一种His标签包涵体蛋白纯化方法
【专利摘要】本发明提供了一种His标签包涵体蛋白的纯化方法。本发明以N-十二烷基肌氨酸钠为变性剂，以碱性PH的CAPS(N-环己基-3-氨基丙磺酸）为缓冲液，裂解包涵体蛋白。N-十二烷基肌氨酸钠为一种表面活性剂，通过破坏蛋白内的疏水键溶解包涵体蛋白，变性条件较为温和。该变性方法的最大特点是，避免了尿素易分解产生异氰酸盐导致蛋白多肽链的自由氨基甲酰化的缺陷，溶解蛋白经Ni-NTA柱纯化效果优于尿素，蛋白溶解后即具有生物活性，无需做复性处理。
【专利说明】一种H i s标签包涵体蛋白纯化方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及蛋白纯化【技术领域】，具体涉及一种His标签包涵体蛋白的纯化方法。
【背景技术】
[0002] 包涵体是指大肠杆菌高效表达的重组蛋白在细胞内凝集，形成的不溶的、无活性 的固体颗粒。一般含有50% (质量分数）以上的重组蛋白，及少量的核糖体、RNA聚合酶、 内毒素、外膜蛋白、脂多糖等，易于对目标蛋白进行分离纯化。另外大肠杆菌表达体系具有 培养周期短、成本低、高效表达等优点，在生产中被广泛应用。但得到的包涵体蛋白必须经 过变性溶解及复性处理，才能使目标蛋白恢复其生物活性。因此，优化包涵体蛋白变性复性 过程，得到具有生物活性的蛋白，将是大量生产重组蛋白最有效的途径之一。
[0003] 目前常用的包涵体变性剂有尿素、盐酸胍及一些常见的去垢剂如SDS、正十六烷基 三甲基铵氯化物、Sarkosyl等。6-8M尿素为报道使用最多的变性剂，通过离子间的相互作 用，打断包涵体蛋白质分子内和分子间的各种化学键，使多肽伸展。但是尿素易分解产生异 氰酸盐导致多肽链的自由氨基甲酰化，不能长期储存，尤其是在高浓度、温度及碱性PH条 件下。变性溶解得到的包涵体蛋白通常采用最简单的稀释法和透析法并辅以适当的添加剂 逐步降低尿素浓度对目标蛋白进行复性。但复性过程缓慢，耗时较长，易造成蛋白的降解或 重新聚集，使得蛋白回收率较低。
【发明内容】
[0004] 本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种His标签包涵体蛋白的纯化方 法，该方法以更加温和的变性条件处理包涵体，以保证变性过程不会造成蛋白生物活性损 失，从而可以在变性溶解后直接纯化而省去复性步骤。
[0005] 为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：
[0006] 一种His标签包涵体蛋白的纯化方法，包括以下步骤
[0007] 1)取待纯化的包涵体，先用包涵体洗涤液对其进行洗涤，再用PBS对其进行洗涤；
[0008] 2)取包涵体裂解液，对步骤1)洗涤完毕的包涵体进行溶解，室温震荡，充分溶解 后离心收集上清；
[0009] 3)利用Ni-NET柱对步骤2)得到的上清液进行纯化，过程中利用洗液洗脱杂蛋白， 利用洗脱液洗脱目的蛋白，而后利用透析缓冲液对洗脱的目的蛋白进行透析。
[0010] 上述包涵体裂解液是其中具有50?IOOmM CAPS，0. 1-1 % N-十二烷基肌氨酸钠的 溶液，其pH为8.0?9.0。
[0011] 优选的，同时满足：所述透析缓冲液是其中具有50?IOOmM NaH2PO4,400?500mM Tris的溶液，其pH为8. 0?9. 0 ;所述洗液是其中具有50?IOOmM NaH2PO4,10?50mM Tris-Cl，5-10mM咪唑的溶液，其pH为7. 5?8. 5 ;所述洗液是其中具有50?IOOmM NaH2PO4, 10 ?50mM Tris-Cl，100-300mM 咪唑的溶液，其 pH 为 7. 5 ?8. 5。
