一种从包涵体中制备可溶性白介素重组蛋白的方法及试剂的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种从包涵体中制备可溶性白介素重组蛋白的方法及试剂，包括洗涤液、菌体裂解液、包涵体溶解液、蛋白复性液-I和蛋白复性液-II。使用本发明诉述的包涵体溶解液可以显著提高从包涵体中获得可溶性白介素重组蛋白的得率，从而解决用大肠杆菌表达体系生产白介素所存在的问题。与现有技术相比，本发明不含有任何蛋白变性剂，这样有利于后续的蛋白复性；操作简单，可提升可溶性白介素蛋白得率达90％以上，相对常规使用蛋白变性剂法只能获得5-20％具有明显优势，具有推广应用的价值。
【专利说明】一种从包涵体中制备可溶性白介素重组蛋白的方法及试剂
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种重组蛋白技术，尤其涉及一种从包涵体中制备可溶性白介素重组 蛋白的方法及试剂。
【背景技术】
[0002] 白细胞介素，简称：白介素，（英文名：Interleukin，简写：IL)，又称淋巴细胞 活化因子是人体免疫系统调控的最关键蛋白质分子，目前已经发现有35个白介素。白细 胞介素在传递信息，激活与调节免疫细胞，介导T、B细胞活化、增殖与分化、炎症反应以及 在肿瘤发生过程中起着非常重要的调控作用。白细胞介素在医学研究、新药开发等方面 备受关注，其应用也越来越被重视，比如，白细胞介素-2(IL-2)已被用作抗肿瘤药，据 Global InformationInc.报道去年世界上185家新药研发机构的746项肿瘤药研发项目中 有258个目标药物与白介素-2传递路径相关（IL_2Signaling Pathway in Oncology Drug Pipeline Update2011)，可见白细胞介素应用前景非常看好。
[0003] 目前市场上可获得的白细胞介素主要是通过基因工程生产出来的重组白介素蛋 白。重组蛋白可以通过大肠杆菌表达体系来生产，也可以通过昆虫病毒表达体系或动物细 胞表达体系来生产。大肠杆菌表达体系是具有蛋白表达量高、生产成本低等优点，同时也是 上述几个表达体系中最成熟的应用最广的重组蛋白生产体系。然而，研究表明用大肠杆菌 表达体系生产白介素时存在一个大问题：大部分白介素重组蛋白在大肠杆菌表达体系中以 不可溶的包涵体形式存在。常规情况下，蛋白包函体可以用高浓度变性剂（如8M尿素）来 溶解，然后经过透析复性来获得可溶性蛋白。可是，白介素重组蛋白的包涵体，即使用8M尿 素也难完全溶解，得使用更加苛刻6M盐酸胍来溶解，但通过6M盐酸胍溶解的蛋白，复性比 较困难且效果很差。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的就在于为了解决上述问题而提供一种从包涵体中制备可溶性白介 素重组蛋白的方法及试剂。
[0005] 本发明通过以下技术方案来实现上述目的：
[0006] 本发明一种从包涵体中制备可溶性白介素重组蛋白的试剂，包括洗涤液、菌体裂 解液、包涵体溶解液、蛋白复性液-I和蛋白复性液-II，所述包涵体溶解液由pH值10-12的 Tris-NaOH缓冲液、NaCl、Glycerol、EDTA、2-巯基乙醇和N-十二烷基肌氨酸钠组成。
[0007] 具体地，所述包涵体溶解液由pH值10-12的10-300mM Tris-NaOH缓冲液、 50-300mM NaCl、5-30% Glycerol、2-20mM EDTA、l-30mM2-巯基乙醇和 0? 05-0. 5% N-十二 烷基肌氨酸钠组成。
[0008] 进一步，所述洗涤液由 50mM Tris-HCl pH8、50mM NaCL、5% Glycerol、5mM EDTA、 3_2-巯基乙醇和0. 5 % Tween-20组成；所述菌体裂解液由50mM Tri s-HCl pH8、50mM NaCL、5mM EDTA、3mm2-巯基乙醇和0. 5 % Tween-20组成；所述蛋白复性液-I由50mM Tris-NaOH pHll、50mM NaCL、5%Glycerol、6mM EDTA 和 5mM2-巯基乙醇组成；所述蛋白复 性液-II 由 50mM Tris-HCl pH8、50mM NaCL、5%Glycerol、5mM EDTA、3mM2-巯基乙醇组成。
