专利名称：用于组氨酸标签蛋白纯化的磁性微球及其制备和应用方法
技术领域：
本发明涉及的是一种生物材料技术领域的载体及其制备和应用，具体是一种用于
组氨酸标签蛋白纯化的磁性微球及其制备和应用方法。
背景技术：
IMAC(I,bilized Metal-ion Affinity Chromatography)是Porath等在1975 年用表面固定了亚氨基二乙酸(IDA)的树脂作为填料，并通过IDA这个配基螯合铜、镍、钴、 铁或锌等离子，利用蛋白质表面的一些氨基酸残基，如组氨酸、色氨酸、半胱氨酸等能和这 些金属离子发生较强配位作用的原理，对表面带组氨酸、色氨酸或半胱氨酸残基的蛋白进 行分离纯化而逐渐发展起来纯化蛋白的一种新型亲和纯化方法。由于IMAC技术具有固定 配基较为稳定、对目标蛋白吸附量大且不影响目的蛋白活性，吸附与洗脱等分离条件温和， 固定配基载体可反复使用以及成本低等特点而在蛋白纯化(无论是可溶性蛋白还是包涵 体)领域，特别在纯化带有6个组氨酸标签(His-Tag)的蛋白或融合蛋白等方面得到了广 泛的应用。 目前，IMAC技术多采用琼脂糖或者葡聚糖微珠等天然大分子聚合物作为固相支 持材料，通过化学交联反应将IDA(iminodiacetate) ， NTA(bis-nitrilotriacetic acid)， CM-ASP(trade named as TAU3N，carboxymethylated aspartic acid)，TED(pentadentate) 等配基固定在聚合物载体上，然后将固定了配基的微珠填充到柱子中形成亲和层析柱，进 行蛋白纯化前再将柱内的填料微珠与铜、镍、钴等离子螯合形成IMAC，进而完成纯化步骤。 由于采用蛋白纯化方式为柱式结构，因此对上样液的要求较为严格，一般需要将待分离蛋 白原液中的细胞碎片、杂质等离心除去后才能进行上样纯化分离操作。另外，上样速度与压 力均不能太高，否则可能破坏琼脂糖等支持微珠的结构而导致填料柱塌縮，因而整个分离 纯化过程较为费时。针对这些问题，近年来生物磁性分离技术以其具有快速、方便、可实现 自动化操控等优势已拓展到蛋白纯化与分离的各个领域，逐渐成为生物医学领域重要的工 具。基于此，研究者采用磁性微球替代琼脂糖等填料珠作为IMAC的固相载体支持物，将亲 和配基IDA或NTA分子固定到磁性微球表面，采用外磁场操控磁性微球实现分离与纯化过 程。由于在纯化过程中，磁性微球分散在待纯化的混合蛋白溶液中，参与分离功能的载体表 面积大，因此分离效率比柱式法有了较大提高。另外，磁性生物分离对分离纯化样本没有特 殊要求，通常对混杂有细胞残片等原始的蛋白样本都可以进行操作，减去了样本预处理的 麻烦，因此是一种较为理想的蛋白分离技术。 经对现有技术的文献检索发现，徐兵等在《美国化学学会会志》第126巻 3392- e 3393页发表的"NTA修饰的纳米磁性颗粒用于结合组氨酸蛋白的载体"(Ni trilotriaceticAcid—Modified Magnetic Nanoparticles as a General Agent to BindHistidine-Tagged Proteins, J. AM. CHEM. S0C. 2004， 126， 3392-3393)中报道了利用10 纳米的铂铁合金纳米颗粒为载体，表面修饰了NTA分子，再螯合镍离子得到用于纯化分离 带有组氨酸标签的重组蛋白，纯化效率高达2 3mg目的蛋白/mg磁性颗粒，与市售用于纯化带有组氨酸标签蛋白的商业磁性微球通常仅具有10 12y g目的蛋白/mg微珠的分离效率 相比，这一报道由于采用的纳米颗粒作为载体，具有极大的比表面积，因此纯化效率提高了
