重新折叠来自包涵体的g-csf的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种用于重新折叠来自包涵体的G-CSF(集落刺激因子）的新方法。特 别地，其涉及一种包括两个重新折叠步骤的方法。本发明涉及一种用于重新折叠G-CSF的 方法，通过（a)溶解G-CSF，（b)氧化性重新折叠（第一重新折叠步骤，在增溶剂的存在下）， (c)除去增溶剂和（d)第二重新折叠步骤（不存在增溶剂）。本发明也涉及一种除去增溶 剂的新方法。
【背景技术】
[0002] 内源性造血生长因子，粒细胞-集落刺激因子（G-CSF，同义词"集落刺激因子3" =CSF3)调节骨髓中祖细胞的增殖和分化以及向外周血中释放成熟中性粒细胞（"嗜中性 粒细胞"）。影响迅速分裂细胞的癌症化疗往往会导致称为"中性粒细胞减少症"的副作用。 中性粒细胞减少症是外周血中的嗜中性粒细胞计数下降并影响多于三分之一接受为了癌 症的骨髓抑制性化疗的患者。中性粒细胞减少症患者可能出现发热（"发热性中性粒细胞 减少")，并且感染的风险增加。像败血症一样，会发生威胁生命的胃肠道和肺部感染。化疗 的后续周期可能被迫延迟，直到病人已经从中性粒细胞减少症中恢复。重组人G-CSF是一 种有效的药用物质，其成功地应用于治疗化疗引起的中性粒细胞减少。其可恢复血液中嗜 中性粒细胞的数量并使其保持高于临界水平（Dale 2002)。
[0003] 天然人G-CSF是一种0糖基化蛋白，由174个氨基酸组成，并且是相对疏水的。 糖基化形式的糖链位于苏氨酸133。除了这种主要形式外，体内可存在另一种具有三个额 外氨基酸的拼接形式（Zsebo 1986)。当重组人G-CSF是在大肠杆菌（E. coli)中表达，可 以观察到如下现象：首先，产生包涵体中的重组蛋白；第二，产生的G-CSF分子缺乏天然 糖链，和第三，重组G-CSF具有额外的N端甲硫氨酸。该G-CSF分子被命名为N-甲硫氨 酰-G-CSF或rmet(hu)G-CSF，其国际非专有名称（INN)为"非格司亭（filgrastim)"，具 有18. 7-18. 9kD的分子量（Welte 1996)。非格司亭的的理论相对质量（Mr)是18. 799。 G-CSF多肽链包含5个半胱氨酸，对非格司亭的结构研宄揭示了在Cys 37-43和Cys 65-75之间有两个二硫键，而未配对的Cys 18仍是还原性的（Wingfield 1988)。市场 上第一款产品是Amgen's Neupogen?，其含有非格司亭，是一种大肠杆菌表达的重组人 met-G-CSF(Welte 1996)。另一种欧盟批准的 G-CSF 产品 Chugai's Granocyte?含有来格 司亭（lenograstim)，其来源于重组哺乳动物（CH0)细胞，并且是糖基化（Holloway 1996)。 此外，Amgen在2002年推出G-CSF的改良产品Neulasta?，其由非格司亭和聚乙二醇的缀合 物组成（INN =聚乙二醇非格司亭）（Molineux 2004)。最后，欧洲几个不同的仿制药制药公 司在最近几年推出了几种Neupogen?的生物类似物。
[0004] 异源重组多肽在转化的微生物中的过表达经常导致形成含有重组蛋白质的所谓 包涵体（IB)。这些包涵体是高折射的、无定形的聚集体，其中的多肽一般是未折叠的、还原 的、非活性的，并且在一般的水性缓冲液中至少部分不溶。本领域描述了从包涵体获得重组 蛋白质的工艺，通常包括细胞的溶解和破裂，随后离心。通常用去污剂洗涤含有高比例包涵 体的沉淀，以去除脂膜、脂多糖（LPS)和其它细胞碎片或污染物。
[0005] 科学文献中提供了许多方法将包涵体从细菌中分离并纯化，以及此后重组蛋白溶 解并重新折叠成其天然状态。（本文所使用的术语"重新折叠"和"复性"同义）。
[0006] 已用到不同的策略溶解重组蛋白质。除了离子型或非离子型去污剂，如十二烷基 硫酸钠（SDS)或N-月桂酰肌氨酸（肌氨酰），离液试剂，如盐酸胍（GuHCl)或尿素，已被用于 溶解感兴趣的蛋白质。溶解常在碱性（pH为8-12. 5)，存在还原剂，如二硫苏糖醇（DTT)、二 硫赤醇（DTE)或 2-疏基乙醇（ME)(Marston 1986，Rudolph 1990，Rudolph 1996，Dietrich 2003)的条件下进行。通常情况下，溶解的蛋白质首先被还原并失活，然后经过重新折叠后 进行层析纯化。
