专利名称：端粒酶活性抑制蛋白的制备和纯化的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术和生物化学工程领域。更具体地说，本发明涉及采用基因重组技术制备端粒酶活性抑制蛋白的方法，该方法可以高效地和大规模地制备高纯度和高生物学活性的端粒酶活性抑制蛋白。
背景技术：
端粒酶(Telomerase)是一种合成和延伸细胞染色体端粒的核糖核蛋白，它包含两种基本成分逆转录酶催化亚基hTERT和RNA组分hTR。端粒酶能以自身RNA为模板，反转录合成端粒重复列，加到染色体的末端，以弥补细胞分裂时端粒DNA的丢失，维持端粒的长度。
研究表明，在正常人体细胞内端粒酶活性几乎检测不到，因此，人正常体细胞分裂次数是有限的，细胞每分裂一次，端粒便丢失50-200bp，当端粒缩短到一定程度时细胞生长受到抑制，即称为细胞衰老，并走向死亡。
然而，在绝大多数恶性肿瘤细胞(85％)中普遍可以检测到端粒酶活性且活性较强，端粒酶对端粒的重新合成补偿了它在细胞繁殖过程中的持续丢失，从而使得细胞可以不断的分裂，这是细胞永生化和癌变的一个重要机制。
Kim等分析总结了大量研究结果，检测了100多种恶性肿瘤标本，指出端粒酶诊断肿瘤的敏感性为85％，特异性为91％，阳性预测值为91％，阴性预测值为81％，充分表明端粒酶在肿瘤诊断中的价值(Kim NW，Piatyszek MA，Prowse KR，et al.Specific association of human telomerase activity with immortal cells andcancer.Science.1994 Dec 23；266(5193)2011-5.)。并认为端粒酶被激活是发生恶性肿瘤的主要因素之一，其激活及表达程度与肿瘤的发生和转移密切相关，抑制端粒酶并使端粒缩短被认为是抑制癌细胞的一种机制，因此端粒酶成为肿瘤靶向治疗的理想靶点。
目前，以端粒酶为靶点的肿瘤治疗研究，主要采用了针对端粒酶RNA组分的反义核酸技术(Kondo S.，Kondo Y.，Li G.，et al，Targeted therapy of humanmalignant glioma in a mouse model by 2-5A antisense directed against telomeraseRNA.Oncogene，1998，163323-3330.Ludwig A，Saretzki G，Holm PS，et al.Ribozyme cleavage of telomerase mRNA sensitizes breast epithelial cells toinhibitors of topoisomerase.Cancer Res，2001，613053-3061；Feng J.，Funk W.D.，Wang S.S.，et al.The RNA component of human telomerase，Science，1995，2691236-1241)、基因治疗技术、切割端粒酶mRNA的核酶技术(Ludwig A，Saretzki G，Holm PS，et al.Ribozyme cleavage of telomerase mRNA sensitizesbreast epithelial cells to inhibitors of topoisomerase.Cancer Res，2001，613053-3061)和抑制端粒酶基因转录活性的技术等(Meyerson，M.Counter C.M.，EatonE.N.，et al.hEST2，the putative human telomerase catalytic subunit gene，is up-regulated in tumor cells and during immortalization，Cell，1997，90785-795；W.C.Hahn，S.A.Stewart，M.W.Brooks，S.G.York，E.Eaton，A.Kurachi，R.L.Beijersbergen，J.H.Knoll，MMeyerson，R.A.Weinberg，Inhibition of telomeraselimits the growth of human cancer cells，Nat.Med，1999，5164-1170)。这些技术可以使肿瘤细胞的端粒缩短，进而使细胞进入危机期或者死亡，或者使肿瘤细胞的致瘤性显著下降。
