去亲和层析纯化标签的基因重组七鳃鳗Lj-RGD3蛋白的制备方法
【专利摘要】本发明公开一种操作简单、纯化率高的去亲和层析纯化标签的基因重组七鳃鳗Lj-RGD3蛋白rLj-RGD3（Tag-）的制备方法，构建了无任何纯化标签的重组表达载体pET23b-RGD3（Tag-），并将此重组质粒转化入表达菌中进行基因重组蛋白的表达，利用金属螯合离子亲和层析、阳离子交换、透析等，制备不带有任何亲和层析纯化标签的七鳃鳗Lj-RGD3基因重组蛋白，命名为rLj-RGD3（Tag-）蛋白，其蛋白纯度达到≥99%。
【专利说明】去亲和层析纯化标签的基因重组七鳃鳗U-RGD3蛋白的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种蛋白纯化方法，尤其是一种操作简单、纯化率高的去亲和层析纯化标签的基因重组七鳃鳗Lj-RGD3蛋白rLj-RGD3 (TagO的制备方法。
【背景技术】
[0002]LJ-RGD3为来源于日本七鳃鳗口腔腺分泌物的RGD毒素蛋白，由117个氨基酸残基组成，Lj-RGD3的一级结构除具有三个RGD模体和一对半胱氨酸这一典型的RGD毒素蛋白特征外，还含有17个组氨酸，17个精氨酸，是一类HRG的碱性蛋白，已公开于专利号为200510083437.7、名称为“具抗肿瘤作用的日本七鳃鳗口腔腺RGD模体蛋白的基因克隆与表达”的中国发明专利文献中，即命名为Lampetrin3的蛋白，具有抗血管新生、抗肿瘤增殖、抗血栓等功效。
[0003]传统纯化蛋白非常复杂，不仅需要依据待纯化蛋白分子量或所带电荷的不同而选择盐析法、分子筛层析法、离子交换层析法、亲和层析法及疏水层析法等，还要在众多试剂或填料中进行相应选择并确定个案的具体纯化步骤，即便如此，蛋白的纯化率还较低。因此，目前为了方便基因重组蛋白的纯化，通常在载体构建时就会为蛋白引入亲和层析纯化标签(GST标签和HIS)以犹得带有纯化标签的基因重组融合蛋白。未和标签已成为后基因组学时代纯化重组蛋白常用手段，此方法无需了解蛋白质的生化特性或生理活性，就可通过带标签的重组融合蛋白选择性地与层析基质上的配体结合，从而得以纯化任何蛋白质。然而，对于蛋白质的结构研究、治疗药物或诊断试剂的应用而言，亲和标签存在着潜在干扰。制备高纯度不带有任何亲 和层析纯化标签的基因重组蛋白rLj-RGD3 (Tag—)是其未来应用于药物研究的必须步骤，现在还没有任何关于rLj-RGD3 (TagO去亲和层析标签蛋白纯化工艺的报道。
【发明内容】
[0004]本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种操作简单、纯化率高的去亲和层析纯化标签的基因重组七鳃鳗Lj-RGD3蛋白rLj-RGD3 (Tag—)的制备方法。
[0005]本发明的技术解决方案是:一种去亲和层析纯化标签的七鳃鳗Lj_RGD3基因重组蛋白的制备方法，其特征在于按照如下步骤进行:
a.在Lj-RGD3基因序列3’末端引入终止密码子，与载体以NdeI和Hind III酶切位点相连接，转化入表达菌后进行阳性转化子的筛选鉴定；
b.对阳性重组子进行IPTG诱导表达；
c.对表达的重组蛋白进行提取；
d.对提取的蛋白依次按如下步骤进行纯化:
d-1.通过金属螯合离子亲和层析柱HiTrap IMAC HP进行蛋白纯化:
将HiTrap IMAC HP柱连接到已经用20%乙醇冲洗好的BIO-RAD仪器上，用10倍柱体积的蒸馏水对柱子进行润洗，润洗的过程中保持UV值稳定，初始值为O ;用2.5倍柱体积的0.1M浓度的硫酸铜溶液走柱，再用10倍柱体积的蒸馏水冲洗柱子；用10倍柱体积的Binding buffer平衡柱子，保持柱子UV值稳定，UV基线值为O ;将提取的蛋白过柱，之后再用15倍柱体积的Binding buffer平衡柱子,再用Elution buffer洗脱目的蛋白，流速为lml/min ;收集洗脱液为Iml/管，回收第42~54管的样品，保存于_20°C;所述的Bindingbuffer溶液成分由20mM磷酸钠、0.5M氯化钠、5mM咪唑组成(PH:7.4±0.02);所用的Elution buffer溶液成分由20mM磷酸钠、0.5M氯化钠、500mM咪唑组成(PH:4±0.02)；d-2.对所收集的蛋白采用SP柱进行阳离子交换层析:
