在原核系统中分离纯化包涵体形式hiv-1蛋白酶的方法
【专利摘要】本发明提供了在原核系统中分离纯化包涵体形式HIV-1蛋白酶的方法，该方法中联合使用较低浓度的去垢剂和超声波破碎将杂蛋白与目的蛋白分离，并且操作过程中应用Amicon搅拌式超滤装置，有效缩短了包涵体蛋白的纯化时间。此外，该方法中蛋白复性采用了透析复性，透析过程温和，复性后蛋白酶活性和纯度较高，经简单的超滤浓缩即可进行蛋白质结晶生长和酶动力学测定，用于晶体学和酶学研究。
【专利说明】在原核系统中分离纯化包涵体形式HIV-1蛋白酶的方法
【技术领域】
[0001]本申请涉及I型艾滋病病毒蛋白酶的原核表达纯化方法以及获得的I型艾滋病病毒蛋白酶在晶体学和酶学研究中的应用。
【背景技术】[0002]艾滋病，即获得性免疫缺陷综合征(AIDS)，是在全球范围内传播的一种疾病，严重威胁着人类的健康。艾滋病是由于人体感染了“人类免疫缺陷病毒”(humanimmunodeficiency virus, HIV)所导致的传染病。HIV攻击人体免疫系统中最重要的⑶4淋巴细胞，破坏人的免疫系统造成机体的抵抗能力严重下降，从而感染其他的疾病导致各种复合感染而死亡。
[0003]HIV在病毒分类学上属逆转录病毒科(Retroviridae)慢病毒属(Ientivirus),目前已发现两种HIV，分别为HIV-1和HIV-2，两者具有相似的病毒结构和传播途径。HIV-2主要分布于非洲西部，在欧洲和美洲的一些感染者中也被检测到，其毒力和传播力都低于HIV-1，引起的艾滋病病程较慢且较缓和。HIV-1广泛分布于世界各地，是引起全世界AIDS流行的病原，目前HIV的研究也是以HIV-1为主进行的。
[0004]HIV-1病毒结构为球状的20面体，直径为lOOnm，外膜有72个钉状突起，都是由两个主要外膜蛋白组成，即gpl20和gp41 ;核心含两分子单股正RNA(9.2-9.8kb)、逆转录酶、整合酶、蛋白酶和核衣壳蛋白P24、pl7、p9及p7等。HIV-1有三个主要的基因:gag，pol和env，它们的共同点是编码的多聚蛋白产物都需要进行转录后剪切，加工成HIV病毒的结构基因以及一些重要的有活性的酶类。其中，gag和env基因编码病毒核衣壳和病毒外膜上的糖蛋白；pol基因编码的三个重要的酶(逆转录酶，整合酶和蛋白酶)以及其他蛋白质。HIV-1感染人体细胞主要分为入侵，复制，整合，转录，组装，成熟几个阶段。首先，HIV-1进入人体，利用病毒表面的糖蛋白gp41，gpl20识别并结合⑶4细胞表面的⑶4和CCR5(或CXCR4)受体，然后与细胞膜融合将HIV-1病毒的遗传物质释放到细胞质内，在HIV-1逆转录酶作用下合成双链DNA，然后在整合酶的参与下将双链DNA转运入细胞核内，随机整合在宿主细胞的染色体中，形成原病毒，跟随宿主进行复制遗传，转录形成mRNA，mRNA翻译形成三种主要的多聚蛋白Env, Gag, Gag-Pol,其中Env在细胞宿主细胞的蛋白酶作用下形成外膜蛋白gpl20，gp41，与RNA和其他蛋白组装完成出芽形成未成熟的病毒颗粒，HIV-1蛋白酶的作用下将Gag，Gag-Pol水解形成有活性的结构蛋白和重要的酶类，包括蛋白酶，逆转录酶，整合酶。至此，HIV-1病毒组装成成熟的病毒颗粒，再去感染其他的免疫细胞。由此可知，HIV蛋白酶在病毒的生活周期发挥不可取代的作用，Gag被切割成基质蛋白(pl7，MA)，衣壳蛋白(p24，CA)，核衣壳蛋白(p7，NC)，p6，p2(SPl)，pl(SP2)。