LPGENE是一种具有抑制肿瘤细胞的端粒酶活性的蛋白，它是一类新的蛋白质制剂，有重要的应用前景。LPGENE蛋白是由LPTS(Liver putative tumorsuppressor，LPTS)基因编码，该基因是本发明人利用定位克隆的方法从人的正常肝cDNA文库中得到的一个肝相关的候选抑癌新基因(C.Liao，M.J.Zhao，H.Song，K.Uchida，K.K.Yokoyama，T.P.Li，Identification of the gene for a novelliver-related putative tumor suppressor at a high-frequency loss of heterozygosityregion of chromosome 8p23 in human hepatocellular carcinoma.Hepatology 32(2000)721-727)。该基因编码的蛋白具有抑制细胞端粒酶的活性(Zhou X.Z.，LuK.P..The Pin2/TRF1-interacting protein PinX1 is a potent telomerase inhibitor.Cell，2001，107，347-359)。LPTS基因定位于人第8号染色体8p23区段，该区段在多种恶性肿瘤细胞中高频缺失。研究表明，LPTS在肝癌组织及肝癌细胞系中表达量极低或不表达，肿瘤细胞中端粒酶活性的升高，可能与LPTS基因的缺失或表达下调有关。已有文献报道将LPTS基因导入肝癌细胞，能抑制肝癌细胞的生长、增殖、最后引起死亡(Liao C，Zhao MJ，Zhao J，et al.Mutation analysis of novelhuman liver-related putative tumor suppressor gene in hepatocellular carcinoma.World J Gastroenterol，2003，989-93；Zhou X.Z.，Lu K.P..The Pin2/TRF1-interacting protein PinX1 is a potent telomerase inhibitor.Cell，2001，107，347-359.)。因此，LPTS蛋白具有抑制肿瘤细胞生长，并导致死亡的作用。
中国专利ZL00115395.1公开了LPTS的基因序列和编码蛋白的氨基酸序列。然而，在以往的研究报告中，LPTS蛋白是以GST-融合蛋白或His-融合蛋白的形式在大肠肝菌中重组表达，然后通过GST-或Ni柱亲和层析分离和纯化融合蛋白。然而，亲和层析柱纯化方法生产成本高，根本不适于大量制备。
因此，本领域迫切需要研制出一种成本低、可供大规模制备，获得目的蛋白的分离纯化工艺。
发明内容
本发明的目的就是提供一种制备LPTS蛋白的方法，该方法可有效地和规模化制备LPTS蛋白，并使获得的蛋白具有相当高的纯度和抑制端粒酶的生物学活性。
在本发明的第一方面，提供了一种分离端粒酶活性抑制剂的方法，其中端粒酶活性抑制剂是LPTS蛋白或其活性片段，该方法包括步骤(a)对含有LPTS蛋白或其活性片段的发酵液样品，进行阳离子交换层析，获得含所述LPTS蛋白或其活性片段的初提纯液，其中所述的活性片段具有全长LPTS的80％以上的端粒酶抑制活性；(b)对步骤(a)中的初提纯液，进行葡聚糖凝胶层析，从而获得纯化的LPTS蛋白或其活性片段。
在另一优选例中，步骤(a)中使用的阳离子交换介质是SP-Sepharose。
在另一优选例中，步骤(a)中的条件是，阳离子交换介质是SP-Sepharose，以pH7.8±0.2，30±5mmol/L的KH2PO4-NaOH缓冲液为平衡液，收集在0.5±0.05mol/L NaCl溶液段的洗脱峰作为初提纯液。
在另一优选例中，步骤(b)中所用的葡聚糖凝胶是Sephadex G100。
在另一优选例中，步骤(b)中的条件是，葡聚糖凝胶是Sephadex G100，以30±10mmol/L NH4HCO3为平衡液和洗脱液，收集主洗脱峰(用SDS-PAGE电泳验证)即为纯化的LPTS蛋白或其活性片段。
在另一优选例中，在步骤(a)和(b)之间还包括步骤将步骤(a)中的初提纯液的体积浓缩至初提纯液原体积的1/3-1/50。
在另一优选例中，所述的纯化的LPTS蛋白的纯度大于80％，其活性片段的纯度大于90％。
在另一优选例中，所述的活性片段是具有至少80％全长LPTS的端粒酶抑制活性的活性片段，较佳地选自下组(i)LPTS的C末端的197个氨基酸构成的多肽；(ii)6His与LPTS的C末端的197个氨基酸构成的融合蛋白。
更佳地，所述的活性片段是具有SEQ ID NO5或6所示氨基酸序列的多肽。
在另一优选例中，步骤(a)中的发酵液样品是用超声波破碎菌体后，经离心而获得上清液。
在本发明的第二方面，提供了一种用本发明上述方法制备的端粒酶活性抑制剂，其中端粒酶活性抑制剂是LPTS蛋白的活性片段，并且所述的活性片段选自下组(i)LPTS的C末端的197个氨基酸构成的多肽；(ii)6His与LPTS的C末端的197个氨基酸构成的融合蛋白。
在另一优选例中，所述的粒酶活性抑制剂是具有SEQ ID NO5或6所示氨基酸序列的多肽。
图1显示了重组表达载体pET-24-LPGENE1和LPGENE2的构造图。