[0012] 优选的，步骤1)所述的包涵体洗涤液是其中具有20mM Tris-Cl，l% Triton X-IOO的溶液,其PH为8· O?9· 0。
[0013] 优选的，步骤1)利用包涵体洗涤液对包涵体洗涤的次数为2?3次。
[0014] 优选的，步骤1)利用PBS对包涵体洗涤的次数为2?3次。
[0015] 同时本发明还提供了一种His标签包涵体蛋白的裂解液，其中具有50?IOOmM CAPS，0. 1-1% N-十二烷基肌氨酸钠，且其pH为8. 0?9. 0。
[0016] 本发明以N-十二烷基肌氨酸钠为变性剂，以碱性PH的CAPS (N-环己基-3-氨基 丙磺酸）为缓冲液，裂解包涵体蛋白。N-十二烷基肌氨酸钠为一种表面活性剂，通过破坏蛋 白内的疏水键溶解包涵体蛋白，变性条件较为温和。该变性方法的最大特点是，避免了尿素 易分解产生异氰酸盐导致蛋白多肽链的自由氨基甲酰化的缺陷，溶解蛋白经Ni-NTA柱纯 化效果优于尿素，蛋白溶解后即具有生物活性，无需做复性处理。
【专利附图】
【附图说明】
[0017] 图1是本发明实施例1两种变性液裂解处理的包涵体经Ni柱纯化后SDS-PAGE分 析结果；图中区域1对应未诱导菌体，区域2对应诱导菌体，区域3对应包涵体裂解上清，区 域4对应包涵体裂解后沉淀，区域5对应裂解上清过柱残液，区域6对应洗液，区域7对应 洗脱蛋白（以Buffer 2为裂解液），区域8对应洗脱蛋白（以尿素为裂解液）。
【具体实施方式】
[0018] 实施例1以尿素为变性剂处理包涵体与本发明方法处理包涵体对后续蛋白纯化 效果的比较
[0019] I. 1本发明方法所用到的试剂
[0020] 包涵体洗涤液（Buffer I) :20mM Tris-Cl，1% Triton X-100, PH 8. 0-9. 0。
[0021] 包涵体裂解液（Buffer 2) :50-100mM CAPS，0. 1-1% N-十二烷基肌氨酸钠 ，PH 8. O-9. 0 〇
[0022] 透析缓冲液（Buffer 3) :50-100mM NaH2PO4,400-500mM Tris，PH 8· 0-9. 0。透析 缓冲液的PH在8. 0-9. 0较为适宜，实际操作中需根据具体情况，避开目的蛋白的等电点。
[0023] 用于 Ni-NET 柱纯化蛋白的洗液：50-100mM NaH2P04，10-50mM Tris-Cl，5-10mM 咪 唑，PH8. 0。
[0024] 在Ni-NET柱纯化蛋白过程中用于洗脱杂蛋白的洗脱液：50-100mM NaH2PO4, 10-50mM Tris-Cl，100-300mM 咪唑，PH8. 0。
[0025] I. 2包涵体的制备
[0026] 诱导表达：按1:100比例接种新鲜菌液至LB液体培养基，培养3_4h，加入IPTG诱 导，继续培养4-5h。6000rpm，离心6min，收集菌体。该条件下目的蛋白几乎全部以包涵体 形式表达。
[0027] 收获包涵体：用1/10菌液体积的PBS洗涤菌体，再用1/10菌液体积的Bufferl重 悬菌体，加100 μ g/mL溶菌酶，30°C水浴30min，于冰上超声破碎菌体。离心弃上清，收集包 涵体。用Buffer 1洗涤包涵体2-3次，再用PBS洗涤2-3次，必要时洗涤过程中可加 DNA 酶,此过程可除去包涵体中的脂多糖、DNA等杂质，收集沉淀并称重。
[0028] 1. 3包涵体的裂解
[0029] Buffer 2裂解包涵体：按20mg/mL的比例用裂解液（60mM CAPS，0. 5% N-十二烷 基肌氨酸钠 ，PH 8. 0)重悬包涵体（必要时需要超声混匀），室温震荡15min-lh或4°C过夜， 12000rpm离心IOmin,收集含有可溶蛋白的上清。