Gag-Pol 被切割成 MA，CA，p2，NC，移码蛋白以及蛋白酶，逆转录酶，整合酶。HIV-1蛋白酶识别多肽底物的非对称形状，而不是一种特定的氨基酸序列，许多切割位点的氨基酸序列是不一样。病毒蛋白酶裂解两个前体蛋白发生在病毒颗粒从感染细胞释放期间或释放之后不久，因此，病毒的产生和释放不需要蛋白酶的活性，但是它在促使病毒成熟形成具有感染能力的病毒颗粒中有着不可或缺的功能。HIV蛋白酶，逆转录酶，整合酶成为治疗和开发新药的三个重要靶点。[0005]HIV-1蛋白酶属于天冬氨酸蛋白酶家族，是由两个相同亚基组成具有对称性的同源二聚体，每个亚基含有99个氨基酸。根据蛋白酶结构和底物的研究，人们在不断寻找蛋白酶特异结合的抑制剂，目前经FDA批准的PIs共9种:saquinavir, ritonavir,indinavir, nelfinavir，， amprenavir， lopinavir， atazanavir, tipranavir， darunavir。除了 tipranavir外，另外8种抑制剂都是多肽类似物(生物利用率低)，竞争性抑制剂，都含有一个羟基乙烯中心结构，tipranavir则是一个二氢吡喃酮环结构。由于“鸡尾酒疗法”HAART (Highly Active Antiretroviral Therapy)的应用，这些抑制剂在前期治疗过程中确实能有效的抑制HIV的传播，但是由于患者要承担高昂的医药费用，较高的注射剂量，发烧，腹泻，恶心等毒副作用，以及HIV病毒高突变率产生抗药性，艾滋病一直危害人类的健康，虽然全世界众多医学研究人员付出了巨大的努力，至今尚未研制出根治艾滋病的特效药物，也没有可用于预防的有效疫苗，这也促使人们在不断寻找新的抗HIV-1药物。
[0006]蛋白酶作为一个重要的靶点，人们在不断寻找能够有效抑制蛋白酶的抗病毒药物。为了能够筛选到活性高、特异性强的抗HIV-1蛋白酶抑制剂，需要分离纯化大量的蛋白酶，对其进行物理化学，晶体学以及酶学等方面的研究。HUi JO et al (1993)在大肠杆菌中表达和纯化了包涵体形式的HIV-1蛋白酶，具体纯化步骤为:取1/6菌体以TB缓冲液(IOmMTris-HCl, ImM EDTA,pH7.4)重悬菌体,高压破菌。10000rpm/min离心,弃去上清，收集包涵体。用TB缓冲液重悬包涵体，然后离心20分钟，收集包涵体，-20°C保存。用IOml 50%醋酸溶液溶解包涵体，1000Orpm离心30分钟。上清进行Sephadex G-75 (2.5x95cm)分离纯化(图1)，收集纯度较高HIV-1PR，用水稀释至醋酸浓度为25%，冷冻干燥。15mg冷冻干燥的包涵体，溶解在8mL预冷的50%醋酸溶液中，保证充分溶解。然后缓慢加入复性缓冲液(0.1M醋酸钠，pH5.5，5%乙二醇，10%甘油)，使蛋白复性。蛋白复性后进行超滤至lmL，然后经过Superdex75(图2)进一步纯化得到纯度较高的HIV-1蛋白酶。据文献报道10L发酵液能获得85mg蛋白。试验测定蛋白的动力学参数Vmax为27 μ mol/mg/min,Kcat为4.4s_l,Km为