图2显示了LPGENE1和LPGENE2在大肠肝菌中的诱导表达结果。其中，各泳道如下1LPGENE1诱导表达前；2LPGENE1诱导表达后；3LPGENE2诱导表达前；4LPGENE1诱导表达后；5分子量标准物。
图3显示了LPGENE1经SP-Sepharose柱层析纯化后的结果。其中，各泳道如下1分子量标准物；2-50.5M NaCl洗脱液；61M NaCl洗脱液。
图4显示了LPGENE2经SP-Sepharose柱层析纯化后的结果。其中，各泳道如下1分子量标准物；2-50.5M NaCl洗脱液；61M NaCl洗脱液。
图5显示了LPGENE1经Sephadex G100柱层析纯化后的结果。其中泳道1-6为洗脱液。
图6显示了LPGENE2经Sephadex G100柱层析纯化后的结果。其中泳道1-7为洗脱液。
图7显示了最终获得LPGENE1和LPGENE2蛋白的纯度。其中，各泳道如下1LPGENE2的诱导表达；2LPGENE2的SP-Sepharose层析纯化；3LPGENE2的Sephadex G100层析纯化；4LPGENE1的诱导表达；5LPGENE1的SP-Sepharose层析纯化。
图8显示LPGENE1和LPGENE2经Hi-Sepharose 4B柱纯化后的结果。其中，各泳道如下1LPGENE1经Hi-Sepharose 4B柱纯化后的结果；2，4分子量标准物；3LPGENE2经Hi-Sepharose 4B柱纯化后的结果。
图9显示了纯化后的LPGENE1和LPGENE2蛋白具有抑制肿瘤细胞端粒酶的活性。其中，各泳道如下1-5加入LPGENE1蛋白的浓度(ug/ml)分别为1.6，3.2，6.4，12.8，25.6；6-10LPGENE2蛋白0.62，1.25，2.5，5，10；11空白对照。
图10显示了纯化后的LPGENE1和LPGENE2蛋白具有特异的免疫原性。泳道1LPTS抗体与纯化后的LPGENE2蛋白专一性结合；泳道2LPTS抗体与纯化后的LPGENE1蛋白专一性结合。
具体实施例方式
本发明人经过广泛而深入的研究，发现LPTS基因特别适合于用基因工程技术重组表达其蛋白质产物，经产物的分离纯化后，用于肝细胞肝癌及其它肿瘤的治疗。
如本文所用，术语“LPGENE”和“LPTS”可互换使用，指公开于中国专利ZL00115395.1的LPTS基因或其编码蛋白(如SEQ ID NO1和2所示的基因和编码蛋白)。该术语还包括具有抑制端粒酶活性的活性片段(如含有C末端197个氨基酸的活性片段，尤其是具有SEQ ID NO5所示序列的活性片段)或衍生物(如在C末端或N端带有6His、GST序列的融合蛋白，尤其是具有SEQ ID NO6所示序列的活性片段。该术语包括含有或不含有起始甲硫氨酸的多肽。
如本文所用，术语“LPGENE1”指全长的LPTS基因或其编码蛋白，例如SEQ ID NO1所示的基因、SEQ ID NO2所示的编码蛋白和SEQ ID NO3所示的带6His的全长LPTS蛋白。
如本文所用，术语“LPGENE2”指LPTS蛋白的C末端197氨基酸的活性片段或其编码序列，例如SEQ ID NO4所示的编码序列或SEQ ID NO5和6所示的活性片段。
为了描述方便，在实施例中，将“LPGENE1”和“LPGENE2”通称为“LPGENE”。
本发明还提供一种新的能稳定表达并且纯度极高的LPTS活性片段，它就是LPGENE2。
在本发明中，术语“LPGENE2蛋白”、“LPGENE2多肽”或“端粒酶抑制蛋白活性片段LPGENE2”可互换使用，都指具有人端粒酶抑制蛋白LPGENE2氨基酸序列(SEQ ID NO5)的蛋白或多肽。它们包括含有或不含起始甲硫氨酸的端粒酶抑制蛋白LPGENE2。该术语还包括SEQ ID NO5与6His等标签序列形成的融合蛋白(SEQ ID NO6)。
如本文所用，“分离的LPGENE蛋白或多肽”是指LPGENE蛋白或其多肽片段基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化LPGENE蛋白。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。
根据重组生产方案所用的宿主，本发明的LPGENE多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。
本发明还包括人LPGENE蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持天然LPTS的端粒酶抑制活性(如80％以上)，与SEQ ID NO2的氨基酸序列有80％以上序列相同性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