[0007] 例如，EP0219874公开了一种对来自大肠杆菌包涵体的重组蛋白进行重新折叠的 通用方法。为进行溶解，在高pH值使用离液剂盐酸胍和精氨酸。EP0219874描述了在由 GSH/GSSG提供的氧化还原反应条件下二硫键的形成。
[0008] Rudolph 1990中描述了下列顺序的步骤：a)在pH 8-9的还原条件（DTT、DTE或 2-ME)下使用盐酸胍或尿素进行溶解，b)通过透析或凝胶色谱法（S印hadex G-25)去除试 剂，和c)通过氧化重排系统（oxido shuffling systems)或通过蛋白质硫醇的反相化学修 饰形成二硫键（=重折叠），两者都基于加入的GSH/GSSG的效果。
[0009] 另一篇综述（Rudolph 1996)关注了重新折叠过程中使用的添加剂，其可影响未 折叠蛋白、折叠中间体和天然折叠的蛋白质的溶解性和稳定性。作者提出一个通用的基本 方案用于溶解和重新折叠：用pH值为8的6M盐酸胍和100mM DTT溶解。通过透析除去还 原剂，pH调节至4. 5。用含有EDTA和GSH/GSSG、pH为7. 5至8. 5的缓冲液进行高度稀释 (1 : 200)来进行重新折叠。
[0010] Dietrich 2003中用6M盐酸胍在还原条件（DTE)下溶解来自大肠杆菌包涵体的蛋 白质。重新折叠温育被限定在pH 9的存在GSH/GSSG的1M精氨酸之中。用疏水作用色谱 (HIC)并接着用使用SP琼脂糖的阳离子交换层析（CEX)进行最后的纯化。
[0011] 一个可从GE医疗集团2007获得的应用笔记（应用笔记18-1112-33,1-4)也综述 了通用方案。其中建议用8M尿素或6M盐酸胍。提到了缓慢透析或近中性pH值下稀释来 进行重新折叠。或者，可以使用层析步骤进行重新折叠。所建议的取代透析或稀释的层析 方法包括排阻色谱法（SEC)、离子交换色谱（IEX)和疏水作用色谱（HIC)。
[0012] W000/02901描述了一种通过在重新折叠罐中施加高压而进行重新折叠的一般方 法。任选地，离液剂和/或氧化还原剂（DTT/GSSG)存在于重新折叠缓冲液中。
[0013] 从二十世纪80年代开始，开发生产生物学活性的重组G-CSF的方法经历了很长 的历史。大多数出版物描述的是利用大肠杆菌生产。在该宿主中，G-CSF可以良好地表 达并在包涵体中正常积累。使用的其它表达系统例如CH0细胞（Holloway 1994)、人细胞 (W001/04154)或酵母（US5055555)。
[0014] 28613〇 1986中描述了用2%肌氨酰溶解6-03?并通过4￡乂和0￡乂色谱法纯化可溶 性 G-CSF。
[0015] W087/01132中描述了来源于大肠杆菌的人G-CSF (非格司亭）。其中描述了两种可 供选择的重新折叠/纯化方法：工艺1):用1%月桂酸（一种饱和C15脂肪酸）溶解G-CSF 并用40以11(：11304进行氧化，随后在04材料上进行即^：-纯化。工艺2):用2%肌氨酰溶 解并用20yM &^04进行氧化，丙酮沉淀G-CSF，再用6M盐酸胍溶解，在此条件下未折叠。 通过凝胶色谱法去除盐酸胍（Sephadex G-25,重新折叠步骤），随后的色谱是CEX (CM-纤维 素），接着是最终的排阻色谱法（SEC，S印hadex G-75)。
[0016] Devlin 1988使用了另一种可选择的增溶剂，其用10%的SDS溶解IB-沉淀，并通 过 SEC(S印hacryl S-200,0. 1% SDS 中）纯化 SDS 溶解的（SDS-loaded)G-CSF，接着是反相 高压液相色谱（RP-HPLC法，Vydac C4)。
[0017] 这些早期出版物集中在构建适当的表达系统并得到纯化的物质以进行G-CSF的 进一步表征，而不是提供适合商业化大规模生产重组G-CSF的重新折叠和纯化工艺。W0 89/10932公开了一种更先进的工艺，其描述了来自大肠杆菌IB的人和牛G-CSF的纯化方 法。用清洁剂（脱氧胆酸盐）处理IB以提取污染物。用肌氨酰溶解G-CSF。用CuS04进行 氧化。进一步的处理描述于Lu 1992and Heidari 2001中。