一百余倍。但由于采用的是粒度仅为io纳米的磁性颗粒，其对外磁场的响应程度较低，较
难实现在外磁场操控下的快速吸附与移动，因此在实际应用过程中受到一定限制。
进 一 步检索发现，St印hen Rimmer等在《生物大分子》第7巻，1124-1130 页 (HighlyBranched Poly (N_isopropy1acrylamide) for Use in Protein PurificationBiomacromolecules，2006，7， 1124-1130)报道采用具有高度支化结构的聚 异丙基丙烯酰胺这种具有温敏性的聚合物分子螯合铜离子后纯化His6-BRCAl蛋白，采用 高度支化的聚合物分子作为一种全新的金属离子螯合配基是本领域的一个创新的工作，但 是在应用过程中必须通过升、降温度等过程控制聚合物分子在分离介质中的溶解与团聚特 性，从而实现纯化与分离操作，应用程序较为繁琐。
发明内容
本发明针对现有技术存在的上述不足，提供一种用于组氨酸标签蛋白纯化的磁性 微球及其制备和应用方法，采用具有快速磁场响应性的磁性微球为固相支持物，在其表面 采用具有多羧基结构的超支化聚合物分子进行修饰得到可以与过渡金属离子高效率螯合 的磁性载体材料，最后总目标实现对组氨酸标签蛋白的快速、高效、简单地纯化与分离。本 发明能在30秒内完成磁场的吸附过程，解决了纯化操作速度与应用简便性问题；另一方面 对过渡金属的配位螯合能力得到极大提高，保证了对组氨酸标签蛋白的结合效率。
本发明是通过以下技术方案实现的 本发明涉及一种用于组氨酸标签蛋白纯化的磁性微球，包括四氧化三铁纳米颗 粒和氧化硅壳层，其中粒径10纳米的四氧化三铁纳米颗粒聚集为粒径150纳米 1000纳 米的球状聚集体，氧化硅壳层包覆于球状聚集体外部，四氧化三铁纳米颗粒的表面包覆油 酸分子，氧化硅壳层表面接枝具有多羧基结构的超支化聚合物分子。
所述的磁性微球的直径为200纳米 1100纳米。 所述的磁性微球中的组分及质量比依次为四氧化三铁纳米颗粒50wt % 80wt%，氧化硅壳层40wt% 15wt%，具有多羧基结构的超支化聚合物分子5wt% 10wt%。 所述的具有多羧基结构的超支化聚合物分子的分子结构如下
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其中R为-(CH2CH20_) 3_CH2CH2- 本发明涉及上述用于组氨酸标签蛋白纯化的磁性微球的制备方法，包括以下步骤 第一步、对磁性氧化硅微球进行表面改性处理制得氨基改性的磁性微球，具体步骤如下首先将磁性氧化硅微球分散于甲苯中搅拌，然后加入氨基硅烷试剂通过油浴加热方式使体系回流反应，采用甲苯分离洗涤，最后经加温抽真空反应后制成氨基改性的磁性微球。 所述的磁性氧化硅微球是指具有单分散粒径亲水性、磁性颗粒含量大于50wt%的氧化硅磁性微球。
所述的磁性氧化硅微球分散于甲苯中是指磁性氧化硅微球的浓度为0. 1 0. 3g/ 所述的氨基硅烷试剂是指为Y-氨丙基三乙氧基硅烷，Y-氨丙基三甲氧基硅烷，N-P (氨乙基)-Y-氨丙基三甲氧基硅烷，N-l3 (氨乙基)-Y-氨丙基甲基二甲氧基硅烷，N-P (氨乙基)-Y-氨丙基三乙氧基硅烷，N-l3 (氨乙基)-Y-氨丙基甲基二乙氧基硅烷，氨乙基氨乙基氨丙基三甲氧基硅烷中的一种。 第二步、制备表面修饰有超支化多羧基聚合物分子的改性磁性微球，具体步骤如下首先制备超支化聚合物，然后采用碳二亚胺分子连接表面经氨基改性的磁性微球和超支化聚合物分子，而得到改性磁性微球。 所述的制备超支化聚合物是指将超支化聚醚酯与丁二酸酐溶解于二氯甲烷中，然后加入干吡啶并搅拌混合3天后，经沉淀处理得到具有多羧基结构的超支化聚合物；
