专利名称：人源s100a4蛋白的纯化与鉴定的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种蛋白分子的纯化与鉴定。具体的说，本发明涉及一种具有高效表达活性的人源S100A4蛋白分子的纯化与鉴定。
背景技术：
S100A4蛋白是以非共价键结合二聚体存在于细胞内，而以共价结合二聚体分泌到细胞外。推测Ca2+结合后可导致S100A4蛋白构型改变，在表面暴露出新的结合位点，从而可与一系列靶标结合。胞外基质中的S100A4蛋白是一种单体和二聚体共存的状态，其比例受Ca2+结合程度的影响；胞内S100A4蛋白的同源二聚体和异源二聚体形式也是同时存在。 因此，从S100A4蛋白可形成同源二聚体、异源二聚体、寡聚体的多种形式来看，其结构具有很强的可变性，这可能也是它在体内具有多种生物学功能的结构基础。S100A4蛋白与肿瘤的发生、转移及预后密切相关，参与血管生成、细胞外基质重建等生命过程。因此，构建人源S100A4蛋白载体、表达并纯化S100A4蛋白，可以用于与P53 等靶分子相互作用的基础研究，以揭示其作用机制，为深入研究S100A4的作用机理以及临床检测提供有力的实验工具。
发明内容
本发明提供了一种纯化与鉴定人源S100A4蛋白的方法。该方法包括如下步骤(1)S100A4蛋白的纯化①将离子交换层析柱HiTrap DEAE FF (GE Health)以约5倍体积的起始缓冲液平衡。②平衡以后，将破碎上清以起始缓冲液稀释3-5倍以0. 45 μ m的除菌滤器过滤除菌后，以5mL/min的流速注射器手推上样，收集穿透液。③以起始缓冲液平衡层析柱，用不同浓度梯度的洗脱缓冲液进行洗脱，以1. 5mL/ 管收集，进行SDS-PAGE鉴定和纯度鉴定。(2)S100A4蛋白的脱盐采用透析的方法进行脱盐处理，简言之，透析袋中盛有人源S100A4蛋白溶液，再将透析袋放入生理盐水中，在4°C环境下透析M小时后，进行SDS-PAGE分析。(3)蛋白鉴定a SDS-PAGE 鉴定①将上一步骤中收集的破碎后上清液吸取25 μ 1，再加入25μ 1的2 X SDS上样缓冲液，混勻；②取破碎后的沉淀少许，加入25μ 1的超纯水重悬后，再加入25μ 1的2XSDS上样缓冲液，混勻；③将上述两者100°C煮沸5min，并短暂离心，进行SDS-PAGE电泳，鉴定其表达形式。
b Western-Blot 鉴定①处理好蛋白样品，进行SDS-PAGE电泳，记录加样顺序。②电泳完毕后，取下凝胶，标记方向，切取所需大小的胶。③量取一张与胶块大小相同的硝酸纤维素膜；6张滤纸，大小同凝胶。④将滤纸用转移buffer湿润，取3张叠放于半干转移仪上，将硝酸纤维素膜叠放上去后，把大小相同的凝胶叠放上去，再将转移buffer湿润的滤纸3张叠放上去。⑤检查气泡，接通半干转移仪，设置为电压12V，时间20min。⑥转移完毕后，取下硝酸纤维素膜，放入平皿，加入5mL的封闭液，室温封闭7小时 (轻摇)。封闭结束后，用TBST液洗膜3次，IOmin/次，加入5mL的用封闭液稀释好的一抗 (山羊抗S100A4)，轻摇过夜。再用TBST液洗膜3次，IOmin/次，加入IOmL的用封闭液稀释好的酶标二抗(兔抗山羊IgG-H+L)，轻摇40min。⑦再用TBST液洗膜3次，IOmin/次，将膜取出，用滤纸吸干剩余的TBST后，放于干净的保鲜膜上。将两个发光液以1 1的比例混合，以准备工作液。将膜在工作液中孵育 Imin后取出并用滤纸吸干过剩工作液，然后将膜放在暗盒中，蛋白面向上，关闭所有灯光， 只开红灯，小心的将一张X光片放在膜上曝光。⑧将曝光完的X光片放入显影液显影，然后将X光片放入定影液中定影。⑨定影结束后，用水冲掉X光片上残留的定影液，晾干后保存X光片。
图1为人源S100A4蛋白的SDS-PAGE电泳分析图2为纯化后人源S100A4蛋白的SDS-PAGE电泳分析图3为人源S100A4蛋白的表达形式及flfestern blot鉴定结果
具体实施例方式下面结合具体实例对本发明作进一步的说明(1)人源S100A4蛋白的纯化①将离子交换层析柱HiTrap DEAE FF (GE Health)以约5倍体积的起始缓冲液平衡。②平衡以后，将破碎上清以起始缓冲液稀释3-5倍以0. 45 μ m的除菌滤器过滤除菌后以5mL/min的流速上样，收集穿透液。③以起始缓冲液平衡层析柱，用不同浓度梯度的洗脱缓冲液进行洗脱，以1. 5mL/ 管收集，进行SDS-PAGE鉴定和纯度鉴定。(2)人源S100A4蛋白的脱盐采用透析的方法进行脱盐处理，简言之，透析袋中盛有人源S100A4蛋白溶液，再将透析袋放入生理盐水中，在4°C环境下透析M小时后，进行SDS-PAGE分析。(3)人源S100A4蛋白鉴定a SDS-PAGE 鉴定①将上一步骤中收集的破碎后上清液吸取25 μ 1，再加入25μ 1的2 X SDS上样缓冲液，混勻；