[0030] 8M尿素裂解包涵体：按20mg/mL的比例用裂解液（50mM NaH2P04, IOmM Tris-Cl， 8M尿素 ，PH 8. 0)重悬包涵体（必要时需要超声混匀），室温震荡lh-2h或4°C过夜， 12000rpm离心lOmin，收集含有可溶蛋白的上清。该条件下可以使包涵体得到充分溶解。
[0031] 1.4蛋白的纯化
[0032] 以Buffer 2为裂解液的蛋白纯化：介质混匀，装柱；用大约4个柱体积的平衡液 (50mM NaH2P04, lOmMTris-Cl，PH8. 0)平衡介质，直到流出液A280值接近零；取IOmL蛋白 裂解液上样，流速约l_2mL/min，此过程可收集样品流穿液便于分析；用约8个柱体积的洗 液（50mM NaH2P04，10mMTris-Cl，10mM咪唑，PH8. 0)清洗介质，直到流出液A280值趋于平 衡，流速约 3-4mL/min ;用洗脱液（50mM NaH2P04,10mMTris-Cl，200mM 咪唑，PH8. 0)洗脱蛋 白并收集。此时收集的目的蛋白即具有生物活性，经透析去除咪唑后既可作为配制疫苗备 用蛋白。
[0033] 以尿素为裂解液的蛋白纯化：介质混匀，装柱；平衡液（50mM NaH2P04, IOmM Tris-C1，8M尿素 ，PH 8.0)平衡介质，直到流出液A280值接近零；取IOmL蛋白裂解液上样， 流速约l-2mL/min，收集样品流穿液便于分析；平衡液清洗介质，直到流出液A280值趋于平 衡；用约2个柱体积的洗液（50mM NaH2P04, IOmM Tris-Cl，IOmM咪唑，8M尿素 ，PH 8. 0)清 洗Ni2+柱，直到流出液A280值趋于平衡；洗脱液（50mM NaH2P04，10mM Tris-Cl，250mM咪 唑，8M尿素 ，PH 8.0)洗脱蛋白，收集洗脱液。获得的蛋白为变性蛋白，需经复性后方可应 用。
[0034] 1. 5结果评价
[0035] 经SDS-PAGE分析纯化效果，结果如图1所示。可以发现以Buffer 2为裂解液的 蛋白纯化后无杂蛋白条带，纯化效果良好，以尿素为裂解液的蛋白纯化后仍有少量杂蛋白 存在，效果不如前者。
[0036] Bradford法测定蛋白浓度：两种方法分别用等量的洗脱液洗脱目的蛋白，浓度分 别是580 μ g/mL、400 μ g/mL，Buffer 2为裂解液的蛋白纯化回收率略高于以尿素为裂解液 的蛋白纯化。
[0037] 实施例2
[0038] 一种His标签包涵体蛋白的纯化方法，包括以下步骤：
[0039] 1)取待纯化的包涵体，先用包涵体洗涤液对其进行洗涤2次，再用PBS对其进行洗 涤3次；
[0040] 2)取包涵体裂解液，对步骤1)洗涤完毕的包涵体进行溶解，室温震荡，充分溶解 后离心收集上清；
[0041] 3)利用Ni-NET柱对步骤2)得到的上清液进行纯化，过程中利用洗液洗脱杂蛋白， 利用洗脱液洗脱目的蛋白，而后利用透析缓冲液对洗脱的目的蛋白进行透析；
[0042] 上述包涵体裂解液是其中具有75mM CAPS，0. 5% N-十二烷基肌氨酸钠的溶液，其 pH 为 8. 5。
[0043] 实施例3
[0044] 一种His标签包涵体蛋白的纯化方法，包括以下步骤：
[0045] 1)取待纯化的包涵体，先用包涵体洗涤液对其进行洗涤3次，再用PBS对其进行洗 涤2次；
[0046] 2)取包涵体裂解液，对步骤1)洗涤完毕的包涵体进行溶解，室温震荡，充分溶解 后离心收集上清；
[0047] 3)利用Ni-NET柱对步骤2)得到的上清液进行纯化，过程中利用洗液洗脱杂蛋白， 利用洗脱液洗脱目的蛋白，而后利用透析缓冲液对洗脱的目的蛋白进行透析；
[0048] 上述包涵体裂解液是其中具有IOOmM CAPS，1% N-十二烷基肌氨酸钠的溶液，其 pH 为 9。