所述的沉淀处理是指采用以冰乙醚沉淀2次后在50度温度下进行真空干燥。
所述的采用碳二亚胺分子连接磁性微球和超支化聚合物分子是指将第一步得到的磁性微球分散到碳二亚胺连接液中，再加入超支化聚合物并经震荡反应后制得表面修饰有超支化多羧基聚合物分子的改性磁性微球 所述的碳二亚胺连接液是指pH为6. 0的含有10mg/mL的碳二亚胺的MES(2-(N-吗啉)乙磺酸一水物)溶液。 第三步、将改性磁性微球加入过渡金属盐溶液中，经常温孵育后得到可用于组氨酸标签蛋白纯化的螯合有过度金属离子的磁性微球的悬浮体。 所述的常温孵育是指将改性磁性微球加入至0. 1 1. 0mol/L的镍盐、铜盐或钴盐的溶液中，经振荡孵育后，用去离子水洗涤得到螯合金属离子的磁性微球悬浮体，该悬浮体的浓度为10mg/mL。 本发明涉及采用上述用于组氨酸标签蛋白纯化的磁性微球的应用，包括以下步骤 步骤一、将得到的螯合有金属离子的磁性微球悬浮体进行磁分离后弃上清，然后加入缓冲裂解液平衡离子浓度后进一步弃去上清液； 所述的缓冲裂解液是指含有500mM NaCl和10mM咪唑的Tris-Cl缓冲裂解液。
所述的平衡粒子浓度是指将磁性微球由原悬浮液转移到缓冲裂解液中，并使悬浮体离子浓度与缓冲裂解液保持相同的过程。 步骤二、加入细菌裂解上清液，经室温振荡孵育后冷藏静置，再采用缓冲液各洗涤 一 次并洗脱两次后，收集洗涤液和洗脱液并分别用SDS-PAGE (sodium dodecy 1sulfat印olyacrylamide gel electropheresis，十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶)电泳和BCA法(Bicinchoninic acid，二喹啉甲酸法)检测纯化得到细菌裂解上清液、洗涤、洗脱液中的组氨酸标签蛋白的纯度与纯化量。
所述的细菌裂解上清液是指含有组氨酸标签蛋白的细菌裂解上清液；
所述的冷藏静置是指将细菌裂解上清液置于4t:环境下静置。
所述的采用缓冲液各洗涤一次并洗脱两次是指依次采用含有0、10mM以及500mM浓度咪唑的200 1 Tris-Cl缓冲液对4度静置后的磁性微球洗涤一次并洗脱两次。
本发明采用亚微米或微米的磁性微球为载体，保证了在外磁场操控下的快速分离特性，使得整个纯化分离过程简便、高效。另一方面，由于采用了创新的多羧基超支化聚合物分子作为螯合金属离子的配基，并将该结构分子修饰到微球表面，由于磁性微球表面的多羧基超支化聚合物分子羧基密度高，且分子结构可形成众多空腔，因而与传统的金属离子螯合配基IDA、 NTA等相比较，具有更高效螯合金属离子的能力，从而保证了对组氨酸标签蛋白的高度纯化效率。经本发明制备得到的螯合有镍金属离子的粒径为l微米的磁性微球对组氨酸标签蛋白(33KD)的纯化效率可高达240iig/mg磁性微球，可作为一种新型高效的纯化蛋白载体。
具体实施例方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。 实施例1 (1)采用中国发明专利ZL 2006100279617提出的方法制备得到表面包被氧化硅壳层粒径为200nm的磁性氧化硅微球。将此氧化硅微球冷冻干燥，取称取6g冻干磁颗粒，加入100mL三口烧瓶中，量取60mL甲苯也加入此烧瓶中；开搅拌，放入12(TC油浴中，回流30分钟后加入Y-氨丙基三甲氧基硅烷5g，回流反应2h。反应结束后超声30秒，倒入烧杯中，在强磁场辅助下进行分离，再加入50mL甲苯，超声1分钟，强磁场分离洗涤，如此反复操作三遍后将得到的氨基改性的磁性微球放入真空干燥箱在12(TC抽真空反应12小时，最后将得到的磁性微球置于样品瓶中密封保存于干燥器内备用。