在本发明中，术语“人LPGENE多肽”指具有端粒酶抑制活性的SEQ ID NO2和5序列的多肽。该术语还包括具有端粒酶抑制活性的、SEQ ID NO2和5序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)一个或多个(通常为1-20个，较佳地1-10个，更佳地1-8个，最佳地1-5个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括人LPGENE蛋白的活性片段和活性衍生物。
发明还提供人LPGENE蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然LPGENE多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。
修饰(通常不改变一级结构)形式包括体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
在本发明中，“人LPGENE蛋白保守性变异多肽”指与SEQ ID2或5的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。
表1
本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO1或4所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQID NO2或5的蛋白质，但与SEQ ID NO1或4所示的编码区序列有差别的核酸序列。
本发明的人LPGENE核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明LPGENE蛋白的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
本发明也涉及包含LPGENE编码序列的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或LPGENE蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。
通过常规的重组DNA技术(Science，1984；2241431)，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的LPGENE多肽。一般来说有以下步骤(1).用本发明的编码人LPGENE多肽的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
本发明中，人LPGENE多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含人LPGENE编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有大肠杆菌，真菌细胞如酵母；CHO、COS、293细胞等。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的重组的LPGENE多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
本发明还提供了一种抑制端粒酶活性的组合物，它含有抑制有效量(如0.001-99.99wt％)的本发明LPGENE多肽以及可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。本发明的组合物可以被制成针剂、溶液、片剂。
在本发明的一个实施例中，将LPTS基因编码328个氨基酸的全长cDNA(LPGENE1)和编码C端197氨基酸的cDNA(LPGENE2)插入pET24a+质粒的NdeI/Xho1位点。经测序验证序列无误后转化宿主菌E.coli BL-21。然后进行诱导表达，SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳检测菌体中表达的蛋白。LPGENE1蛋白在30℃诱导时表达量较37℃低，产率约为33.5mg/L，但可以减少LPGENE1蛋白的降解。出乎意料的是，LPGENE2在37℃诱导表达时，产率大幅提高，约为59.5mg/L，占菌体总蛋白的39％，并且表达的LPGENE2蛋白质很稳定，不易被降解。
本发明还提供了从发酵液中分离纯化LPGENE1和LPGENE2的方法。将发酵液离心获得菌体，然后超声波破碎细胞，采用离子交换层析等多种分离方法，获得高纯度的LPGENE蛋白。LPGENE蛋白富含碱性氨基酸，pI值约为10，偏碱性，所以先采用阳离子交换介质(如SP-Sepharose柱层析)，分离纯化目的蛋白。然后再将含目的蛋白的分离液经超滤浓缩后，经Sephadex G100柱层析进一步纯化。目的蛋白LPGENE1的纯度达80％以上，LPGENE2的纯度可达95％以上。LPGENE1和LPGENE2蛋白的总回收率分别为27.1％和34.3％。
本发明还提供了对LPGENE蛋白的活性检测技术。LPGENE是一种很强的端粒酶活性抑制剂，实施例3详细地描述了测定LPGEGE抑制端粒酶的生物学活性的方法，以及制备含有端粒酶的SMMC-7721肝癌细胞裂解液，作为检测底物的方法。