[0049] 实施例4
[0050] -种His标签包涵体蛋白的纯化方法，包括以下步骤：
[0051] 1)取待纯化的包涵体，先用包涵体洗涤液对其进行洗涤5次，再用PBS对其进行洗 涤7次；
[0052] 2)取包涵体裂解液，对步骤1)洗涤完毕的包涵体进行溶解，室温震荡，充分溶解 后离心收集上清；
[0053] 3)利用Ni-NET柱对步骤2)得到的上清液进行纯化，过程中利用洗液洗脱杂蛋白， 利用洗脱液洗脱目的蛋白，而后利用透析缓冲液对洗脱的目的蛋白进行透析；
[0054] 上述包涵体裂解液是其中具有50mM CAPS，0. 1 % N-十二烷基肌氨酸钠的溶液，其 pH 为 8。
[0055] 实施例5
[0056] -种His标签包涵体蛋白的纯化方法，包括以下步骤：
[0057] 1)取待纯化的包涵体，先用包涵体洗涤液对其进行洗涤2次，再用PBS对其进行洗 涤3次；
[0058] 2)取包涵体裂解液，对步骤1)洗涤完毕的包涵体进行溶解，室温震荡，充分溶解 后离心收集上清；
[0059] 3)利用Ni-NET柱对步骤2)得到的上清液进行纯化，过程中利用洗液洗脱杂蛋白， 利用洗脱液洗脱目的蛋白，而后利用透析缓冲液对洗脱的目的蛋白进行透析；
[0060] 上述包涵体裂解液是其中具有75mM CAPS，0. 5% N-十二烷基肌氨酸钠的溶液，其 pH 为 8. 5。
[0061] 在以上技术方案中，所述透析缓冲液是其中具有50mM NaH2PO4,400mM Tris的溶 液，其pH为8. 0 ;所述洗液是其中具有50mM NaH2PO4, IOmM Tris-Cl，5mM咪唑的溶液，其pH 为7.5;所述洗液是其中具有50mM NaH2P04，10mM Tris-Cl，100mM咪唑的溶液，其pH为8.5。
[0062] 步骤1)所述的包涵体洗涤液是其中具有20mM Tris-Cl，1% Triton X-100的溶 液，其PH为8.0?9.0。
[0063] 实施例6
[0064] 一种His标签包涵体蛋白的纯化方法，包括以下步骤：
[0065] 1)取待纯化的包涵体，先用包涵体洗涤液对其进行洗涤3次，再用PBS对其进行洗 涤2次；
[0066] 2)取包涵体裂解液，对步骤1)洗涤完毕的包涵体进行溶解，室温震荡，充分溶解 后离心收集上清；
[0067] 3)利用Ni-NET柱对步骤2)得到的上清液进行纯化，过程中利用洗液洗脱杂蛋白， 利用洗脱液洗脱目的蛋白，而后利用透析缓冲液对洗脱的目的蛋白进行透析；
[0068] 上述包涵体裂解液是其中具有IOOmM CAPS，1% N-十二烷基肌氨酸钠的溶液，其 pH 为 9。
[0069] 在以上技术方案中，所述透析缓冲液是其中具有IOOmM NaH2PO4, 500mM Tris的溶 液，其pH为9.0;所述洗液是其中具有IOOmM NaH2P04,50mM Tris-Cl，10mM咪唑的溶液，其 pH为8. 5 ;所述洗液是其中具有IOOmM NaH2PO4, 50mM Tris-Cl，300mM咪唑的溶液，其pH为 7. 5。
[0070] 实施例7
[0071] 一种His标签包涵体蛋白的纯化方法，包括以下步骤：
[0072] 1)取待纯化的包涵体，先用包涵体洗涤液对其进行洗涤1次，再用PBS对其进行洗 涤1次；
[0073] 2)取包涵体裂解液，对步骤1)洗涤完毕的包涵体进行溶解，室温震荡，充分溶解 后离心收集上清；
[0074] 3)利用Ni-NET柱对步骤2)得到的上清液进行纯化，过程中利用洗液洗脱杂蛋白， 利用洗脱液洗脱目的蛋白，而后利用透析缓冲液对洗脱的目的蛋白进行透析；
[0075] 上述包涵体裂解液是其中具有50mM CAPS，0. 1 % N-十二烷基肌氨酸钠的溶液，其 pH 为 8。