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(2)采用《欧洲化学》2009年第7593页报导的具有温敏特性的超支化聚醚酯的制备方法制备得到超支化聚醚酯，然后将此聚醚酯3g在lmL干吡啶与50mL 二氯甲烷混合溶剂中与3g 丁二酸酐等摩尔反应，得到具有多羧基超支化聚合物备用。 (3)取步骤(1)得到的表面经氨基改性的磁性微球500毫克分散到50mM pH为6. 0含有10mg/mL的碳二亚胺的MES(2-(N-吗啉)乙磺酸一水物)溶液中得到10mg/mL的磁性微球悬浮体，然后加入3克步骤(2)制备得到的羧基化超支化聚合物，37度振荡反应3小时，得到表面修饰有超支化聚合物的磁性微球。 (4)取步骤(3)得到的磁性微球10mg，加入到1. OM的硫酸镍的溶液中，振荡孵育12小时，再用去离子水洗涤微球3遍后得到螯合有镍金属离子的磁性微球悬浮体备用，悬浮体浓度为10mg/mL。 本实施例制备所得的螯合有镍金属离子的磁性微球的物理化学特征/组分/性态等为磁性微球内部由粒径为IO纳米表面包袱油酸分子的四氧化三铁纳米颗粒聚集成而成150纳米纳米的球状聚集体，球状聚集体外部为氧化硅壳层，氧化硅壳层表面接枝有多羧基结构的超支化聚合物分子。在磁性微球中，四氧化三铁纳米颗粒含量为50wt^，氧化硅壳层含量为40wt^。表面多羧基超支化聚合物分子含量为10wt%。最终磁性微球直径200nm。 采用本实施例制备所得磁性微球悬浮体进行组氨酸标签蛋白纯化，包括以下步骤取步骤(4)得到的螯合有镍等离子的磁性微球悬浮液200iU裂解液(含有500mMNaCl，10mM咪唑的20mM Tris-Cl缓冲液)平衡离子浓度10分钟，弃去上清液后，加入200 含有组氨酸标签蛋白的细菌裂解液上清夜，室温振荡孵育20min，4t:冰箱静置lOmin后，分别依次加入200 y 1 Tris-Cl缓冲液(分别含0， lOmM， 500mM咪唑)洗涤一次和洗脱两次，收集洗涤与洗脱液，分别用SDS-Page电泳和BCA法检测纯化得到的带有组氨酸标签蛋白的纯化纯度与纯化量。经BCA法检测得到的微球分离带有组氨酸标签蛋白(33KD)的分离效率为300 ii g/mg磁性微球。
实施例2 (1)采用中国发明专利ZL 2006100279617提出的方法制备得到表面包被氧化硅壳层的磁性氧化硅微球。所不同的是微球内的磁性颗粒聚集体内核为900nm，氧化硅壳层包被方法与中国发明专利ZL 2006100279617相同，因此最终得到的氧化硅磁性微球粒径为1000nm。将此氧化硅微球冷冻干燥，取称取6g冻干磁颗粒，加入lOOmL三口烧瓶中，量取20mL甲苯也加入此烧瓶中；搅拌，放入12(TC油浴中，回流30分钟后加入Y-氨丙基三乙氧基硅烷lg，回流反应2h。反应结束后超声30秒，倒入烧杯中，在强磁场辅助下进行分离，再加入50mL甲苯，超声1分钟，强磁场分离洗涤，如此反复操作三遍后将得到的氨基改性的磁性微球放入真空干燥箱在12(TC抽真空反应12小时，最后将得到的磁性微球置于样品瓶中密封保存于干燥器内备用。 (2)多羧基超支化聚合物制备方法与实施例1相同。 (3)取步骤(1)得到的表面经氨基改性的磁性微球500毫克分散到50mM pH为6. 0含有10mg/mL的碳二亚胺的MES(2-(N-吗啉)乙磺酸一水物)溶液中得到10mg/mL的磁性微球悬浮体，然后加入3克步骤(2)制备得到的多羧基超支化聚合物，37度振荡反应3小时，得到表面修饰有多羧基超支化聚合物的磁性微球。