[0018] 已公开了上述用于溶解和氧化重新折叠的方法的几种可替换方案，包括 W089/10932中使用2%肌氨酰/40uM CuS04的方法。这些策略大多数遵循经典的通用溶解 方法（Marston 1986、Rudolph 1990、Rudolph 1996,参见上文），用诸如盐酸胍和尿素的强 变性剂在还原条件以及碱性pH值下完全断裂氢键。特别是最近的出版物优选对盐酸胍-或 尿素溶解的G-CSF进行重新折叠。
[0019] 例如，Wingfield 1988中描述了纯化野生型G-CSF和来自大肠杆菌IB的突 变蛋白。用6M盐酸胍进行溶解。于SEC(S印hacryi 3200)上在4M盐酸胍的存在下对 未折叠蛋白进行第一次纯化。随后氧化G-CSF并通过3M尿素中透析而重新折叠，并用 CEX(CM-Sepharose)和 SEC(Ultrogel AcA54)进行进一步纯化。
[0020] Kang 1998的论文描述了在大肠杆菌中以IB表达的N-甲基-hu-G-CSF。在碱 性条件下用2M尿素溶解G-CSF。通过稀释以及室温下温育16h启动重新折叠。随后pH 降低到PH5. 5,并除去出现的沉淀物。接着先后进行两次色谱层析，首先是CEX步骤（SP Sepharose)，接着是使用多聚缓冲液（polybuffers)的色谱聚焦步骤（PBE94)。
[0021] W098/53072中公开了一种N-末端具有小前导肽的G-CSF，其在大肠杆菌中表达而 未切割信号肽，从而以IB积累。在还原条件（10mM DTT)于8M尿素中进行溶解。对溶解的 G-CSF进行AEX(DEAE-Sepharose)处理，然后进行SEC(Sephacryl 200)。其描述的氧化性 重新折叠包括一个相当短的温育期，存在2mM谷胱甘肽。
[0022] 在另一出版物（Wang 2005)中，以8M的尿素并伴随lOOmM 2-ME和5mM EDTA在pH8 下进行溶解。随后的AEX色谱法（Q-Sepharose)中，进行与基质结合的重新折叠。G-CSF结 合于柱上，在保持结合状态的同时降低流动相中的尿素浓度。该缓冲液含有GSH/GSSG，而洗 脱的G-CSF是具有生物学活性的。进一步的方法在W001/87925和W02004/015124中描述。
[0023] W02004/001056公开了一种方法，包括在pH 8下先温育6小时，随后在pH 4-5下 再温育6-8小时。
[0024] W02006/097944描述了用尿素或盐酸胍（2-6M)在碱性pH(8-ll)下溶解IB，酸性 pH下室温稀释后，重新折叠6-16小时。
[0025] W02006/135176涉及为随后的聚乙二醇化而纯化的G-CSF突变蛋白。该G-CSF变 体在大肠杆菌中表达，并通过使用8M尿素在pH 11下从IB溶解。通过在2M尿素和50mM 甘氨酸中稀释并在pH 9下温育过夜而进行重新折叠。
[0026] EP1630173公开了一种分离并重新折叠来自大肠杆菌的IBG-CSF(非格司亭）的方 法。该方法是基于用变性剂，优选盐酸胍进行提取。在GSH/GSSG的存在以及高pH和低温 下进行重新折叠。
[0027] EP1837346描述了分离、重新折叠和纯化在大肠杆菌的IBS中表达的G-CSF(非 格司亭）的方法。盐酸胍用于溶解，在GSH的存在下进行重新折叠。随后用凝胶色谱法 (S印hadexG-25)去除变性剂和缓冲液。
[0028] Rao 2008中描述了一种生产来自大肠杆菌IB的G-CSF的工艺。IBs被溶解于异 常高pH值（pH值12-12. 8)下的含有25mM的半胱氨酸的2M尿素中。
[0029] Vanz 2008中也描述了类似的溶解、重新折叠和纯化G-CSF(非格司亭）的方法。
[0030] Khalilzadeh 2008建议对上述使用肌氨酰/&^04的方法进行调整。用8M尿素对 洗涤后的IB进行溶解。通过逐级透析的方法进行重新折叠，尿素从8M降低到0M。&^04的 浓度范围从5-60 yM，最适浓度显示为40 yM。色谱序列由三个步骤组成，AEX(DEAE)，接着 HIC (丁基），最后是 SEC (S印faadex G-25)。
[0031] W02008/096370还描述了来自大肠杆菌IB的huG-CSF的重新折叠和纯化。用尿素 在DTT存在且pH升高到12-12. 5的条件下进行溶解。