2.5mM(HUi JO,Tomasselli AG,Reardon IM,Lull JM,Brunner DP,Tomich CS,HeinriksonRL.Large scale purification and refolding of HIV-1protease from Escherichiacoli inclusion bodies.J Protein Chem.1993Jun ; 12 (3):323-7)。该方法纯化流程繁琐,在包涵体蛋白复性前后的分离纯化中，涉及到高质量的蛋白纯化仪和各种配套的价格昂贵的分离层析柱，尤其是在蛋白复性之前，由于分离纯化蛋白所使用的缓冲液中含有大量的变性剂和去垢剂，会导致昂贵的层析柱过早恶化，造成层析系统使用寿命缩短，反复使用分离层析柱使蛋白损失较多。另外，去垢剂(如TritonX-100等)一旦与蛋白质结合在后期的纯化过程中很难去除，质量不佳的去垢剂将影响蛋白质的结晶。重组蛋白合成速度太快，没有足够的时间进行折叠容易形成包涵体，因此以包涵体形式存在的蛋白表达量比较大，但是由于不正确的折叠而缺乏生物学活性，因此变性非常必要。蛋白质稀释复性是一个非常复杂的过程，除与蛋白质复性的过程控制相关外，还很大程度上与蛋白质本身的性质有关，很多蛋白的复性效率只有百分之零点几。目前，包涵体蛋白的复性方式主要有，稀释复性，透析复性，柱上复性。该技术中使用了稀释复性，直接加入复性缓冲液，造成体积增大，变性剂的稀释速度太快，往往造成蛋白质复性中间体的聚集使蛋白无法形成正确折叠。该方案虽然最终得到的蛋白量较高，10L的发酵罐每次发酵得到85mg蛋白酶，但是得到的蛋白酶活性较低，同时IOL发酵罐的使用也是一种昂贵的投入。John M.Louis et al (1999)也在大肠杆菌中表达和纯化了包涵体形式的HIV-1蛋白酶，具体步骤为:将构建好的重组质粒转化BL21 (DE3)，挑取单克隆，使用2L摇瓶37°C扩大培养，当细胞密度0D600为0.5时，加入 2mMIPTG，32 度诱导 4 个小时后收菌。用缓冲液 A(50mM Tris-HCl，pH8.0，5mM EDTA, 5mMbenzamidine HCl, 5mM DTT)将菌体重悬,采用低温高压破菌仪破菌,20000g高速离心45分钟，得到的沉淀中含有大量的以包涵体形式存在的蛋白酶。将沉淀用含有0.5% Tritonx-100和IM尿素的缓冲液A清洗两次，最终得到的沉淀溶解在30ml含有50mM Tris-HCl，pH7.5，8M盐酸胍和5mM DTT的溶液中，40000rpm/min离心I小时。将上清液浓缩，进行凝胶过滤层析 Superdex 200 (660em, Amersham Pharmacia Biotech),收集纯度较高 HIV-1 蛋白酶，使用缓冲液8(100禮似4(:4册.0，11111 DTT, ImM EDTA,0.05% Triton X-100)进行稀释复性，得到有活性的HIV-1蛋白酶，将复性后的HIV-1蛋白酶超滤浓缩，进行阳离子交换层析，得到纯度较高的HIV-1蛋白酶。此蛋白可以用于晶体学,酶学的应用(John M.Louis,EwaldM.Wondrak, Alan R.Kimmel, Paul Τ.Wingfieldi, and Nashaat Τ.Nashed.ProteolyticProcessing of HIV-1Protease Precursor，Kinetics and Mechanism.THE JOURNAL OFBIOLOGICAL CHEMISTRY.1999August ；Vol (27):423437-23442)。该方法纯化流程繁琐，在包涵体蛋白复性前后的分离纯化中，同样涉及到高质量的蛋白纯化仪和各种配套的价格昂贵的分离层析柱，尤其是在蛋白复性之前，由于分离纯化蛋白所使用的缓冲液中含有大量的变性剂和去垢剂，会导致昂贵的层析柱过早恶化，造成层析系统使用寿命缩短，反复使用分离层析柱使蛋白损失较多。另外，去垢剂(如TritonX-1OO等)一旦与蛋白质结合在后期的纯化过程中很难去除，质量不佳的去垢剂将影响蛋白质的结晶。该技术中同样使用了稀释复性，直接加入复性缓冲液，造成体积增大，变性剂的稀释速度太快，往往造成蛋白质复性中间体的聚集使蛋白无法形成正确折叠，复性效率较低。