②取破碎后的沉淀少许，加入25μ 1的超纯水重悬后，再加入25μ 1的2XSDS上样缓冲液，混勻；③将上述两者100°C煮沸5min，并短暂离心，进行SDS-PAGE电泳，鉴定其表达形式。b Western-Blot 鉴定①处理好蛋白样品，进行SDS-PAGE电泳，记录加样顺序。②电泳完毕后，取下凝胶，标记方向，切取所需大小的胶。③量取一张与胶块大小相同的硝酸纤维素膜；6张滤纸，大小同凝胶。④将滤纸用转移buffer湿润，取3张叠放于半干转移仪上，将硝酸纤维素膜叠放上去后，把大小相同的凝胶叠放上去，再将转移buffer湿润的滤纸3张叠放上去。⑤检查气泡，接通半干转移仪，设置为电压12V，时间20min。⑥转移完毕后，取下硝酸纤维素膜，放入平皿，加入5mL的封闭液，室温封闭7小时 (轻摇)。封闭结束后，用TBST液洗膜3次，IOmin/次，加入5mL的用封闭液稀释好的一抗 (山羊抗S100A4)，轻摇过夜。再用TBST液洗膜3次，IOmin/次，加入IOmL的用封闭液稀释好的酶标二抗(兔抗山羊IgG-H+L)，轻摇40min。⑦再用TBST液洗膜3次，IOmin/次，将膜取出，用滤纸吸干剩余的TBST后，放于干净的保鲜膜上。将两个发光液以1 1的比例混合，以准备工作液。将膜在工作液中孵育 Imin后取出并用滤纸吸干过剩工作液，然后将膜放在暗盒中，蛋白面向上，关闭所有灯光， 只开红灯，小心的将一张X光片放在膜上曝光。⑧将曝光完的X光片放入显影液显影，然后将X光片放入定影液中定影。⑨定影结束后，用水冲掉X光片上残留的定影液，晾干后保存X光片。2.结果2. 1人源S100A4重组蛋白的纯化菌体经超声破碎后显示，S100A4以上清形式存在。将破碎后的菌液上清经过离子交换层析柱后，以不同浓度梯度的洗脱液进行洗脱并收集流出液进行SDS-PAGE分析。结果显示，以大约50mM NaCl的洗脱液即可洗脱目标蛋白。2. 2人源S100A4重组蛋白的脱盐采用透析的方法进行脱盐处理，简言之，透析袋中盛有人源S100A4蛋白溶液，再将透析袋放入生理盐水中，在4°C环境下透析M小时后，进行SDS-PAGE分析。2. 3重组人源S100A4蛋白的表达形式及flfestern-blot分析经IPTG诱导后，离心收集菌体，加入0. 2M PB溶液及适量EDTA，超声破碎，分别将上清、沉淀进行12% SDS-PAGE电泳鉴定。结果显示，约在IlkDa处出现一新生蛋白带，重组蛋白表达量约占菌体蛋白的30%左右，以可溶性形式表达(图3a)。以鼠源S100A4蛋白为对照，上样量10 μ L，进行SDS-PAGE电泳，电泳完毕后去掉积层胶，把分离胶中间切开，一半用考马斯亮蓝染色，一半进行Western-blot分析，以山羊抗S100A4抗体作为一抗，以HRP-兔抗山羊IgG作为二抗，化学发光显色，可以看到，在IlkD 处，鼠源S100A4蛋白为对照未见显色条带，上清及沉淀中均有特异条带，表明人源S100A4 蛋白获得了表达(图北)。
权利要求
1.权利要求1所述的人源S100A4蛋白的纯化与鉴定，其特征在于包括如下步骤(1) S100A4蛋白的纯化①将离子交换层析柱HiTrap DEAE FF(GE Health)以约5倍体积的起始缓冲液平衡。②平衡以后，将破碎上清以起始缓冲液稀释3-5倍以0.45 μ m的除菌滤器过滤除菌后， 以5mL/min的流速注射器手推上样，收集穿透液。③以起始缓冲液平衡层析柱，用不同浓度梯度的洗脱缓冲液进行洗脱，以1.5mL/管收集，进行SDS-PAGE鉴定和纯度鉴定。(2)S100A4蛋白的脱盐采用透析的方法进行脱盐处理，简言之，透析袋中盛有人源S100A4蛋白溶液，再将透析袋放入生理盐水中，在4°C环境下透析M小时后，进行SDS-PAGE分析。(3)蛋白鉴定a SDS-PAGE 鉴定①将上一步骤中收集的破碎后上清液吸取25μ 1，再加入25 μ 1的2 X SDS上样缓冲液， 混勻；②取破碎后的沉淀少许，加入25μ 1的超纯水重悬后，再加入25 μ 1的2XSDS上样缓冲液，混勻；③将上述两者100°C煮沸5min，并短暂离心，进行SDS-PAGE电泳，鉴定其表达形式。b Western-Blot 鉴定按照常规Wfestern-Blot法操作规程操作，以山羊抗S100A4(来源Santa cruz公司) 为一抗，进行鉴定所表达的S100A4蛋白。
全文摘要
本发明公开了一种人源S100A4蛋白的纯化与鉴定方法。本发明采用离子交换层析法对表达载体pET32a-S100A4的表达产物纯化后，进行SDS-PAGE鉴定和Western-Blot鉴定。为了加快纯化速度，防止蛋白在纯化过程中降解，采用透析法进行脱盐处理。
文档编号C07K1/18GK102336827SQ20101023443
公开日2012年2月1日 申请日期2010年7月23日 优先权日2010年7月23日
发明者佘晓俊, 刘子泉, 刘洪涛, 安改红, 崔博, 张娜, 徐传香, 王天辉, 王德刚, 陈学伟, 陈昀贇 申请人:中国人民解放军军事医学科学院卫生学环境医学研究所