本发明还提供了采用Western Blotting实验对纯化的LPGENE1和LPGENE2蛋白的特异免疫活性进行鉴定。即将LPGENE蛋白样品经SDS-PAGE电泳后，用Bio-Rad公司的电转仪将蛋白转至硝酸纤维素膜上，用特异的抗LPGENE抗体进行杂交，确定蛋白的特异免疫原性。
本发明的主要优点在于
(a)与Ni柱亲和层析相比较，本发明所涉及的分离纯化工艺简单，易于操作，生产成本较低，回收率和产品纯度较高，适于工业放大，从而可以大规模生产LPGENE蛋白；(b)本发明方法纯化得到的蛋白在纯度、回收率、体外抑制端粒酶活性和免疫原性与亲和层析方法获得的蛋白一致。
(c)LPGENE2蛋白质不仅性能很稳定，不易被降解，而且端粒酶抑制活性高于全长LPTS蛋白。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1.LPGENE1和LPGENE2的基因工程菌的制备和诱导表达(a)LPGENE1和LPGENE2基因的制备以全长LPTS基因序列(制法见中国专利ZL00115395.1)为模板，用以下引物，P1(上游引物)5’-CATATGTCTATGCTGGCTGAACGTCGG-3’(SEQ ID NO7)P2(下游引物)5’-CTCGAGTTTGGAATCTTTCTTCTT-3’(SEQ ID NO8)通过PCR反应，获得两端带有酶切位点NdeI和Xho1的含全长LPTS编码序列的PCR扩增产物(LPGENE1基因)，序列见SEQ ID NO1；PCR反应条件为在50μl体系中进行，包括1μl模板，1μl dNTP mix(10mM)，上下游引物(20μM)各1μl，5μl10×PYROBEST buffer，0.5μl PYROBEST酶，补加去离子水至50μl。反应条件为94℃3分钟，然后是30个循环，每循环包括94℃30秒，56℃40秒，72℃60秒，30个循环后再72℃延伸5分钟，4℃保温。
同样，以全长LPTS基因序列(制法见中国专利ZL00115395.1)为模板，用以下引物，P3(上游引物)5’-CATATGTACGGCCGCAAGAAACGCCGC-3’(SEQ ID NO9)
P2(下游引物)5’-CTCGAGTTTGGAATCTTTCTTCTT-3’(SEQ ID NO8)通过PCR反应，获得的PCR扩增产物两端带有酶切位点NdeI和Xho1，并含有编码LPTS蛋白C端196氨基酸并在N端加上甲硫氨酸共197个氨基酸的DNA序列(LPGENE2基因)，序列见SEQ ID NO4。PCR反应条件同上。
(b)LPGENE1和LPGENE2工程菌的构建将如上获得的LPGENE1基因和LPGENE2基因的PCR产物，经过NdeI和Xho1酶切后，分别插入经NdeI和Xho1酶切的pET24a+质粒(购自Novagen公司)，得到质粒pET-24-LPGENE1和pET-24-LPGENE2(通称为pET-24-LPGENE)。经测序验证序列无误后转化常规的宿主菌E.coli BL-21(DE3)。获得分别表达LPGENE1和LPGENE2的工程菌。
LPGENE1和LPGENE2表达质粒的构造见图1。LPGENE1的核苷酸序列和氨基酸序列如SEQ ID NO1、2和3所示，LPGENE2的核苷酸序列和氨基酸序列如SEQ ID NO4、5和6所示。
在本实施例中，因为选用的质粒上带有6His的编码序列，因此表达的目的蛋白的C端含有6×His。带有6His的LPGENE的蛋白序列示于SEQ ID NO3和6(SEQ ID NO3为带有6His的LPGENE1的蛋白序列，SEQ ID NO6为有6His的LPGENE2的蛋白序列)。
(c)LPGENE在大肠肝菌中的诱导表达将pET-24-LPGENE重组质粒转化E.coli BL-21，挑取阳性克隆进行酶切鉴定和测序鉴定，将验证后的单克隆接种到5ml卡那霉素含量为100mg/L的2YT培养基(每升培养基含有16g Trypton，10g酵母提取物，5g NaCl)中，37℃振荡，培养过夜。次日，以1％接种量接入新鲜的2YT培养基(kan+)中，37℃继续培养4h。当A600约等于0.6时，加入IPTG，终浓度为0.5mmol/L，诱导表达3～4h，诱导表达的温度37℃或30℃。在加入IPTG前吸取少量菌液做菌体蛋白阴性对照。离心收集诱导表达后的菌体，悬浮后用超声波破碎。超声破菌条件见实施例2。
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳检测上述制备菌体中的LPGENE蛋白。SDS聚丙烯酰胺凝胶的配制及电泳方法见文献(汪家政，范明主编.蛋白质技术手册[M].北京科学出版社，2001，77)，浓缩胶的浓度为5％，分离胶的浓度为12％，电泳缓冲液采用Tris-甘氨酸系统。将待检测的IPTG诱导前后菌体以及超声波破碎后的离心沉淀加入1×SDS-PAGE上样缓冲液混合，超声波破碎后上清加等体积的2×SDS-PAGE上样缓冲液混合，沸水浴5min，离心1min，然后上样，进行电泳。
