定方法是基于对NFS 60细胞的增殖变化的比较，该细胞来源于小鼠成骨髓细胞系。用系列 稀释的测试样品和参比溶液平行处理NFS-60细胞。NFS-60细胞的增殖可被G-CSF显著并 特异性刺激。细胞繁殖在微量板上进行72小时。通过使用可被活细胞转化成荧光染料试卤 灵的底物刃天青<alamar?Blue>检测增殖效果。高灵敏度检测荧光信号。剂量响应曲线用 平行线测定法计算，在该曲线的直线部分具有至少三个点，该计算被用作统计评估。可接受 的范围是参比溶液的80 %至125%。相对效价由国际单位（IU)表示，其是由内部标准经国 际卫生组织对非格司亭的标准校准而定义。具有完全活性的纯的人G-CSF具有1.0X108IU/ mg的特定生物学活性。
[0307] 实施例13. 9-肽作图：[Ph.Eun 7, 2. 2. 55]。质谱（MS)分析之前的肽作图用于分 析二硫键。肽键酶法分析程序是在欧洲药典关于非格司亭专论的基础上发展起来的。用于 切割的蛋白酶是谷氨酰内肽酶（EndoGlu-C)。温育在37°C下进行24小时，停止温育，加入 8M盐酸胍及煮沸。肽作图步骤在还原性和非还原性条件下进行。对还原和非还原条件下肽 谱的MS质谱差异证实二硫键的位置。完全折叠完好的G-CSF(非格司亭）有两个二硫键， 位于Cys37_Cys43和Cys65_Cys75,而18位的一个半胱氨酸残基是未成对的。
[0308] 可选的，蛋白水解消化后从G-CSF样品获得的肽在RP-HPLC系统中分离并进行紫 外检测。此方法提供将供试品溶液中得到的指纹样色谱与参比物质中获得的色谱图进行比 较得到的比较数据。
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【主权项】
1. 一种重新折叠来自包涵体的粒细胞集落刺激因子（G-CSF)的方法，其包括： a) 在增溶剂的存在下溶解G-CSF ; b) 进行氧化和第一重新折叠步骤，包括在存在氧化剂和增溶剂的条件下温育溶解的 G-CSF ； C)通过离子交换树脂吸附和/或离子交换色谱法除去增溶剂，和任选地进行酸沉淀； 和 d)进行第二重新折叠步骤，包括稀释并温育步骤（C)的G-CSF。
2. 根据权利要求1的方法，其中所述包涵体来自微生物，优选地，来自大肠杆菌。
3. 根据权利要求1或2的方法，其中所述G-CSF是重组牛或人甲硫氨酷-G-CSF。
4. 根据前述任一项权利要求的方法，其中所述增溶剂是N-月桂酷肌氨酸。
5. 根据前述任一项权利要求的方法，其中所述氧化剂为化SO 4。
6. 根据前述任一项权利要求的方法，其中G-CSF的溶解在大于抑7的抑值进行。
7. 根据前述任一项权利要求的方法，其中所述增溶剂是浓度为约0. 5%至约1. 5%的 N-月桂酷肌氨酸。
8. 根据前述任一项权利要求的方法，其中所述氧化和第一重新折叠步骤进行至少两小 时。
9. 根据前述任一项权利要求的方法，其中所述氧化和第一重新折叠步骤在通气且不冷 却下进行。
10. 根据前述任一项权利要求的方法，其中所述氧化和第一重新折叠步骤是在约7-9 的抑值和/或在约20-28°C的温度进行，和/或进行约15-25小时。
11. 根据前述任一项权利要求的方法，其中步骤（C)中的除去增溶剂包括AEX和CEX， 任选地，按照此顺序。
12. 根据前述任一项权利要求的方法，其中步骤（C)中的除去增溶剂包括： a) 通过将G-CSF溶液与悬浮树脂材料混合而结合阴离子交换树脂材料，并通过过滤除 去树脂材料，和/或 b) 在所述增溶剂与树脂结合而G-CSF保留在流过物中的条件下进行离子交换层析，和 /或 C)在G-CSF与树脂结合而所述增溶剂保留在流过物中的条件下进行离子交换层析。
13. 根据前述任一项权利要求的方法，其中通过顺序应用下列步骤除去所述增溶剂和 其它杂质： (i) AEX, (ii) 酸沉淀， (iU)AEX，和 (iv)CEXo
14. 根据前述任一项权利要求的方法，其中通过顺序应用下列步骤除去所述增溶剂和 其它杂质： a) 通过将G-CSF溶液与悬浮树脂材料混合使促溶剂与阴离子交换树脂材料结合，并通 过过滤除去树脂材料， b) 通过将抑降低到低于抑5使杂质沉淀，并通过过滤除去沉淀； C)在剩余增溶剂与树脂结合而G-CSF保留在流过物中的条件下进行阴离子交换层析； d) 在G-CSF与树脂结合而剩余增溶剂保留在流过物中的条件下进行阳离子交换层析； 和 e) 通过使用抑或盐浓度增加的洗脱缓冲液进行逐步或梯度洗脱，从阳离子交换树脂 洗脱结合的G-CSF。
15. 根据前述任一项权利要求的方法，其中所述第二重新折叠步骤在低电导率缓冲液 中和/或在冷却条件下进行，和/或进行多于12小时。
16. 根据前述任一项权利要求的方法，其中所述第二复性步骤在低于2. OmS/cm的电导 率，和/或在约2-8°C的温度进行，和/或进行至少24小时。
17. 根据前述任一项权利要求的方法，其中所述第二重新折叠步骤在高于pH 7的抑值 进行。
18. 根据前述任一项权利要求的方法，其中该方法还包括精制步骤，其包括一个或多个 离子交换层析。
19. 根据权利要求18的工艺，其中所述精制步骤中的一个或多个离子交换层析包括阴 离子交换层析W及随后的阳离子交换层析。
20. -种用于纯化G-CSF的和/或除去增溶剂的工艺，所述增溶剂用于溶解来自包涵体 的G-CSF，所述工艺包括W下步骤： a) 在G-CSF与树脂结合的条件下进行阴离子交换层析； b) 通过使用抑降低或盐浓度增加的洗脱缓冲液的逐步或梯度洗脱，将结合的G-CSF洗 脱； C)在G-CSF与树脂结合的条件下进行阳离子交换层析； d)通过使用抑或盐浓度增加的洗脱缓冲液的逐步或梯度洗脱将结合的G-CSF洗脱； 其特征在于，所述阴离子和阳离子交换树脂的骨架聚合物均包含甲基丙締酸醋衍生 物。
【专利摘要】本发明公开了重新折叠来自包涵体的重组粒细胞集落刺激因子(G-CSF)的新方法。该方法包括两个重新折叠步骤。具体而言，该方法包括用增溶剂溶解G-CSF、在增溶剂和氧化剂的存在下氧化性重新折叠G-CSF(第一重新折叠步骤)、有效去除增溶剂以及在没有增溶剂的条件下进行第二重新折叠步骤以完成G-CSF的重新折叠。本发明描述了各种从部分重新折叠的G-CSF有效去除增溶剂的方法。
【IPC分类】C07K14-435
【公开号】CN104540846
【申请号】CN201380015531
【发明人】F·费尔弗尔迪, A·鲍洛吉, J·贝奇
【申请人】吉瑞工厂
【公开日】2015年4月22日
【申请日】2013年3月18日
【公告号】CA2867796A1, EP2828287A2, US20150057439, WO2013068603A2, WO2013068603A3