(4)取步骤(3)得到的磁性微球10mg，加入1. 0M的硫酸镍的溶液中，振荡孵育12小时，再用去离子水洗涤微球3遍后得到螯合有镍属离子的磁性微球悬浮体备用，悬浮体浓度为10mg/mL。 本实施例制备所得的螯合有镍金属离子的磁性微球的物理化学特征/组分/性态等为磁性微球内部由粒径为IO纳米表面包袱油酸分子的四氧化三铁纳米颗粒聚集成而成900纳米的球状聚集体，球状聚集体外部为氧化硅壳层，氧化硅壳层表面接枝有多羧基结构的超支化聚合物分子。在磁性微球中，四氧化三铁纳米颗粒含量为80wt % ，氧化硅壳层含量为12wt%。表面多羧基超支化聚合物分子含量为8wt%。最终磁性微球直径lOOOnm。
采用本实施例制备所得磁性微球悬浮体进行组氨酸标签蛋白纯化，包括以下步骤取步骤(4)得到的螯合有镍离子的磁性微球悬浮液200 1裂解液(含有500mM NaCl，10mM咪唑的20mM Tris-Cl缓冲液)平衡离子浓度10分钟，弃去上清液后，加入200 含有组氨酸标签蛋白的细菌裂解液上清夜，室温振荡孵育20min，4t:冰箱静置lOmin后，分别依次加入200 ii 1 Tris-Cl缓冲液(分别含0， lOmM， 500mM咪唑)洗涤一次和洗脱两次，收集洗涤与洗脱液，分别用SDS-Page电泳和BCA法检测纯化得到的带有组氨酸标签蛋白的纯化纯度与纯化量。经BCA法检测得到的微球分离带有组氨酸标签蛋白(33KD)的分离效率为240ii g/mg磁性微球。
实施例3 (1)采用中国发明专利ZL 2006100279617提出的方法制备得到表面包被氧化硅壳层的磁性氧化硅微球。所不同的是微球内的磁性颗粒聚集体内核为900nm，氧化硅壳层包被方法与中国发明专利ZL 2006100279617相同，因此最终得到的氧化硅磁性微球粒径为1000nm。将此氧化硅微球冷冻干燥，取称取6g冻干磁颗粒，加入100mL三口烧瓶中，量取20mL甲苯也加入此烧瓶中；搅拌，放入12(TC油浴中，回流30分钟后加入N-e (氨乙基)_ Y _氨丙基三甲氧基硅烷0. 5g，回流反应2h。反应结束后超声30秒，倒入烧杯中，在强磁场辅助下进行分离，再加入50mL甲苯，超声1分钟，强磁场分离洗涤，如此反复操作三遍后将得到的氨基改性的磁性微球放入真空干燥箱在12(TC抽真空反应12小时，最后将得到的磁性微球置于样品瓶中密封保存于干燥器内备用。
(2)多羧基超支化聚合物制备方法与实施例1相同。 (3)取步骤(1)得到的表面经氨基改性的磁性微球500毫克分散到50mM pH为6. 0含有10mg/mL的碳二亚胺的MES(2-(N-吗啉)乙磺酸一水物)溶液中得到10mg/mL的磁性微球悬浮体，然后加入3克步骤(2)制备得到的羧基化超支化聚合物，37度振荡反应3小时，得到表面修饰有多羧基超支化聚合物的磁性微球。 (4)取步骤(3)得到的磁性微球10mg，加入0. 5M的硫酸铜的溶液中，振荡孵育12小时，再用去离子水洗涤微球3遍后得到螯合有铜属离子的磁性微球悬浮体备用，悬浮体浓度为10mg/mL。 本实施例制备所得的螯合有镍金属离子的磁性微球的物理化学特征/组分/性态等为磁性微球内部由粒径为IO纳米表面包袱油酸分子的四氧化三铁纳米颗粒聚集成而成900纳米的球状聚集体，球状聚集体外部为氧化硅壳层，氧化硅壳层表面接枝有多羧基结构的超支化聚合物分子。在磁性微球中，四氧化三铁纳米颗粒含量为80wt % ，氧化硅壳层含量为12wt%。表面多羧基超支化聚合物分子含量为8wt%。最终磁性微球直径1000nm。