[0076] 在以上技术方案中，所述透析缓冲液是其中具有75mM NaH2PO4,450mM Tris的溶 液，其pH为8. 5 ;所述洗液是其中具有75mM NaH2P04,30mM Tris-Cl，8mM咪唑的溶液，其pH 为8 ;所述洗液是其中具有75mM NaH2P04,30mM Tris-Cl，200mM咪唑的溶液，其pH为8。
[0077] 步骤1)所述的包涵体洗涤液是其中具有20mM Tris-Cl，1% Triton X-100的溶 液，其PH为8.0?9.0。
[0078] 实施例8
[0079] -种His标签包涵体蛋白的裂解液，其中具有50mM CAPS，0. 1 % N-十二烷基肌氨 酸钠，且其pH为8.0。
[0080] 实施例9
[0081] 一种His标签包涵体蛋白的裂解液，其中具有IOOmM CAPS，1 % N-十二烷基肌氨酸 钠，且其pH为9.0。
[0082] 实施例10
[0083] 一种His标签包涵体蛋白的裂解液，其中具有75mM CAPS，0. 6% N-十二烷基肌氨 酸钠，且其pH为8. 8。
[0084] 以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例， 并不用以限制本发明。凡在本发明的申请范围内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应 包含在本发明的保护范围之内。
【权利要求】
1. 一种His标签包涵体蛋白的纯化方法，其特征在于包括以下步骤 1) 取待纯化的包涵体，先用包涵体洗涤液对其进行洗涤，再用PBS对其进行洗涤； 2) 取包涵体裂解液，对步骤1)洗涤完毕的包涵体进行溶解，室温震荡，充分溶解后离 心收集上清； 3) 利用Ni-NET柱对步骤2)得到的上清液进行纯化，过程中利用洗液洗脱杂蛋白，利用 洗脱液洗脱目的蛋白，而后利用透析缓冲液对洗脱的目的蛋白进行透析； 上述包涵体裂解液是其中具有50?IOOmM CAPS，0. 1-1% N-十二烷基肌氨酸钠的溶 液，其pH为8.0?9.0。
2. 根据权利要求1所述一种His标签包涵体蛋白的纯化方法，其特征在于： 所述透析缓冲液是其中具有50?IOOmM NaH2PO4,400?500mM Tris的溶液，其pH为 8. 0 ?9. 0 ; 所述洗液是其中具有50?IOOmM NaH2PO4,10?50mM Tris-Cl，5-10mM咪唑的溶液，其 pH 为 7. 5 ?8. 5 ; 所述洗液是其中具有50?IOOmM NaH2PO4,10?50mM Tris-Cl，100-300mM咪唑的溶 液，其pH为7. 5?8. 5。
3. 根据权利要求1所述一种His标签包涵体蛋白的纯化方法，其特征在于步骤1)所述 的包涵体洗涤液是其中具有20mM Tris-Cl，l%Triton X-100的溶液，其PH为8. 0?9. 0。
4. 根据权利要求1所述一种His标签包涵体蛋白的纯化方法，其特征在于步骤1)利用 包涵体洗涤液对包涵体洗涤的次数为2?3次。
5. 根据权利要求1所述一种His标签包涵体蛋白的纯化方法，其特征在于步骤1)利用 PBS对包涵体洗涤的次数为2?3次。
6. -种His标签包涵体蛋白的裂解液，其特征在于其中具有50?IOOmM CAPS，0. 1-1% N-十二烷基肌氨酸钠，且其pH为8. 0?9. 0。
【文档编号】C07K1/16GK104211752SQ201410448675
【公开日】2014年12月17日 申请日期:2014年9月4日 优先权日:2014年9月4日
【发明者】孙艳, 吕茂杰, 杨保收, 盛长忠, 梁武 申请人:天津瑞普生物技术股份有限公司