将阳离子交换柱SP柱连接到BIO-RAD仪器中，用灭菌水清洗柱子，流速为lml/min，洗10个柱体积；用10倍柱体积的低盐缓冲液平衡柱子，流速为lml/min，直至UV基线保持在稳定的水平上，初始值为O ;将已收集的蛋白过SP柱，再用10倍柱体积的高盐缓冲液洗脱目的蛋白，流速为lml/min ;收集洗脱液为Iml/管，回收第26~34管的样品保存于_20°C;所用的低盐缓冲液成分由50mM Tris-HCl和50mM NaCl组成，所用的高盐缓冲液成分由50mMTris-HCl 和 IM NaCl 组成；d-3.透析:
采用截留分子量为10 kDa的透析袋对上述经步骤d-2纯化的蛋白进行4°C过夜透析，透析缓冲液为去离子水。
[0006]d-4.冷冻干燥:
将经步骤d-3透析的蛋白经冷冻干燥，制备rLj-RGD3 (Tag-)蛋白冻干粉。
[0007]所述a步骤的在Lj_RGD3基因序列3’末端引入终止密码子，与载体以Nde I和Hind III酶切位点相连接的引物序列为:
Pl: 5’ -XXcatatgtcaacgttcatcaacggaacc-3>
P2: 5’ -XXaagctttcactccccaacacattcact-S’。
[0008]本发明构建了无任何纯化标签的重组表达载体pET23b_RGD3 (Tag_)，并将此重组质粒转化入表达菌中进行基因重组蛋白的表达，利用金属螯合离子亲和层析、阳离子交换、透析及冷冻干燥等方法，制备不带有任何亲和层析纯化标签的七鳃鳗Lj-RGD3基因重组蛋白，命名为rLj-RGD3 (TagO蛋白，操作简单、纯化率高，其蛋白纯度达到> 99%。
【专利附图】
【附图说明】
[0009]图1是BIO-RAD检测本发明实施例经金属螯合离子亲和层析柱纯化rLj-RGD3(Tag_)结果图。
[0010]图2是Tricine SDS-PAGE检测本发明实施例经金属螯合离子亲和层析柱纯化rLj-RGD3 (TagO 结果图。
[0011]图3是BIO-RAD检测本发明实施例经阳离子交换柱SP柱纯化rLj-RGD3 (Tag_)结果图。
[0012]图4是Tricine SDS-PAGE检测本发明实施例经阳离子交换柱SP柱纯化rLj-RGD3(Tag_)结果图。
【具体实施方式】[0013]按照如下步骤进行:
a.在Lj-RGD3基因序列3’末端引入终止密码子，与载体以Nde I和Hind III酶切位点相连接，转化入表达菌后进行阳性转化子的筛选鉴定，具体步骤如下:
a.1采用宝生物的质粒提取试剂盒提取pET23b质粒；
a.2以Lj -RGD3的DNA为底物，用引物P1、P2经PCR反应，获得目的基因，再用引物P1、P2与pET23b质粒反应，连接目的基因DNA片段与载体pET23b ;由于引物P1、P2分别带有Nde I和Hind III酶切位点，而这两个酶切位点也是pET23b的多克隆位点，这使得将目的基因DNA片段与载体pET23b的连接成为可能；而终止密码子在Lj-RGD3基因序列3’末端的引入，使得pET23b质粒上的HIS标签不能表达，所构建的重组质粒表达蛋白的序列为不带有亲和层析纯化标签的rLj-RGD3 (Tag_)蛋白。引物P1、P2序列如下:
Pl: 5’ -XXcatatgtcaacgttcatcaacggaacc-3>
P2: 5’ -XXaagctttcactccccaacacattcact-3> ；
a.3将所连接产物用CaCl2法转化至克隆菌E.coli BL21中；
a.4利用T7通用引物法和双酶切法进行阳性转化子的筛选鉴定。
[0014]b.对阳性重组子进行IPTG诱导表达:
对阳性重组子进行终浓度为lmmol/L的IPTG诱导表达，诱导表达条件为30°C过夜诱 导。