LPGENE1和LPGENE2在大肠肝菌中的诱导表达结果见图2。其中，泳道1，3为LPGENE工程菌在诱导前的蛋白表达结果，泳道2，4为诱导后的蛋白表达。结果表明，诱导后LPGENE蛋白的表达量明显增加。
LPGENE1蛋白的诱导温度可采用37℃或30℃。在37℃诱导时蛋白表达量较高，产率约为50mg/L，约占菌体总蛋白的35％。降低诱导温度如30℃，诱导4h后，产率约为33.5mg/L，占菌体总蛋白的32％，降低诱导温度，表达量下降，但可以减少LPGENE1蛋白的降解。
LPGEGE2的诱导表达与LPGENE1基本相同，但LPGENE2的最适诱导表达温度是37℃，诱导时间为3h，产率约为59.5mg/L，可占菌体总蛋白的39％，并且表达的LPGENE2蛋白质很稳定，不易被降解。
实施例2.LPGENE1和LPGENE2的分离纯化在实验室少量制备纯化的LPGENE蛋白可以采用商品化的Hi-Sepharose 4B柱进行亲和层析。为了大量制备纯化的LPGENE蛋白，本实施例采用了离子交换等分离方法，获得了高纯度的LPGENE蛋白。
具体分离纯化工艺可包括以下几个步骤(1)超声波破碎菌体取离心所得的菌体，加入20倍细菌体积的缓冲液(30mmol/L KH2PO4-NaOH)重悬细胞，再加入2‰的100mM的PMSF(苯甲基磺酰氟)(终浓度0.2mM)。然后在冰浴条件下，超声波破碎细胞，(超声仪，宁波新芝公司制造)，超声条件如下工作时间7秒，间隙时间25秒，工作功率400W，工作次数50～100次(根据体积和和菌体浓度而变)，每超声30次加入同等量的PMSF。超声结束后4℃离心，12000rpm离心30分钟，收集上清，加同等量2‰PMSF，待用。
(2)SP-Sepharose层析将超声后上清过预平衡的SP-Sepharose柱(SP-Sepharose FastFlow，Pharmacia公司)。柱平衡液为30mmol/L的KH2PO4-NaOH缓冲液(pH7.8)，吸附后再用5倍柱体积的此平衡液洗涤，至无蛋白质流出后，用阶段性梯度洗脱，洗脱液分别为0.3、0.5和1.0mol/L的NaCl溶液(用平衡液配制，各5倍柱体积)，分别收集各段流出峰，SDS-PAGE电泳检测各个峰的蛋白质纯度和含量。层析在4℃冷库中进行。
结果见图3和图4。其中图3中的样品3为LPGENE1经SP-Sepharose柱层析，用0.5mol/L的NaCl溶液洗脱后的洗脱液，图4中的样品3、4为LPGENE1经SP-Sepharose柱层析，用0.5mol/L的NaCl溶液洗脱后的洗脱液。结果表明，LPGENE蛋白在0.5mol/L的NaCl溶液洗脱段流出，并且纯度比较高。
(3)经SP-Sepharose层析纯化所得蛋白的超滤浓缩将SP-Sepharose层析得到的LPGENE纯化蛋白溶液移入Millipore超滤离心管(Amecon Ultra-4，膜截留分子量为10,000，Millipore公司)，4000g，4℃离心，浓缩至原体积的1/20。具体方法见公司说明。在浓缩后的蛋白质溶液中再补加溶液及PMSF，终浓度分别为30mmol/L和0.2mM，装入透析袋，然后把透析袋放入20倍于蛋白质样品体积的缓冲液(30mmol/L NH4HCO3)进行透析，用磁器缓缓搅拌缓冲液，搅拌透析温度4℃，每4h更换一次透析缓冲液，共4次。
(4)Sephadex G100层析取浓缩后的蛋白质样品2ml加入经30mmol/L NH4HCO3平衡液预平衡的Sephadex G100柱(1.6cm×100cm，Pharmacia公司)，再用此平衡液洗脱，收集各洗脱峰，直至无峰出现。在收集的蛋白溶液中加入终浓度为0.2mM的PMSF。实验在4℃条件下进行。SDS-PAGE检测LPGENE1和LPGENE2浓度和含量。
结果见图5和图6。其中图5为LPGENE1经Sephadex G100柱层析纯化后的结果，图6为LPGENE2经Sephadex G100柱层析纯化后的结果。结果表明，Sephadex G100能有效地提高LPGENE蛋白的纯度，特别是可以除去样品中的色素，核酸，多糖等物质，并且能够更换样品的缓冲液组份，有利于作进一步的处理、检测和应用。
LPGENE蛋白富含碱性氨基酸，pI值约为10，偏碱性，所以先采用阳离子交换介质SP-Sepharose，以30mmol/L的KH2PO4-NaOH(pH7.8)缓冲液为平衡液，收集在0.5mol/L NaCl溶液段的洗脱峰，可以很好的分离纯化目的蛋白。再经葡聚糖凝胶Sephadex G100层析分离，LPGENE2蛋白的SDS-PAGE电泳基本呈单一条带，纯度达95％，由于LPGENE1蛋白比较容易被水解，全长蛋白纯度约为80％，见图7。经过整个纯化过程LPGENE1和LPGENE2蛋白的总回收率分别为27.1％和34.3％，见表1。