采用本实施例制备所得磁性微球悬浮体进行组氨酸标签蛋白纯化，包括以下步骤取步骤(4)得到的螯合有铜离子的磁性微球悬浮液200iU裂解液(含有500mM NaCl，10mM咪唑的20mM Tris-Cl缓冲液)平衡离子浓度10分钟，弃去上清液后，加入200 yl含有组氨酸标签蛋白的细菌裂解液上清夜，室温振荡孵育20min，4t:冰箱静置10min后，分别依次加入200 ii 1 Tris-Cl缓冲液(分别含0， 10mM， 500mM咪唑)洗涤一次和洗脱两次，收集洗涤与洗脱液，分别用SDS-Page电泳和BCA法检测纯化得到的带有组氨酸标签蛋白的纯化纯度与纯化量。经BCA法检测得到的微球分离带有组氨酸标签蛋白(33KD)的分离效率为120ii g/mg磁性微球。
实施例4 (1)采用与实施例2相同的方法制备得到粒径为1000nm的磁性氧化硅微球。将此氧化硅微球冷冻干燥，取称取6g冻干磁颗粒，加入100mL三口烧瓶中，量取40mL甲苯也加入此烧瓶中；开搅拌，放入12(TC油浴中，回流30分钟后加入N-13 (氨乙基)-Y -氨丙基乙甲氧基硅烷0. lg，回流反应2h。反应结束后超声30秒，倒入烧杯中，在强磁场辅助下进行分离，再加入50mL甲苯，超声1分钟，强磁场分离洗涤，如此反复操作三遍后将得到的氨基改性的磁性微球放入真空干燥箱在12(TC抽真空反应12小时，最后将得到的磁性微球置于样品瓶中密封保存于干燥器内备用。 (2)多羧基超支化聚合物制备方法与实施例1相同。 (3)取步骤(1)得到的表面经氨基改性的磁性微球500毫克分散到50mM pH为6. 0含有10mg/mL的碳二亚胺的MES(2-(N-吗啉)乙磺酸一水物)溶液中得到10mg/mL的磁性微球悬浮体，然后加入3克步骤(2)制备得到的羧基化超支化聚合物，37度振荡反应3小时，得到表面修饰有多羧基超支化聚合物的磁性微球。 (4)取步骤(3)得到的磁性微球10mg，加入到0. 1M的硫酸钴的溶液中，振荡孵育12小时，再用去离子水洗涤微球3遍后得到螯合有钴金属离子的磁性微球悬浮体备用，悬浮体浓度为10mg/mL。 本实施例制备所得的螯合有镍金属离子的磁性微球的物理化学特征/组分/性态等为磁性微球内部由粒径为IO纳米表面包袱油酸分子的四氧化三铁纳米颗粒聚集成而成900纳米的球状聚集体，球状聚集体外部为氧化硅壳层，氧化硅壳层表面接枝有多羧基结构的超支化聚合物分子。在磁性微球中，四氧化三铁纳米颗粒含量为80wt % ，氧化硅壳层含量为12wt%。表面多羧基超支化聚合物分子含量为8wt%。最终磁性微球直径1000nm。
采用本实施例制备所得磁性微球悬浮体进行组氨酸标签蛋白纯化，包括以下步骤取步骤(4)得到的螯合有钴离子的磁性微球悬浮液200 ii 1裂解液(含有500mM NaCl，10mM咪唑的20mM Tris-Cl缓冲液)平衡离子浓度10分钟，弃去上清液后，加入200 yl含有组氨酸标签蛋白的细菌裂解液上清夜，室温振荡孵育20min，4t:冰箱静置10min后，分别依次加入200 ii 1 Tris-Cl缓冲液(分别含0， 10mM， 500mM咪唑)洗涤一次和洗脱两次，收集洗涤与洗脱液，分别用SDS-Page电泳和BCA法检测纯化得到的带有组氨酸标签蛋白的纯化纯度与纯化量。经BCA法检测得到的微球分离带有组氨酸标签蛋白(33KD)的分离效率为50ii g/mg磁性微球。
