5] e)在G-CSF结合于树脂的条件下进行阴离子交换层析；和
[0246] f)通过使用pH降低或盐浓度升高的洗脱缓冲液的逐步或梯度洗脱来洗脱结合的 G-CSF ;和
[0247] g)在G-CSF结合于树脂的条件下进行阳离子交换层析；和
[0248] h)使通过用pH或盐浓度升高的洗脱缓冲液的逐步或梯度洗脱来洗脱结合的 G-CSF〇
[0249] "降低/升高pH值"或"升高盐浓度"是指用于洗脱的缓冲液与柱平衡、样品装载 和洗涤的缓冲液相比。
[0250] 关于AEX和CEX，合适的材料和条件已在上文讨论。在优选的实施方案中，该方法 的特征在于，所述阴离子和阳离子交换树脂的骨架聚合物均包括甲基丙烯酸酯的衍生物。
[0251] 在一些实施方案中，AEX树脂的官能团是二乙氨乙基（DEAE)基团。
[0252] 在一些实施方案中，CEX的树脂的官能团是羧甲基（CM)基团。
[0253] 在一些实施方案中，阴离子和阳离子交换树脂的骨架聚合物不包含交联的琼脂 糖，诸如 Sepharose?。
[0254] 在优选的实施方案中，AEX和/或CEX阴离子和/或阳离子交换树脂的骨架聚合 物包括甲基丙烯酸酯的衍生物。
[0255] 在更优选的实施方案中，AEX树脂是DEAE Macro-Pr印(BioRad)，CEX树脂是 Toyopearl CM-650(Tosoh)〇
[0256] 在一些实施方案中，AEX柱以pH值高于7的低电导率缓冲液平衡，优选用10mM的 Tris-HCl/pH8。
[0257] 在一些实施方案中，G-CSF是从CEX柱上通过提高盐的浓度洗脱下来，盐浓度优选 具有梯度，最优选具有线性梯度。优选通过具有线性NaCl梯度的Tris-HCl/pH 8缓冲液进 行洗脱。
[0258] 在一些实施方案中，在CEX步骤之前，调节从AEX柱上洗脱的G-CSF的pH值，优选 将pH调节至低于5. 5,最优选至（约）pH 4. 5。优选的，从AEX柱上洗脱的G-CSF用水进行 2倍稀释，用50%的乙酸通过滴定将pH调节到（约）4. 5。
[0259] 在一些实施方案中，CEX柱用pH低于5. 5的低电导率缓冲液平衡，优选用20mM的 乙酸钠/pH 5. 3。
[0260] 在一些实施方案中，G-CSF是从CEX柱上通过提高盐的浓度洗脱下来，盐浓度优选 具有梯度，最优选具有线性梯度。
[0261] 优选用pH 5. 3的醋酸钠线性梯度将G-CSF从CEX柱上洗脱。
[0262] 在优选的实施方案中，G-CSF是根据图2的纯化方案公开的步骤顺序从IBs上溶 解下来、重新折叠并纯化。
[0263] 在本发明的一些实施方案中，精制后最终纯化的G-CSF是由凝胶色谱法制备，优 选使用 Sephadex G-25。
[0264] 在一些实施例中，配制的缓冲液中含有山梨醇及聚山梨醇酯；更优选的，该配制缓 冲液包含10mM乙酸钠/pH 4/5% (w/v)的山梨醇/0.006% (w/v)的聚山梨醇醋80。
【附图说明】
[0265] 图1描述了两步重新折叠的策略，包括任选的为生产生物学活性G-CSF而进行的 下游精制步骤。进一步的细节在实施例中公开。
[0266] 图2公开了一种优选实施方案，即从含有G-CSF的包涵体开始直到G-CSF的完全 重新折叠和纯化的起始的顺序步骤。进一步的细节在实施例中公开。
[0267] 图3对作为对照的可商购的非格司亭药用产品的纯度分析的SEC-HPLC色谱图 (3A)与根据图2中总结的顺序纯化的产品的色谱图（3B)进行了比较。进一步细节在实施 例中详细地描述。
[0268] 表格说明
[0269] 表1列出了两步重新折叠的优选条件。第一重新折叠温育中的浓度是用水对溶解 的G-CSF进行二倍稀释而产生的。第二重新折叠温育缺少第一重新折叠中的试剂肌氨酰和 CuS04。进一步的细节在实施例中提及。
[0270] 表2显示了由650克洗净且冷冻的包涵体开始的三批生产的纯度和产率。产率的 计算参考包涵体的湿重。最终的纯度由RP-HPLC中排除产品相关物质（G-CSF的异构体） 与产品相关杂质的影响的主峰面积行计算。进一步的细节在实施例中提及。
[0271] 表3显示了 G-CSF纯化过程中的总纯度以及两个选定的过程相关杂质（肌氨酰， 内毒素）的值。所示范围指示了采用不同的分析方法获得的三个G-CSF的生产批次的分析 结果。进一步的细节在实施例中提及。