表1 LPGENE1和LPGENE2蛋白纯化回收率
将本发明的二步分离方法与现有技术中采用Ni-Sepharose 4B柱亲和层析方法得到的蛋白(见图8)进行比较。结果表明，本发明的二步分离方法能有效的分离制备LPGENE蛋白，除了去掉一些小分子量蛋白质或肽段，还可除去色素、核酸、多糖等杂质，获得的蛋白纯度较Hi-Sepharose 4B柱层析获得的蛋白纯度有所提高。就蛋白的总回收率而言，两种方法基本相接近，然而本发明纯化方法的成本低，并且适合大规模生产。
实施例3.LPGENE1和LPGENE2生物学活性检测LPGENE是一种很强的端粒酶活性抑制剂。本发明采用TPAP法测定实施例2中制备并纯化的LPGEGE的生物学活性。
端粒酶来自常规的SMMC-7721肝癌细胞的裂解液，具体制备方法如下将SMMC-7721肝癌细胞接种在10ml培养瓶中，培养基为RPMI 1640，温度为37℃，5％CO2条件下贴壁培养，满瓶后收取培养细胞。即将培养基吸干，用PBS洗一遍细胞，然后用胰酶将细胞消化，PBS冲洗细胞，吸入离心管，4000rpm离心收集细胞。再用洗涤缓冲液(10mM Hepes-KOH(pH7.5)，1.5mM MgCl2，10mM KCl，1mMDTT(二硫苏糖醇))洗一遍细胞，离心。用冰预冷的裂解缓冲液(10mM Tris-HCl(pH7.5)，1mM MgCl2，1mM EGTA，0.1mM PMSF，5mM巯基乙醇，0.5％CHAPS，10％glycerol)500ul重悬细胞，置冰上30分钟，4℃，12,000rpm高速离心30分钟，离心获得上清可用来测定端粒酶活性。上清液可在-70℃保存，端粒酶活性可以经受多次的冻溶仍保持稳定。
TPAP测定法在500ul Eppendorf管中进行，反应体积为50ul。在管中加入42μL反应缓冲液(20mM Tris-HCl(pH8.3)，1.5mM MgCl2，63mM KCl，0.005％Tween-20，1mM EGTA，0.1mg/ml BSA)，1μL SMMC-7721肝癌细胞裂解液上清，0.25μL10mMdNTP，1μL倍比稀释的LPGENE蛋白，混匀后在冰上放置10min，管内再加入1μLTs引物(Ts primer，0.1μg/μL)，开始PCR反应。先在25℃延伸反应30分钟，90℃灭活3分钟，然后再加入1μL Cx引物(Cx primer)，0.5μL(2U)Taq酶，继续PCR反应。
反应条件为94℃，2分钟加热后，在94℃30秒，50℃40秒，72℃40s条件下，进行33个循环反应，最后72℃保温2分钟。
引物的序列为Ts引物5’-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3’(SEQ ID NO10)Cx引物5’-(CCCTTA)3CCCTAA-3’(SEQ ID NO11)。
然后电泳鉴定上述PCR反应产物。电泳采用10％聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)非变性胶，0.5×TBE缓冲液，电压100V，6～8小时。PAGE胶银染显色，拍照。
TRAP实验结果表明，实施例2制备获得的LPGENE蛋白在体外有较高的端粒酶抑制活性，LPGENE1和LPGENE2两种蛋白分别在约为12.8ug/ml和10ug/ml浓度时，能完全抑制端粒酶的活性(图9)。
实施例4.LPGENE1和LPGENE2蛋白特异的免疫反应原性为了确定纯化后的LPGENE1和LPGENE2蛋白是否具有特异的免疫活性，本实施例中采用Western Blotting实验进行检测。
LPGENE蛋白样品经SDS-PAGE电泳后，用Bio-Rad公司的电转仪将蛋白转至硝酸纤维素膜上，用特异的抗LPGENE抗体进行杂交本。实验中的一抗为LPGENE蛋白的家兔抗血清，并经亲和层析纯化。二抗为辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔IgG。具体的实验操作见参考文献汪家政，范明主编.蛋白质技术手册[M].北京科学出版社，2001，166。
Western实验结果表明，本方法制备的LPGENE能与抗体特意性的结合，见图10。图中样品1和2分别为LPGENE1和LPGENE2，具有良好的免疫反应原性。
实施例5.C端不含6His的LPGENE2蛋白的制备和活性测试基本上按实施例1中所述的方法，不同点仅在于PCR引物，此实施例中所用的上游引物同实施例1中的P1引物相同，而下游引物有所不同，本实施例所用的下游引物为5’-CTCGAGTCATTTGGAATCTTTCTTCTT-3’(SEQ ID NO12)，即在酶切位点之前加了一个终止密码子，这样，在蛋白翻译表达时，到此便终止翻译，从而制得表达C端不含6His的LPGENE2蛋白的大肠杆菌工程菌。