[0015]c.对表达的重组蛋白进行提取；
c.1 5000 g离心15 min收获菌体，弃上清，并使残液尽量流出。以每100 ml的原培养液加4 ml冰冷的Binding buffer的比例重悬细胞；所述Binding buffer溶液PH值为7.4 ±0.02，成分由20mM磷酸钠、0.5M氯化钠、5mM咪唑组成；
c.2将重悬细胞液置于冰上超声裂解细胞，破碎功率30%，破10s，停5s，时间为30min,溶液不再粘稠；
c.3 12000 g离心20 min以去除细胞碎片；
c.4收集上清，以0.45 μ m的滤膜过滤。
[0016]d.对提取的蛋白(过滤后的上清液)依次按如下步骤进行纯化: d-1.通过金属螯合离子亲和层析柱HiTrap IMAC HP进行蛋白纯化:
将HiTrap IMAC HP柱连接到已经用20%乙醇冲洗好的BIO-RAD仪器上，用10倍柱体积的蒸馏水对柱子进行润洗，润洗的过程中随时监测整个系统的UV值，保持UV值稳定，初始值为O ;用2.5倍柱体积的0.1M浓度的硫酸铜溶液走柱，再用10倍柱体积的蒸馏水冲洗柱子，除去未能与柱子结合的金属离子，并且使柱子与金属离子充分的结合；用10倍柱体积的Binding buffer平衡柱子，保持柱子UV值稳定，UV基线值为O ;将提取的蛋白过柱，之后再用15倍柱体积的Binding buffer平衡柱子,使蛋白与柱子紧密结合再用Elutionbuffer洗脱目的蛋白，流速为lml/min ;收集洗脱液为Iml/管,收集管编号为1_55，回收第42~54管的样品，保存于-20°C ;所述的Binding buffer溶液PH值为7.4±0.02，成分由20mM磷酸钠、0.5M氯化钠、5mM咪唑组成；所用的Elution buffer溶液PH为4±0.02，成分由20mM磷酸钠、0.5M氯化钠、500mM咪唑组成；
将所收集的洗脱液经BIO-RAD检测，结果如图1所示:横坐标为收集时间(分钟)，纵坐标为280nm光吸收值A28Q。峰A:杂蛋白流穿峰；峰B: rLj-RGD3 (Tag_)蛋白洗脱峰。表明:峰B从加样就起始收集的第42~54管样品为目的蛋白。
[0017]将所收集的洗脱液经Tricine SDS-PAGE检测，结果如图2所示:1、带HIS标签rLj-RGD3 对照；2、marker (分子量从上到下分别为 42 kDa, 26 kDa, 17 kDa, 10 kDa，4.6 kDa);3、48号管样品；4、49号管样品；5、50号管样品；6、51号管样品；7、52号管样品；8、53号管样品；9、54号管样品。由于rLj-RGD3 (Tag_)蛋白为碱性蛋白，其电泳迁移率比正常蛋白小，目的带比预期位置更靠近加样孔方向。表明:峰B的从加样就起始收集的第42~54管样品为目的蛋白，但含有一条杂带。
[0018]d-2.对所收集的蛋白采用SP柱进行阳离子交换层析:
SP的英文全称为Saturated polyester plastic,中文译为饱和聚酯塑料,本发明 中指树脂材料，即SP树脂。
[0019]将阳离子交换柱SP柱连接到BIO-RAD仪器中，用灭菌水(0.22um滤膜过滤)清洗柱子，流速为lml/min，洗10个柱体积；用10倍柱体积的低盐缓冲液平衡柱子，流速为Iml/min，直至UV基线保持在稳定的水平上，初始值为O ;将已收集的蛋白过SP柱，再用10倍柱体积的高盐缓冲液洗脱目的蛋白，流速为lml/min ;收集洗脱液为Iml/管，回收第26~34管的样品保存于_20°C ;所用的低盐缓冲液成分由50mM Tris-HCl和50mM NaCl组成，所用的高盐缓冲液成分由50mM Tris-HCl和IM NaCl组成； 将所收集的洗脱液经BIO-RAD检测，结果如图1所示:横坐标为收集时间(分钟)，纵坐标为280nm光吸收值A28Q。峰A:杂蛋白流穿峰；峰B: rLj-RGD3 (Tag_)蛋白洗脱峰。表明:峰A从加样就起始收集的第26~34管样品为目的蛋白。