[0007]本发明中，我们利用基因工程的方法，将HIV-1蛋白酶在大肠杆菌中大量表达，HIV-1蛋白酶的疏水性大，主要以包涵体的形式存在，需要经过蛋白质的变复性过程，以往的纯化过程较为复杂并且收率较低，我们经过技术上的改进，优化了 HIV-1蛋白酶原核系统的分离纯化方法，并将其应用到晶体学和酶学的研究中。
【发明内容】
[0008]本发明提供一种在原核系统中快速高效分离纯化HIV-1蛋白酶的新方法，纯化工艺流程简单，科研成本较低，并且HIV-1蛋白酶的活性能大幅度提高，并且能广泛应用于酶学，晶体学等基础研究，以及HIV-1蛋白酶抑制剂高通量筛选中。
[0009]本发明的技术方案为:
[0010]一种在原核系统中分离纯化包涵体形式HIV-1蛋白酶的方法，包括如下步骤:I)将离心收集的HIV-1蛋白酶表达菌用溶液A(20mM Tris-HCl, pH8.0,500mM NaCl,2mMEDTA)悬浮，并加入核酸酶DNase I，使用低温超高压细胞破碎仪裂解细胞，将高压破菌仪调至1200bar，将菌液反复高压3次，然后在菌液中各加入2% TritonX-1OO和2% Tween20,搅拌均匀，使用超声波处理，然后离心收集沉淀；2)用溶液B(20mMTris-HCl，pH8.0,500mMNaCl,2mM EDTA, 2 % TritonX-100, 2 % Tween20)均匀重悬沉淀，直至成无块状物的包涵体悬浊液，然后将悬浊液超声处理，然后离心收集沉淀，重复操作3次；3)用溶液C(20mMTris-HCl,pH8.0,10mM NaCl，8M Urea)彻底溶解包涵体，离心取上清，然后选用截留分子量为30kD超滤膜与Amicon搅拌式超滤装置配合使用将杂蛋白与HIV-1蛋白酶进行分离，收集30kD超滤膜下的蛋白溶液，即得纯化的HIV-1蛋白酶溶液。
[0011]其中步骤I)中超声功率300W，开4s，关6s，超声20min。步骤2)中超声处理5min，超声功率300W，开4s，关6s 。
[0012]所述方法中还包括HIV-1蛋白酶的表达步骤，具体为:将包含HIV-1蛋白酶表达质粒的重组菌，先使用SOC培养基过夜培养，然后转接到LB培养基中扩大培养至0D600为0.5，加入0.1mM的IPTG (异丙基-β-D硫代半乳糖苷)进行。其中过夜培养时间优选为大约12小时，37°C培养时间优选4小时，诱导表达时间优选6小时，培养温度均优选37°C。
[0013]其中，截留分子量为30kD超滤膜与Amicon搅拌式超滤装置配合使用的具体方法:将截留分子量为30kD圆片超滤膜与Amicon Stirred Cell超滤杯组装,将上清(最大处理量50mL)倒入超滤杯中，加盖密封，高纯氮气加压至1.2MPa，然后将整个装置放在磁力搅拌器上，收集超滤膜下蛋白溶液。当上清液浓缩至20mL时，补加溶液C继续超滤至20mL，将膜下蛋白溶液合并，以备复性。
[0014]所述超滤膜优选使用前用20%乙醇浸泡处理，然后用双蒸水将乙醇清洗干净。
[0015]所述方法中还包括包涵体的透析复性步骤，所述透析复性步骤为:用溶液C稀释至蛋白浓度0.1-0.5mg/mL，然后加到透析袋中，放入4°C预冷的透析缓冲液A(双蒸水，10%甘油，0.2% beta-巯基乙醇)中，透析4-5小时，然后将透析袋转转移到4°C预冷的透析缓冲液B(20MmNaAc-HAc，pH5.2，0.2% beta-巯基乙醇)中，透析4_5小时后取出透析袋中溶液，离心收集上清。