按实施例2中所述的类似方法，在37℃进行诱导表达不含6His的LPGENE2蛋白，并按相同的纯化方法和条件分离纯化该蛋白，通过(1)超声波破碎菌体；(2)SP-Sepharose层析；(3)超滤浓缩；(4)Sephadex G100层析等过程)，从而制得C端不含6His的LPGENE2蛋白，其纯度达95％，LPGENE2蛋白的总回收率达34.0％。
按实施例3的方法测试C端不含6His的LPGENE2蛋白的对端粒酶活性的抑制作用，结果表明，在约10ug/ml浓度时，能完全抑制端粒酶的活性。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表<110>中国科学院上海生命科学研究院<120>端粒酶活性抑制蛋白的制备<130>055751<160>12<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>984<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<220>
<221>CDS<222>(1)..(984)<223>
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<210>10<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
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<221>misc_feature<223>引物<400>12ctcgagtcat ttggaatctt tcttctt 2权利要求
1.一种分离端粒酶活性抑制剂的方法，其中端粒酶活性抑制剂是LPTS蛋白或其活性片段，其特征在于，该方法包括步骤(a)对含有LPTS蛋白或其活性片段的发酵液样品，进行阳离子交换层析，获得含所述LPTS蛋白或其活性片段的初提纯液，其中所述的活性片段具有全长LPTS的80％以上的端粒酶抑制活性；(b)对步骤(a)中的初提纯液，进行葡聚糖凝胶层析，从而获得纯化的LPTS蛋白或其活性片段。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(a)中使用的阳离子交换介质是SP-Sepharose。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(a)中的条件是，阳离子交换介质是SP-Sepharose，以pH7.8±0.2，30±5mmol/L的KH2PO4-NaOH缓冲液为平衡液，收集在0.5±0.05mol/L NaCl溶液段的洗脱峰作为初提纯液。
4.如权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(b)中所用的葡聚糖凝胶是Sephadex G100。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(b)中的条件是，葡聚糖凝胶是Sephadex G100，以30±10mmol/L NH4HCO3为平衡液和洗脱液，收集主洗脱峰，用SDS-PAGE电泳验证，即为纯化的LPTS蛋白或其活性片段。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(a)和(b)之间还包括步骤将步骤(a)中的初提纯液的体积浓缩至初提纯液原体积的1/3-1/50。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的纯化的LPTS蛋白的纯度大于80％，其活性片段的纯度大于90％。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的活性片段是具有至少80％全长LPTS的端粒酶抑制活性的活性片段，较佳地选自下组(i)LPTS的C末端的197个氨基酸构成的多肽；(ii)6His与LPTS的C末端的197个氨基酸构成的融合蛋白。
9.一种用权利要求1所述方法制备的端粒酶活性抑制剂，其中端粒酶活性抑制剂是LPTS蛋白的活性片段，并且所述的活性片段选自下组(i)LPTS的C末端的197个氨基酸构成的多肽；(ii)6His与LPTS的C末端的197个氨基酸构成的融合蛋白。
10.如权利要求9所述的端粒酶活性抑制剂，其特征在于，所述的粒酶活性抑制剂是具有SEQ ID NO5或6所示氨基酸序列的多肽。
全文摘要
本发明公开了采用基因重组技术制备端粒酶活性抑制蛋白的方法，该方法可以高效地和大规模地制备高纯度和高生物学活性的端粒酶活性抑制蛋白。
文档编号C07K1/18GK1948339SQ20051003052
公开日2007年4月18日 申请日期2005年10月14日 优先权日2005年10月14日
发明者赵慕钧, 陈光明, 赵静, 孙成副, 陈国元, 李载平 申请人:中国科学院上海生命科学研究院