[0020]将所收集的峰B的第26~34管洗脱液经Tricine SDS-PAGE检测，结果如图2所示:1> marker (分子量从上到下分别为 42 kDa, 26 kDa, 17 kDa, 10 kDa , 4.6 kDa) ;2、带HIS标签rLj-RGD3对照；；3、27管样品；4、28管样品；5、29管样品；6、30管样品；7、31管样品；8、32管样品；9、33管样品；10、34管样品。由于rLj-RGD3 (Tag )蛋白为喊性蛋白，其电泳迁移率比正常蛋白小，目的带比预期位置更靠近加样孔方向。表明:第26~34管样品为目的蛋白纯，且为单条带，纯度可达99%以上。
[0021]d-3.透析:
采用截留分子量为10 kDa的透析袋对上述经步骤d-2纯化的蛋白进行4°C过夜透析，透析缓冲液为去离子水。
[0022]e.将经步骤d纯化的蛋白冷冻干燥，制备rLj_RGD3 (Tag-)蛋白冻干粉。
【权利要求】
1.一种去亲和层析纯化标签的基因重组七鳃鳗Lj-RGD3蛋白的制备方法，其特征在于按照如下步骤进行: a.在Lj-RGD3基因序列3’末端引入终止密码子，与载体以NdeI和Hind III酶切位点相连接，转化入表达菌后进行阳性转化子的筛选鉴定； b.对阳性重组子进行IPTG诱导表达； c.对表达的重组蛋白进行提取； d.对提取的蛋白依次按如下步骤进行纯化: d-1.通过金属螯合离子亲和层析柱HiTrap IMAC HP进行蛋白纯化: 将HiTrap IMAC HP柱连接到已经用20 %乙醇冲洗好的BIO-RAD仪器上，用10倍柱体积的蒸馏水对柱子进行润洗，润洗的过程中保持UV值稳定，初始值为O ;用2.5倍柱体积的0.1M浓度的硫酸铜溶液走柱，再用10倍柱体积的蒸馏水冲洗柱子；用10倍柱体积的Binding buffer平衡柱子，保持柱子UV值稳定，UV基线值为O ;将提取的蛋白过柱，之后再用15倍柱体积的Binding buffer平衡柱子,再用Elution buffer洗脱目的蛋白，流速为lml/min ;收集洗脱液为Iml/管，回收第42~54管的样品，保存于_20°C;所述的Bindingbuffer溶液成分由20mM磷酸钠、0.5M氯化钠、5mM咪唑组成；所用的Elution buffer溶液成分由20mM磷酸钠、0.5M氯化钠、500mM咪唑组成； d-2.对所收集的蛋白采用SP柱进行阳离子交换层析: 将阳离子交换柱SP柱连接到BIO-RAD仪器中，用灭菌水清洗柱子，流速为lml/min，洗10个柱体积；用10倍柱体积的低盐缓冲液平衡柱子，流速为lml/min，直至UV基线保持在稳定的水平上，初始值为O ;`将已收集的蛋白过SP柱，再用10倍柱体积的高盐缓冲液洗脱目的蛋白，流速为lml/min ;收集洗脱液为Iml/管，回收第26~34管的样品保存于_20°C ;所用的低盐缓冲液成分由50mM Tris-HCl和50mM NaCl组成，所用的高盐缓冲液成分由50mMTris-HCl 和 IM NaCl 组成；d-3.透析: 采用截留分子量为10 kDa的透析袋对上述经步骤d-2纯化的蛋白进行4°C过夜透析，透析缓冲液为去离子水；d-4.冷冻干燥: 将经步骤d-3透析的蛋白经冷冻干燥，制备rLj-RGD3 (Tag-)蛋白冻干粉。
2.根据权利要求1所述的去亲和层析纯化标签的七鳃鳗rLj-RGD3Tag—基因重组蛋白的制备方法，其特征在于:所述a步骤的在Lj-RGD3基因序列3’末端引入终止密码子，与载体以Nde I和Hind III酶切位点相连接的引物序列为:
Pl: 5’ -XXcatatgtcaacgttcatcaacggaacc-3>
P2: 5’ -XXaagctttcactccccaacacattcact-S’。
【文档编号】C07K1/18GK103694330SQ201310600092
【公开日】2014年4月2日 申请日期:2013年11月25日 优先权日:2013年11月25日
【发明者】李庆伟, 王继红, 孙琳, 王心, 张安伟, 吕莉 申请人:辽宁师范大学