[0016]所述透析复性后的上清经蛋白浓缩、分装，液氮快速冷冻后放在_80°C冰箱保存。
[0017]本发明还提供了一种利用荧光共振能量转移技术测定HIV-1蛋白酶动力学的方法，该方法中使用人工多妝底物 MCA-gama-abu-Ser-Gln-Asn-Tyr-Pro-1 Ie-Val-Gln-Glu-Lys-Dnp，所述HIV-1蛋白酶是本发明所述分离纯化的HIV-1蛋白酶。
[0018]本发明还提供了一种利用荧光共振能量转移技术测定针对HIV-1蛋白酶的抑制剂的活性的方法，该方法中使用人工多肽底物MCA-gama-abu-Ser-Gln-Asn-Tyr-Pro-1 Ie-Val-Gln-Glu-Lys-Dnp,以及本发明所述分离纯化的HIV-1蛋白酶。
[0019]本发明的有益效果包括如下几个方面:
[0020]本发明优化了培养基的组合方案,使HIV-1蛋白酶在大肠杆菌中稳定表达。
[0021]本发明中的HIV-1蛋白酶包涵体的快速高效的分离纯化方法，舍弃了常用的色谱纯化方法，不再使用价格昂贵的蛋白纯化仪以及各种分离层析柱，取而代之的是较低浓度的去垢剂和超声波破碎机的联合使用将杂蛋白与目的蛋白分离，以及操作过程简短的Amicon搅拌式超滤装置，达到了分离纯化蛋白的目的，并有效缩短包涵体蛋白的纯化时间。
[0022]在本发明中蛋白复性采用了透析复性，体积较小，复性条件经过优化，简化了透析液的配方，透析过程温和，复性后蛋白酶活性和纯度较高，经简单的超滤浓缩即可进行蛋白质结晶生长和酶动力学测定，用于晶体学和酶学研究。
[0023]本发明中缩略语和关键术语的定义如下:
[0024]HIV-1PR:人类免疫缺陷病毒蛋白酶
[0025]AIDS:获得性免疫缺陷综合征[0026]LB: Luria-Bertani 培养基
[0027]SOC:含营养较之LB培养基更为丰富一种培养基，可用于电转化后的感受态细胞的复苏
[0028]IPTG:异丙基硫代-β -D半乳糖苷，一种乳糖类似物。
[0029]SDS-PAGE:变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
[0030]PCR:聚合酶链式反应
[0031]FRET:荧光共振能量转移，当一个荧光分子(又称为供体分子)的荧光光谱与另一个荧光分子(又称为受体分子)的激发光谱相重叠时，供体荧光分子的激发能诱发受体分子发出荧光，同时供体荧光分子自身的荧光强度衰减。
[0032]Km:酶促反应速度达最大值一半时的底物浓度
[0033]Vmax:最大反应速度
[0034]kcat:酶的转化数，指在单位时间内，一个酶分子将底物转变成产物的分子总数，单位为s-1
[0035]kcat/Km:用来衡量酶的催化效率。
[0036]IC50:反应初速度被抑制一半(剩余活性为50% )时抑制剂的浓度。
【专利附图】
【附图说明】
`[0037]图1:包涵体溶解后上清进行凝胶过滤层析(S^hadex G-75)。HIV-1蛋白酶的分子量为10.7kD，凝胶过滤层析后进行SDS-PAGE检测，SDS-PAGE结果显示第一个峰为杂蛋白峰，第二个峰为目的蛋白峰，收集纯度较高的目的蛋白。
[0038]图2 =HIV-1蛋白酶经过复性后得到有活性的蛋白酶，将蛋白超滤至Iml进行凝胶过滤层析(Superdex75)。SDS-PAGE检测第一个峰为HIV-1蛋白酶。