[0272] 表4显示了用不同的方法对三个后续G-CSF的生产批次的特定杂质和生物学活性 分析结果。这些数据取自常规批次释放检验。进一步的细节在实施例中提及。 实施例
[0273] 实施例1 :发酵和表达
[0274] G-CSF(非格司亭）通过重组大肠杆菌C2523T7pol pRG/GCSFa克隆（一种转化 了含G-CSF表达载体的大肠杆菌）制备。在无菌条件下，将来自液氮存储的工作细胞库小 瓶中的0. 10-0. 15cm3细胞悬浮液接种到种子培养基中。将接种的种子培养瓶放在回转摇 床培养箱中于37°C下以185rpm的转速培养24-28小时。当六个摇瓶培养在600nm光密度 (0D)平均值达到0. 9-1. 1时，将摇瓶中的培养物收集到装有一只硅胶管的无菌5dm3玻璃烧 瓶中。用WM323U/R泵将收集的3dn/量的种子培养物转移到100dm 3发酵罐，该罐用无菌补 充生产培养基填充至75dm3 (GBA，以甘油为碳源的合成培养基）。在严格好氧条件下于37°C 下进行深层培养，当培养基中的碳源耗尽时，以适当的速率向培养物中加入甘油补料液。将 整个培养期间的溶解氧量保持在不低于30%的水平。当培养物的0D值达到30时，温度降 低到32°C，加入0. 33mM IPTG来诱导G-CSF的表达。进一步培养细菌5小时直至0D值为 80-95,以生产 G-CSF。
[0275] 实施例2 :细菌的收获
[0276] 停止搅拌、通气和添加碳源，将培养物冷却至低于15°C，通过llOOOg下离心收获 细菌。细胞沉淀在转子中，水洗所述细胞（释放电荷）。收集细菌细胞的浓缩物，用水将其 稀释回原来的一半体积，加入〇. 5M NaH2P04至终浓度为10mM。湿菌体的总质量（生物量） 为约 10-11. 5kg。
[0277] 实施例3 :细菌裂解和包涵体的制备
[0278] 将分离并洗涤的细菌经三次通过匀浆器而使其在压力（lOOMPa)下破碎。在分离 器中以llOOOg转速通过沉淀使包涵体从细胞碎片中分离。沉淀的包涵体通过洗涤缓冲液 释放电荷，所述缓冲液含有5mM的DTT，10mM NaH2P04,5mM的EDTA，和2%吐温20, pH 7. 2。 用同样的缓冲液对该浓缩IB悬浮液进行2倍稀释，并再次沉淀。使用10mM NaH2P04缓冲液 重复两次洗涤步骤，在第二次洗涤结束时无需稀释。IB的最终沉淀物冷冻贮存在_80°C下。
[0279] 实施例4 :包涵体的溶解
[0280] 将冷冻包涵体（湿重650克）解冻，并溶解在含有40mM Tris-HCl，pH8和1% (w/ v)N-月桂酰肌氨酸（肌氨酰）的溶解缓冲液中，总体积为32. 5dm3。将悬浮液室温下连续 搅拌培养。
[0281] 实施例5 :氧化性重新折叠（第一次重新折叠）
[0282] 用水对溶解的IB悬浮液进行2倍稀释，在65dm3的总体积下形成0. 5%的肌氨酰 和20mM Tris-HCl的最终浓度。添加CuS04加到终浓度40uM。将G-CSF氧化并部分重新折 叠，其间连续搅拌并对顶部空间通气，在室温下进行至少20小时。通过加入终浓度为ImM 的EDTA而终止氧化。
[0283] 实施例6 :通过AEX分批吸收而去除肌氨酰
[0284] 在分批模式中，将肌氨酰吸附到阴离子交换（AEX)树脂上。以每克肌氨酰使用20g AG 1-X8树脂（BioRad公司，美国）的量将其加入溶液。将悬浮液搅拌两小时以结合大部 分肌氨酰。树脂经l〇〇um孔径的尼龙过滤袋网过滤除去。用随后的纯化步骤（实施例7和 8)将滤液中剩余的肌氨酰从产物中完全除去。
[0285] 实施例7 :在酸性pH下沉淀污染物
[0286] 通过pH4. 3-4. 5下的酸沉淀将一些杂质轻易除去，而G-CSF仍然保持溶解。通过加 入终浓度1M尿素防止G-CSF发生任何潜在的非特异性和不希望的共沉淀。尿素由6M原液 提供，并以ldm3/min的速率缓慢加入到实施例6的滤液中。随后，加入1/20体积的pH4. 8 的1M醋酸钠降低pH值。用50%乙酸滴定将pH进一步降低至4. 3-4. 5。沉淀至少一小时。 然后将沉淀物经深层过滤器（Pall公司K700/KS50双层）过滤除去。