[0009] 作为一种改进，所述包涵体溶解液中的20mM2-巯基乙醇可采用5mM DTT替代；所 述包涵体溶解液中的0. 5 % N-十二烷基肌氨酸钠可采用0. 05 % SDS替代；所述包涵体溶解 液中的Tris-NaOH缓冲液可采用等pH值的碳酸盐缓冲液替代或磷酸盐缓冲液中的其中一 种替代。
[0010] 本发明一种从包涵体中制备可溶性白介素重组蛋白的方法，其特征在于，包括以 下步骤：
[0011] (1)离心收集经诱导表达白介素的大肠杆菌；
[0012] (2)加入洗涤液，混匀，重悬菌体，离心除去上清；
[0013] (3)加入菌体裂解液，混匀，重悬菌体，在冰上用超声波裂解菌体1-10秒，间歇进 行1-5次（每次间歇1-10秒），离心除去上清；
[0014] (4)加入洗涤液，混勻，重悬蛋白包涵体（可用超声波协助重悬），离心除去上清 (本洗涤步骤可重复2-3次）；
[0015] (5)加入包涵体溶解液,混匀，重悬蛋白包涵体（可用超声波协助重悬），离心收集 上清，将该上清装入透析袋；
[0016] (6)将透析袋放入蛋白复性液-I中透析；
[0017] (7)进一步将透析袋转入蛋白复性液-II中继续透析；
[0018] (8)收集透析袋中蛋白液，便得可溶性白介素重组蛋白；
[0019] (9)检测复性后蛋白含量和纯度。
[0020] 本发明的有益效果在于：
[0021] 本发明是一种从包涵体中制备可溶性白介素重组蛋白的方法及试剂，与现有技术 相比，本发明不含有任何蛋白变性剂，这样有利于后续的蛋白复性；操作简单，可提升可溶 性白介素蛋白得率达90%以上，相对常规使用蛋白变性剂法只能获得5-20%具有明显优 势，具有推广应用的价值。
【专利附图】
【附图说明】
[0022] 图1是尿素变性剂处理包涵体后的各组分SDS-PAGE电泳图；
[0023] 图2是盐酸胍变性剂处理包涵体后的各组分SDS-PAGE电泳图；
[0024] 图3是用本发明包涵体溶解液处理包涵体前后各组分SDS-PAGE电泳图；
[0025] 图4是用本发明所述方法及包涵体溶解液提取包涵体中白介素IL9前后各组分 SDS-PAGE电泳图。
【具体实施方式】
[0026] 下面结合附图对本发明作进一步说明：
[0027] 本发明一种从包涵体中制备可溶性白介素重组蛋白的试剂，包括洗涤液、菌体裂 解液、包涵体溶解液、蛋白复性液-I和蛋白复性液-II，所述包涵体溶解液由pH值10-12 的 Tris-NaOH 缓冲液、50-300mM NaCl、5-30% Glycerol、2-20mM EDTA、l-30mM2-巯基乙醇 和0. 05-0. 5% N-十二烷基肌氨酸钠组成，所述洗涤液由50mM Tris-HCl pH8、50mM NaCL、 5% Glycerol、5mM EDTA、3_2-疏基乙醇和0? 5% Tween-20组成；所述菌体裂解液由50mM Tris-HCl pH8、50mM NaCL、5 % Glycerol、5mM EDTA、3mm2-巯基乙醇和 0? 5 % Tween-20 组成；所述蛋白复性液-I 由 50mM Tris-NaOH pHll、50mM NaCL、5%Glycerol、6mM EDTA 和5mM2-巯基乙醇组成；所述蛋白复性液-II由50mM Tris-HCl pH8、50mM NaCL、5 % Glycerol、5mM EDTA、3mM2_ 疏基乙醇组成。
[0028] 所述包涵体溶解液中的20mM2_巯基乙醇可采用5mM DTT替代；所述包涵体溶 解液中的0.5 % N-十二烷基肌氨酸钠可采用0.05% SDS替代；所述包涵体溶解液中的 Tris-NaOH缓冲液可采用等pH值的碳酸盐缓冲液或磷酸盐缓冲液中的其中一种替代。
[0029] 本发明一种从包涵体中制备可溶性白介素重组蛋白的方法，其特征在于，包括以 下步骤：
[0030] (1)离心收集经诱导表达白介素的大肠杆菌；
[0031] (2)加入洗涤液，混匀，重悬菌体，离心除去上清；
[0032] (3)加入菌体裂解液，混匀，重悬菌体，在冰上用超声波裂解菌体1-10秒，间歇进 行1-5次（每次间歇1-10秒），离心除去上清；
[0033] (4)加入洗涤液，混勻，重悬蛋白包涵体（可用超声波协助重悬），离心除去上清 (本洗涤步骤可重复2-3次）；
[0034] (5)加入包涵体溶解液,混匀，重悬蛋白包涵体（可用超声波协助重悬），离心收集 上清，将该上清装入透析袋；
[0035] (6)将透析袋放入蛋白复性液-I中透析；