[0039]图3:HIV-1蛋白酶基因PCR电泳结果。
[0040]图4:15% SDS-PAGE检测结果。1:8M尿素溶解包涵体，高速离心后得到的沉淀，IlkD处并无条带；2:8M尿素溶解包涵体，高速离心后得到的上清，胶图显示SM尿素可以将HIV-1蛋白酶完全溶解，杂蛋白主要集中在30kD以上；3:8M尿素溶解的上清经Amicon搅拌式超滤装置后30kD以上杂蛋白被除去；4:marker
[0041]图5:15% SDS-PAGE结果。复性后HIV-1蛋白酶具有了水解多肽的功能，将蛋白酶浓缩至5mg/ml，SDS-PAGE检测显示蛋白纯度较好但是存在因自酶切而出现的一些弥散的条带。
[0042]图6:文献资料显示HIV-1蛋白酶具有自剪切功能，并且其自身的氨基酸序列中存在一些自酶切位点。
[0043]图7 =HIV-1蛋白酶与多肽底物反应示意图。根据MA/CA中HIV-1蛋白酶的剪切位点序列设计并人工合成荧光底物。
[0044]图8:反应初速度与底物浓度曲线。利用软件GraphPad Prism 5计算出Vmax =96.24 μ mol/L/min ；Km = 24.29 ±3.7 μ Μ。
[0045]图9:HIV-1 protease 晶体。分辨率为 2.0 埃。
[0046]图10:药物发现模型。该图为反应过程曲线，产物的生成量(即荧光强度)与反应时间的曲线，曲线的斜率表示单位时间内产物生成量的变化，即曲线上任何一点的斜率就是该相应时间的反应速率，在底物消耗小于10% (反应开始很短的时间内)范围内，曲线斜率为酶反应的初速率(VO)，有不同抑制剂存在时，酶的反应初速率(Vi)会有不同程度的下降，酶的剩余活性(Vi/V0)低于10%，为阳性结果。
[0047]图 11:PeptatinAIC50 的测定。将 PeptatinA 用 100% DMSO 进行 1/2 浓度梯度稀释，一般测定15个浓度梯度，然后计算PeptatinA每个浓度对应的剩余活性,利用软件Gr aphPad Pr i sm 5分析,作出剩余活性值与化合物浓度的对数值的曲线,计算出Pep tat i nAIC50 为 55.72 μ Mo
【具体实施方式】
[0048]下面对本发明的各个方面和特点作进一步的描述。
[0049]实施例1:HIV-1蛋白酶的表达
[0050]设计引物PCR(图3)将HIV-1蛋白酶编码片段扩增，回收PCR产物及pET_lIa载体，用Nde I和BamH I酶切，回收目的片段，将酶切后的片段，与线性化载体进行连接后转化E.col1.DH5 α感受态细胞。挑取转化的克隆进行双酶切鉴定，阳性克隆进行DNA测序。
[0051]表1:PCR 过程
[0052]
【权利要求】
1.一种在原核系统中分离纯化包涵体形式HIV-ι蛋白酶的方法，包括如下步骤:1)将离心收集的 HIV-1 蛋白酶表达菌用溶液 A(20mM Tris-HCl，pH8.0，500mM NaCl,2mM EDTA)悬浮，并加入核酸酶DNase I，使用低温超高压细胞破碎仪裂解细胞，将高压破菌仪调至1200bar，将菌液反复高压3次，然后在菌液中各加入2% TritonX-1OO和2% Tween20，搅拌均匀，使用超声波处理，然后离心收集沉淀；2)用溶液B(20mMTris-HCl，pH8.0,500mMNaCl,2mM EDTA, 2 % TritonX-100, 2 % Tween20)均匀重悬沉淀，直至成无块状物的包涵体悬浊液，然后将悬浊液超声处理，然后离心收集沉淀，重复操作3次；3)用溶液C(20mMTris-HCl,pH8.0,10mM NaCl，8M Urea)彻底溶解包涵体，离心取上清，然后选用截留分子量为30kD超滤膜与Amicon搅拌式超滤装置配合使用将杂蛋白与HIV-1蛋白酶进行分离，收集30kD超滤膜下的蛋白溶液，即得纯化的HIV-1蛋白酶溶液。
