQID N0:7)、MRJP8(SEQIDN0:8)和MRJP9(SEQIDN0:9)。
[0014] 本发明的另一方面提供了减少细胞组织炎症的方法，其包括使所述细胞组织与蜂 王浆主蛋白（MRJP)的功能片段接触的步骤；其中所述功能片段已被分离、富集、合成或重 组制备；其中所述功能片段包含选自以下的氨基酸序列：LVK(SEQIDN0:84)、LIR(SEQID N0:86)、FDR(SEQIDN0:127)、HNIR(SEQIDN0:128)、FTK(SEQIDN0:130)和QNGNK(SEQ IDNO: 137);并且其中所述功能片段的赖氨酸或精氨酸残基已被甲基乙二醛（MGO)化学修 饰。在一个实施方案中，所述炎症与以下的一项或多项有关：炎性疾病、心血管疾病、神经障 碍疾病、肺病、增殖性疾病、感染性疾病或相关综合症、过敏性疾病、免疫疾病或自身免疫性 疾病以及与伤口有关的炎症。
[0015] 在另外的方面，提供了抑制细胞组织中的组织蛋白酶B活性的方法，其包括使所 述细胞组织与蜂王浆主蛋白（MRJP)的功能片段接触的步骤；其中所述功能片段已被分 离、富集、合成或重组制备；其中所述功能片段包含选自以下的氨基酸序列：LVK(SEQID N0:84)、LIR(SEQIDN0:86)、FDR(SEQIDN0:127)、HNIR(SEQIDN0:128)、FTK(SEQID NO: 130)和QNGNK(SEQIDNO: 137);并且其中所述功能片段的赖氨酸或精氨酸残基已经被 甲基乙二醛（MG0)化学修饰。
[0016] 在另外的方面，提供了分离的蜂王浆主蛋白（MRJP)的功能片段，其中所述功能片 段包含选自以下的氨基酸序列：
【主权项】
1. 减少细胞组织炎症的方法，其包括使所述细胞组织与蜂王浆主蛋白（MRJP)的功能 片段接触的步骤；其中所述功能片段已被分离、富集、合成或重组制备；其中所述功能片段 包含所述蛋白C端最后20个氨基酸中的2-20个氨基酸；并且其中所述功能片段的赖氨酸 残基已被甲基己二酵（MGO)化学修饰。
2. 如权利要求1所述的方法，其中所述功能片段包含所述蛋白C端最后10个氨基酸中 的2-10个氨基酸。
3. 如权利要求1或2所述的方法，其中所述蜂王浆主蛋白（MRJP)选自MRJP1 (SEQ ID NO:l). MRJP2(SEQ ID NO: 2). MRJP3 (SEQ ID NO: 3). MRJP4 (SEQ ID NO: 4). MRJP5 (SEQ ID N0:5)、MRJP6(SEQ ID N0:6)、MRJP7(SEQ ID N0:7)、MRJP8(SEQ ID N0:8)和 MRJP9(SEQ ID NO:9)〇
4. 如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述功能片段包含选自W下的氨基酸 序列： i. KISIHL(SEQ ID N0:10); ii. KNNNQNDN(SEQ ID NO: 11)； iii. KLH(SEQ ID NO: 12)； iv. KSNNRHNNND(SEQ ID NO:13)； V. KHNN(SEQ ID NO: 14)； vi. KNQAHLD (沈Q ID NO:巧）； vii. KNTRCISP(SEQ ID N0:16) 及 viii. KTNFFSI化（SEQ ID N0:17)。
5. 如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述功能片段包含选自W下的氨基酸 序列： i. PFKISIHL(SEQ ID N0:64); ii. NQKNNNQNDN(SEQ ID N0:69) ；NQKN(SEQ ID N0:66)； iii. SKLH(SEQ ID N0:71) 及 iv. QNKHNN(SEQ ID N0:81) ;KH(SEQ ID N0:80)。
6. 如权利要求1至3或5中任一项所述的方法，其中所述功能片段是选自W下的肤类 似物： i. Ac-PFKISIHL-〇H(SEQ ID N0:19); ii. Ac-NQKNNNQNDN-〇H(SEQ ID NO:24) ；Ac-NQKN-〇H(SEQ ID NO:27)； iii. Ac-SKLH-〇H(SEQ ID NO:31)； iv. Ac-QNKHNN-〇H(SEQ ID N0:43) 及 Ac-KH-〇H(SEQ ID N0:45)。
7. 减少细胞组织炎症的方法，其包括使所述细胞组织与蜂王浆主蛋白（MRJP)的功 能片段接触的步骤；其中所述功能片段已被分离、富集、合成或重组制备；其中所述功能 片段包含选自W下的氨基酸序列；LVK(SEQ ID N0:84)、LIR(SEQ ID N0:86)、抑R(SEQ ID N0:127)、HNIR(SE