[0032] 最后，W02010/146599公开了用6M盐酸胍溶解，并用DTT还原G-CSF。为进行重新 折叠而配制了一种复合缓冲液，其组成为2M尿素、0. 1M精氨酸、10%的蔗糖、2mM EDTA，并 包含诸如l〇mM Na-抗坏血酸/二氢抗坏血酸/DTT或GSH/GSSG或半胱氨酸/胱氨酸（氧 化还原剂（redox))。
[0033] 对从包涵体获得G-CSF的新方法仍有持续的需求。
[0034] 发明概述
[0035] 本发明涉及一种用于将从包涵体提取的重组粒细胞集落刺激因子（G-CSF)重新 折叠成生物学活性分子的新方法。该方法包括用增溶剂溶解G-CSF，在该增溶剂的存在下对 G-CSF进行氧化和部分重新折叠，有效地除去该增溶剂，以及在没有增溶剂的条件下完成重 新折叠。本发明公开了从部分重新折叠的G-CSF中分离增溶剂的各种方法。
[0036] 本发明人惊奇地发现，两个重新折叠步骤的组合显著提高了正确折叠的G-CSF的 产量。
[0037] 本发明也公开了重新折叠来自包涵体重组粒细胞集落刺激因子（G-CSF)的新方 法。该方法包括两个重新折叠步骤。特别是，该方法包括用增溶剂溶解G-CSF，在增溶剂与 一种氧化剂的存在下对G-CSF进行氧化性重新折叠（第一重新折叠步骤），有效地除去增溶 剂，在不存在增溶剂的条件下完成G-CSF重新折叠的第二重新折叠步骤。本发明描述了从 部分重新折叠的G-CSF中有效分离增溶剂的各种方法。本发明进一步提供了使用离子交换 层析随后纯化重新折叠的G-CSF的工艺。
[0038] 所有引用的参考文献以其全文引入本发明。
[0039] 在一方面，本发明提供了 一种重新折叠来自包涵体的粒细胞集落刺激因子 (G-CSF)的方法，包括：
[0040] a)在存在增溶剂的条件下溶解G-CSF ;
[0041] b)进行氧化和第一重新折叠步骤，其包括在存在氧化剂和增溶剂的条件下温育溶 解的G-CSF ;
[0042] c)通过离子交换树脂的吸附和/或离子交换色谱法除去增溶剂，和任选地进行酸 沉淀；和
[0043] d)进行第二重新折叠步骤，其包括在没有增溶剂的条件下稀释并温育步骤c)的 G-CSF〇
[0044] 包涵体可从微生物中获得，优选为大肠杆菌。G-CSF可以是重组牛或人G-CSF，可 以是牛或人甲硫氨酰-G-CSF。增溶剂可以是N-月桂酰肌氨酸（N-Lauroylsarcosin)。氧 化剂可以是CuS04。G-CSF的溶解可在高于pH 7的pH值下进行。
[0045] 在一些实施方案中，增溶剂是浓度为约0. 5%到约1. 5%的N-月桂酰肌氨酸。
[0046] 在一些实施方案中，氧化和第一重新折叠步骤进行至少两小时。在一些实施方案 中，氧化和第一重新折叠步骤是在通气的条件下进行且不冷却。在一些实施方案中，氧化和 第一重新折叠步骤是在约7-9的pH值，并在约20-28°C的温度下进行约15-25小时。
[0047] 在一些实施方案中，上述步骤（c)中的除去增溶剂包括：AEX(阴离子交换）和 CEX(阳离子交换），任选按照该顺序。在一些实施方案中，上述步骤（c)中的除去增溶剂包 括：
[0048] a)通过将G-CSF溶液与悬浮树脂材料混合而结合阴离子交换树脂材料，并通过过 滤去除树脂材料，和/或
[0049] b)在所述增溶剂与树脂结合而G-CSF保留在流过物（flow through)中的条件下 进行离子交换层析，和/或
[0050] C)在G-CSF与树脂结合而所述增溶剂保留在流过物中的条件下进行离子交换层 析。
[0051] 在一些实施方案中，增溶剂和其它杂质通过依次使用下列步骤而去除：AEX、酸沉 淀、AEX 和 CEX。
[0052] 在一些实施方案中，增溶剂和其它杂质通过依次使用下列步骤而去除：
[0053] a)通过将G-CSF溶液与悬浮树脂材料混合而使增溶剂与阴离子交换树脂材料结 合，并通过过滤去除树脂材料，
[0054] b)通过将pH降低到低于pH 5而将杂质沉淀，并通过过滤去除沉淀；
[0055] c)在剩余增溶剂与树脂结合而G-CSF保留在流过物中的条件下进行阴离子交换 层析；
[0056] d)在G-CSF与树脂结合而剩余增溶剂保留在流过物中的条件下进