2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤I)中超声功率300W，开4s，关6s，超声20min。
3.根据权利要求1所述的方法，其中步骤2)中超声处理5min，超声功率300W，开4s，关6s。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，截留分子量为30kD超滤膜与Amicon搅拌式超滤装置配合使用的具体方法:将截留分子量为30kD圆片超滤膜与Amicon Stirred Cell超滤杯组装，将上清(最大处理量50mL)倒入超滤杯中，加盖密封，高纯氮气加压至1.2MPa，然后将整个装置放在磁力搅拌器上，收集超滤膜下蛋白溶液，当上清液浓缩至20mL时，补加溶液C继续超滤至20mL，将膜下蛋白溶液合并，以备复性。
5.根据权利要求4所述的方法，所述超滤膜优选使用前用20%乙醇浸泡处理，然后用双蒸水将乙醇清洗干净。
6.根据权利要求1所述的方法，所述方法中还包括HIV-1蛋白酶的表达步骤，具体为:将包含HIV-1蛋白酶表达质粒的重组菌，先使用SOC培养基过夜培养，然后转接到LB培养基中扩大培养至0D600为0.5， 加入0.1mM的IPTG(异丙基-β -D硫代半乳糖苷)进行。
7.根据权利要求6所述的方法，其中过夜培养时间为12小时，37°C培养时间为4小时，诱导表达时间为6小时。
8.根据权利要求6所述的方法，其中培养温度均为37°C。
9.根据权利要求1所述的方法，所述方法中还包括包涵体的透析复性步骤，具体为:用溶液C稀释至蛋白浓度0.1-0.5mg/mL，然后加到透析袋中，放入4°C预冷的透析缓冲液A (双蒸水，10 %甘油，0.2 % beta-巯基乙醇)中，透析4_5小时，然后将透析袋转转移到4°C预冷的透析缓冲液B(20MmNaAc-HAc，pH5.2,0.2% beta-巯基乙醇)中，透析4_5小时后取出透析袋中溶液，离心收集上清。
10.根据权利要求9所述的方法，所述透析复性后的上清经蛋白浓缩、分装，液氮快速冷冻后放在_80°C冰箱保存。
11.一种利用荧光共振能量转移技术测定HIV-1蛋白酶动力学的方法，该方法中使用人工多妝底物 MCA-gama-abu-Ser-Gln-Asn-Tyr-Pro-1Ie-Val-Gln-Glu-Lys-Dnp,所述HIV-1蛋白酶是经权利要求1-10所述方法分离纯化的HIV-1蛋白酶。
12.一种利用荧光共振能量转移技术测定针对HIV-1蛋白酶的抑制剂的活性的方法，该方法中使用人工多妝底物 MCA-gama-abu-Ser-Gln-Asn-Tyr-Pro-1 Ie-Val-Gln-Glu-Lys-Dnp,以及经权利要求1-10所述方法分离纯化的HIV-1蛋白酶。
【文档编号】G01N21/64GK103525794SQ201210234106
【公开日】2014年1月22日 申请日期:2012年7月6日 优先权日:2012年7月6日
【发明者】饶子和, 杨诚, 郭宇, 周红刚, 唐延婷, 丁宏兰, 王文明, 张坛杰, 陈卫强, 刘慧娟, 李爽 申请人:天津市国际生物医药联合研究院