[0287] 例8 :通过串联AEX+CEX色谱去除剩余肌氨酰并置换缓冲液
[0288] 将50mM/pH 4. 5的乙酸钠缓冲液用于平衡1)装有DEAE Macro-Pr印(Bio-Rad， 旧八)4￡乂树脂的4(11113柱，和2)装有1'〇7(^631'15?-650(：(1'〇8〇11，日本）0￡乂树脂的8(1111 3柱。 两个柱直接串联连接到AKTA过程色谱系统（GE Healthcare，瑞典）上。通过0.2um无菌 过滤器清洁后，将实施例7的滤液装入的第一根柱。残留的肌氨酰结合到DEAE树脂上，而 G-CSF保持未结合（非结合模式）并出现在第一根柱的流过物中。将该流过物直接载入结 合G-CSF (结合模式）的第二根柱（SP树脂）。用20mM Tris-HCl/pH 8进行简单的梯度洗 脱而将G-CSF从树脂上解吸。除了去除残留肌氨酰，通过该方法也实现了将缓冲液由乙酸 钠 /pH 4. 5 置换为 Tris-HCl/pH 8。
[0289] 实施例9 :二次重新折叠（完成折叠）
[0290] 在这个阶段中，完成了大约一半的蛋白质流分的折叠，而其余的蛋白质不完全折 叠或错误折叠。用20mM的Tris-HCl，pH 8将G-CSF溶液从Toyopearl SP-650C上洗脱，并 通过0.2um无菌过滤器进入一个不锈钢容器中。将过滤后的溶液用水稀释2倍。蛋白质折 叠的第二温育（第二重新折叠）在低电导率的环境中（< lmS/cm)，在pH 8、2-8°C的冷却 下进行32-42小时。
[0291] 实施例10 :通过AEX色谱纯化（精制步骤1)
[0292] A 柱中装入 DEAE Macro-Pr印（Bio-Rad，美国），并用 10mM 的 Tris-HCl/pH8 平衡。 将来自第二次重新折叠（实施例9)的溶液装入DEAE柱。用10mM Tris-HCl/pH 8中的 0mM-200mM的递增线性NaCl梯度洗脱正确折叠的G-CSF。合并洗脱的G-CSF，并用水稀释2 倍。用50 %乙酸滴定将pH值至4. 5。
[0293] 实施例11 :通过CEX色谱纯化（精制步骤2)
[0294] 对于最终精制步骤，将从AEX色谱（实施例10)收集到的由正确折叠蛋白组成的 G-CSF合并物直接载入填充了 Toyopearl CM-650S树脂的CEX柱。该柱用pH 5. 3的20mM 醋酸钠进行平衡。用在24倍柱体积以内的pH 5.3的20mM到40mM乙酸钠的递增线性盐梯 度洗脱结合的G-CSF。收集含有纯G-CSF的流分并合并用于配制（formulation)。
[0295] 实施例12 :用凝胶色谱法配制纯化的G-CSF
[0296] 将从CEX柱洗脱的纯化G-CSF (实施例11)通过0. 2um无菌过滤器过滤，并通过装 有S印hadex G-25细树脂并经配制缓冲液（10mM乙酸钠，pH4,5%山梨糖醇，和0? 006%聚 山梨醇酯80)平衡的14dm3柱。相同的缓冲液也用作洗脱（running)缓冲液。用配制缓冲 液洗脱空隙中的G-CSF。对于整个批次（35-48g G-CSF)，在S印hadex G-25进行三个随后 的制备，每个使用三分之一的CEX过滤洗脱物。通过用配制缓冲液的稀释将所配制的G-CSF 浓度调节至〇. 9-1. 0mg/ml，并最终用0. 2 y m的无菌过滤器胶囊过滤。配制的G-CSF作为无 菌溶液是非常稳定的，可以在2-8°C下储存即使没有数年也有很多个月。
[0297] 实施例13 :分析方法
[0298] 按照欧洲药典（Ph. Eur.)实施公知的标准分析方法，该药典包含一篇描述非格司 亭特定分析方法的专论（欧洲药品与卫生保健质量管理局（European Directorate for the Quality of Medicines&Health Care，EDQM) (2010):非格司亭浓缩溶液，欧洲药典 7.0, 2015-2018)。对于基本技术，该专论与药典的其他章节相互参照。这些可参考的特定 章节，提供了该技术更为详细的描述，并被引用在以下实施例的方括号中。这些应用的参考 标准是可商购且欧盟批准作为药用的授权药品（非格司亭），或是使用这些商用参考进行 了校正的内部标准。对于按照国际单位（IU)的相对效能的分析，另外使用了世界卫生组织 (WHO)的国际G-CSF标准。用于分析纯度、特定杂质、G-CSF-相关蛋白和生物学活性（效 能）的测试方法按照欧洲药典的专论进行，只做很少修改。因此，在下文中，对这些本领域 已知的标准分析方法只作简要描述。