实施例5 (1)采用中国发明专利ZL 2006100279617提出的方法制备得到表面包被氧化硅壳层的磁性氧化硅微球。所不同的是微球内的磁性颗粒是铁锰合金颗粒，磁性颗粒聚集体 内核为900nm，氧化硅壳层包被方法与中国发明专利ZL 2006100279617相同，因此最终得 到的氧化硅磁性微球粒径为1000nm。将此氧化硅微球冷冻干燥，取称取6g冻干磁颗粒，加 入100mL三口烧瓶中，量取20mL甲苯也加入此烧瓶中；搅拌，放入12(TC油浴中，回流30分 钟后加入Y-氨丙基三乙氧基硅烷lg，回流反应2h。反应结束后超声30秒，倒入烧杯中， 在强磁场辅助下进行分离，再加入50mL甲苯，超声1分钟，强磁场分离洗涤，如此反复操作 三遍后将得到的氨基改性的磁性微球放入真空干燥箱在12(TC抽真空反应12小时，最后将 得到的磁性微球置于样品瓶中密封保存于干燥器内备用。
(2)多羧基超支化聚合物制备方法与实施例1相同。 (3)取步骤(1)得到的表面经氨基改性的磁性微球500毫克分散到50mM pH为6. 0 含有10mg/mL的碳二亚胺的MES(2-(N-吗啉)乙磺酸一水物)溶液中得到10mg/mL的磁性 微球悬浮体，然后加入3克步骤(2)制备得到的羧基化超支化聚合物，37度振荡反应3小 时，得到表面修饰有多羧基超支化聚合物的磁性微球。 (4)取步骤(3)得到的磁性微球10mg，加入1. OM的硫酸镍的溶液中，振荡孵育12 小时，再用去离子水洗涤微球3遍后得到螯合有镍属离子的磁性微球悬浮体备用，悬浮体 浓度为10mg/mL。 本实施例制备所得的螯合有镍金属离子的磁性微球的物理化学特征/组分/性态 等为磁性微球内部由粒径为IO纳米表面包袱油酸分子的四氧化三铁纳米颗粒聚集成而 成900纳米的球状聚集体，球状聚集体外部为氧化硅壳层，氧化硅壳层表面接枝有多羧基 结构的超支化聚合物分子。在磁性微球中，四氧化三铁纳米颗粒含量为80wt % ，氧化硅壳层 含量为10wt%。表面多羧基超支化聚合物分子含量为10wt%。最终磁性微球直径1000nm。
采用本实施例制备所得磁性微球悬浮体进行组氨酸标签蛋白纯化，包括以下步 骤取步骤(4)得到的螯合有镍离子的磁性微球悬浮液200iU裂解液(含有500mM NaCl， 10mM咪唑的20mM Tris-Cl缓冲液)平衡离子浓度10分钟，弃去上清液后，加入200 yl含 有组氨酸标签蛋白的细菌裂解液上清夜，室温振荡孵育20min，4t:冰箱静置10min后，分别 依次加入200 ii 1 Tris-Cl缓冲液(分别含0， 10mM， 500mM咪唑)洗涤一次和洗脱两次，收 集洗涤与洗脱液，分别用SDS-Page电泳和BCA法检测纯化得到的带有组氨酸标签蛋白的纯 化纯度与纯化量。经BCA法检测得到的微球分离带有组氨酸标签蛋白(33KD)的分离效率 为230ii g/mg磁性微球。
权利要求
一种用于组氨酸标签蛋白纯化的磁性微球，其特征在于包括四氧化三铁纳米颗粒和氧化硅壳层，四氧化三铁纳米颗粒的表面包覆油酸分子，氧化硅壳层表面接枝具有多羧基结构的超支化聚合物分子；所述的磁性微球中的组分及质量比依次为四氧化三铁纳米颗粒50wt％~80wt％，氧化硅壳层40wt％~15wt％，具有多羧基结构的超支化聚合物分子5wt％~10wt％。
2. 根据权利要求1所述的用于组氨酸标签蛋白纯化的磁性微球，其特征是，所述的四 氧化三铁纳米颗粒，其颗粒聚集为粒径150纳米 1000纳米的球状聚集体，氧化硅壳层包覆 于球状聚集体外部。