[0036] (7)进一步将透析袋转入蛋白复性液-II中继续透析；
[0037] (8)收集透析袋中蛋白液，便得可溶性白介素重组蛋白；
[0038] (9)检测复性后蛋白含量和纯度。
[0039] 实施例一：比较白介素ILlO重组蛋白包涵体在不同溶液中溶解情况：
[0040] A?无变性剂：50mM Tris-HCl (pH8);
[0041] B.本发明包涵体溶解液：50mM Tris-Na0H(pH12);
[0042] C?尿素变性剂：50mM Tris-HCl (pH8)、8M_Urea ;
[0043] D.盐酸胍变性剂：50mM Tris-HCl (pH8)、6MGuanidine ;
[0044] 将大肠杆菌表达的ILlO包涵体洗涤离心后等量分成4份，然后分别加入上述溶 液，充分混匀，重悬蛋白包涵体，用超声波助悬10秒，离心收集上清，测定各上清液中溶解 的ILlO蛋白含量。结果如下表：
[0045]
【权利要求】
1. 一种从包涵体中制备可溶性白介素重组蛋白的试剂，其特征在于：包括洗涤液、菌 体裂解液、包涵体溶解液、蛋白复性液-I和蛋白复性液-II，所述包涵体溶解液由pH值 10-12的Tris-NaOH缓冲液、NaCl、Glycerol、EDTA、2-巯基乙醇和N-十二烷基肌氨酸钠组 成。
2. 根据权利要求1所述的一种从包涵体中制备可溶性白介素重组蛋白的试剂，其特征 在于：所述包涵体溶解液由pH值10-12的10-300mM Tris-NaOH缓冲液、50-300mM NaCl、 5-30% Glycerol、2-20mM EDTA、l-30mM2-巯基乙醇和 0· 05-0. 5% N-十二烷基肌氨酸钠组 成。
3. 根据权利要求1所述的一种从包涵体中制备可溶性白介素重组蛋白的试剂，其特征 在于：所述洗涤液由 50mM Tris-HCl pH8、50mM NaCL、5 % Glycerol、5mM EDTA、3mm2-巯基乙 醇和 0. 5% Tween-20 组成；所述菌体裂解液由 50mM Tris-HCl pH8、50mM NaCL、5mM EDTA、 3_2-疏基乙醇和0.5% Tween-20组成；所述蛋白复性液-I由50mM Tris-NaOH pHll、 50mM NaCL、5% Glycerol、6mM EDTA和5mM2-巯基乙醇组成；所述蛋白复性液-II由50mM Tris-HCl pH8、50mM NaCL、5%Glycerol、5mM EDTA、3mM2-巯基乙醇组成。
4. 根据权利要求3所述的一种从包涵体中制备可溶性白介素重组蛋白的试剂，其特征 在于：所述包涵体溶解液中的20mM2-巯基乙醇可采用5mM DTT替代。
5. 根据权利要求3所述的一种从包涵体中制备可溶性白介素重组蛋白的试剂，其特征 在于：所述包涵体溶解液中的〇. 5% N-十二烷基肌氨酸钠可采用0. 05% SDS替代。
6. 根据权利要求1或2所述的一种从包涵体中制备可溶性白介素重组蛋白的试剂，其 特征在于：所述包涵体溶解液中的Tris-NaOH缓冲液可采用等pH值的碳酸盐缓冲液或磷酸 盐缓冲液中的其中一种替代。
7. -种从包涵体中制备可溶性白介素重组蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 离心收集经诱导表达白介素的大肠杆菌； (2) 加入洗涤液，混匀，重悬菌体，离心除去上清； (3) 加入菌体裂解液，混匀，重悬菌体，在冰上用超声波裂解菌体1-10秒，间歇进行1-5 次（每次间歇1-10秒），离心除去上清； (4) 加入洗涤液，混匀，重悬蛋白包涵体（可用超声波协助重悬），离心除去上清（本洗 涤步骤可重复2-3次）； (5) 加入包涵体溶解液，混匀，重悬蛋白包涵体（可用超声波协助重悬），离心收集上 清，将该上清装入透析袋； (6) 将透析袋放入蛋白复性液-I中透析； (7) 进一步将透析袋转入蛋白复性液-II中继续透析； (8) 收集透析袋中蛋白液，便得可溶性白介素重组蛋白； (9) 检测复性后蛋白含量和纯度。
【文档编号】C07K14/54GK104292325SQ201410363398
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2014年7月28日 优先权日:2014年7月28日
【发明者】邹潮 申请人:哈德逊（天津）生物技术有限责任公司