[0299] 实施例 13. 1-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE) : [Ph. Eur. 7, 2. 2. 31]。SDS-PAGE 电泳用于测定分子大小、G-CSF的同一性以及纯度。凝胶有12%的聚丙烯酰胺（PA)并包括 十二烷基硫酸钠（SDS)。该方法在还原性和非还原性条件下使用。凝胶用Sypro ruby染 色。为了计算出相对分子质量（Mr)，使用具有确定质量的标记蛋白的标记板。
[0300] 实施例 13. 2-高效体积排阻色谱法（SEC-HPLC) : [Ph. Eur. 7, 2. 2. 30]。用 SEC 检 测分子量高于非格司亭的杂质或G-CSF相关物质（二聚体、聚集体）。蛋白的检测是基于 紫外吸收。纯度（主峰）和杂质（二聚体、聚集体）表示为活性物质中每个组分的面积％。 由重复测定的平均值计算检测结果。图3显示了一个纯化的G-CSF批次（3B)与参考标准 (3A)比较的SEC色谱图的示例。聚集体的痕迹可见于主峰的左边。主峰右边的峰是由溶剂 而非杂质所引起的。
[0301] 实施例 13. 3-反相高压液相色谱（RP-HPLC) : [Ph. Eur. 7, 2. 2. 29]。RP-HPLC 用于 确定G-CSF的同一性，以计算G-CSF的含量和纯度。该方法也被用于对产品相关物质进行鉴 别和定量。蛋白的检测基于紫外吸收。相关的蛋白杂质表示为在活性物质中的百分比（面 积％)。由重复测定的平均值计算检测结果。
[0302] 实施例13. 4-等电聚焦凝胶电泳（IEF) : [Ph. Eur. 7, 2. 2. 54]。该方法用于检测与 G-CSF具有不同电荷的杂质或产品相关物质（例如脱酰胺的G-CSF)。分离是在含有基于两 性电解质的固定化pH梯度的聚丙烯酰胺凝胶中进行。此外，用一组具有确定等电点（PI) 的标记蛋白对各蛋白带的PI进行计算。
[0303] 实施例13. 5-酶联免疫吸附测定（ELISA):该方法用于定量测定大肠杆菌宿主细 胞蛋白（HCP)的水平。该试验是通过使用可商购（通用的）免疫性酶分析试剂盒（Cygnus Technologies，no. F410)来进行。微量滴定条的固相包被有亲和纯化的抗大肠杆菌多克隆 抗体，其捕获来自测试样品的HCP。辣根过氧化物酶（HRP)标记的抗大肠杆菌抗体示踪剂同 时结合到HCP上，产生的三明治结构可以承受洗涤步骤。结合的HCP以及HRP分别通过底 物四甲基联苯胺（TMB)在过氧化氢存在下的氧化反应进行检测。光密度用ELISA读数器测 定。用在不同浓度下测量HCP校准物（由试剂盒提供）得到的校正曲线进行定量。所述方 法完全按照供应商的说明书进行。HCP浓度表示为ng/ml或ng/mg(ppm)。
[0304] 实施例13. 6-定量聚合酶链反应（qPCR):该试验用于测定大肠杆菌宿主细胞中的 DNA。使用一种称为"resDNASEQ?大肠杆菌残余DNA定量系统"的市售试剂盒，它是基于实 时TaqMan? qPCR技术（Applied Biosystems)。该方法非常灵敏并专门用于检测DNA污 染。该测定是基于使用序列特异性引物（SSP)和荧光标记的杂交探针(TaqMan?)的聚合 酶链反应（PCR)对序列明确的DNA片段进行序列特异性扩增和实时荧光检测。整个方法包 括仪器使用、试剂、采样和软件计算，根据供应商的说明书进行。
[0305] 例如13. 7-细菌内毒素：[Ph. Eur. 7, 2. 6. 14,方法C]。革兰阴性细菌内毒素的检 测是全球统一的基于来自马蹄蟹（豐（Limulus polyphemus))的变形细胞裂解物的标准方 法。这种鲎测试（"LAL试验"）根据欧洲药典使用浊度动力学技术（方法C)进行。其结 果表示为与国际内毒素标准BRP相关的国际单位（IU)。
[0306] 实施例13. 8-测定生物学活性（相对效能）：在基于细胞的体外增殖试验中进行 测定G-CSF样品的生物学活性，其按照非格司亭的专论中所描述并做如下改动。该生物测