3. 权利要求1所述的用于组氨酸标签蛋白纯化的磁性微球，其特征是，所述的具有多 羧基结构的超支化聚合物分子的分子结构如下<formula>formula see original document page 2</formula>其中R为-(CH2CH20-)3-CH2CH2-。
4. 根据权利要求1所述的用于组氨酸标签蛋白纯化的磁性微球的制备方法，其特征在于，包括以下步骤第一步、对磁性氧化硅微球进行表面改性处理制得氨基改性的磁性微球； 第二步、制备表面修饰有超支化多羧基聚合物分子的改性磁性微球；第三步、将改性磁性微球加入过渡金属盐溶液中，经常温孵育后得到可用于组氨酸标 签蛋白纯化的螯合有过度金属离子的磁性微球的悬浮体。
5. 根据权利要求4所述的用于组氨酸标签蛋白纯化的磁性微球的制备方法，其特征是，所述的第一步具体步骤如下首先将磁性氧化硅微球分散于甲苯中并经油浴搅拌，然后加入氨基硅烷试剂通过油浴加热方式使体系回流反应，采用甲苯分离洗涤，最后经加温抽 真空反应后制成氨基改性的磁性微球。
6. 根据权利要求4所述的用于组氨酸标签蛋白纯化的磁性微球的制备方法，其特征是，所述的第二步具体步骤如下首先制备超支化聚合物，然后采用碳二亚胺分子连接表面 经氨基改性的磁性微球和超支化聚合物分子，而得到改性磁性微球；
7. 根据权利要求6所述的用于组氨酸标签蛋白的磁性微球的制备方法，其特征是，所述的制备超支化聚合物是指将超支化聚醚酯与丁二酸酐溶解于二氯甲烷中，然后加入干吡啶并搅拌混合3天后，经沉淀处理得到具有多羧基结构的超支化聚合物。
8. 根据权利要求1或4所述的用于组氨酸标签蛋白纯化的磁性微球的应用，其特征在于，包括以下步骤步骤一、将得到的螯合有金属离子的磁性微球悬浮体进行磁分离后弃上清，然后加入 缓冲裂解液平衡离子浓度后进一步弃去上清液；步骤二、加入细菌裂解上清液，经室温振荡孵育后冷藏静置，再采用缓冲液各洗涤一次 并洗脱两次后，收集洗涤液和洗脱液并分别用SDS-PAGE电泳和BCA法检测纯化得到细菌裂 解上清液中和洗涤液、洗脱液中的组氨酸标签蛋白的纯度与纯化量。
9. 根据权利要求8所述的用于组氨酸标签蛋白纯化的磁性微球的应用，其特征是，所 述的缓冲裂解液是指含有500mM NaCl和10mM咪唑的Tris-Cl缓冲裂解液。
10. 根据权利要求8所述的用于组氨酸标签蛋白纯化的磁性微球的应用，其特征是， 所述的采用缓冲液各洗涤一次并洗脱两次是指依次采用含有0、10mM以及500mM咪唑的 200 iU Tris-Cl缓冲液对冷藏静置后的磁性微球悬浮液洗涤一次并洗脱两次。
全文摘要
一种生物材料技术领域的用于组氨酸标签蛋白纯化的磁性微球及其制备和应用方法，其中磁性微球包括四氧化三铁纳米颗粒50wt％~80wt％，氧化硅壳层40wt％~15wt％，具有多羧基结构的超支化聚合物分子5wt％~10wt％。所述的具有多羧基结构的超支化聚合物分子的分子结构如下其中R为-(CH2CH2O-)3-CH2CH2-。本发明采用具有快速磁场响应性的磁性微球为固相支持物，在其表面采用具有多羧基结构的超支化聚合物分子进行修饰得到可以与过渡金属离子高效率螯合的磁性载体材料，最后总目标实现对组氨酸标签蛋白的快速、高效、简单地纯化与分离。
文档编号B01J13/02GK101745353SQ20101010942
公开日2010年6月23日 申请日期2010年2月12日 优先权日2010年2月12日
发明者古宏晨, 徐宏, 朱新远, 李国林, 王明启 申请人:上海交通大学