专利名称：含蛋白标签的sumo融合蛋白及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学，涉及蛋白质的翻译后修饰，尤其是SUMO化修饰及其检测。
背景技术：
I. SUMO的发现和同源性
在细胞的翻译过程中，一些靶蛋白可以被修饰物修饰。研究表明翻译后修饰可以决定靶蛋白的命运和功能[1]，其中包括泛素和SUM0。2004诺贝尔化学奖的颁发给以色列科学家阿龙·切哈诺沃、阿夫拉姆·赫什科和美国科学家欧文·罗斯，以表彰他们发现了泛素(ubiquitin)调节的蛋白质降解。翻译后修饰领域得到应有的肯定和重视。SUMO，ISG15，NEDD8 都被称作 ULM(Ubiquitin like domain)，他们在三维结构以及修饰方式上与泛素高度一致[2]。SUMO是近IlKDa的蛋白，在结构上类似于泛素并且同样被连接到靶蛋白的赖氨酸上。SUMO的同源物Smt3最早在酿酒酵母的遗传突变筛选中发现。在1996年，在后来1999年诺贝尔奖得主Blobel的实验室最早发现SUMO (Smt3)能够共价的结合一个小G蛋白的激活蛋白RANGAP1 [3]，影响了此蛋白在细胞核与核质的运输，随后第一次将此类小蛋白命名为SUMO(Smallubiquitin-like modifiers,类泛素化小蛋白类泛素化小蛋白[4]，然后SUMO化修饰在多种生命过程，在多种生物体(酵母，昆虫，线虫甚至高等脊椎动物中被发现[5]，得到阐释。在低等的真核生物如酿酒酵母，昆虫，线虫中只有一种SUMO基因表达，在植物中有8种之多[6]。SUMO在真核生物中有很好的保守性[I]。在脊椎动物中，已经发现了 4种SUMO的同源物SUMOl (Smt3c,PICl,GMPl, sentrin或 Ubll)，SUM02 (Smt3a 或 Sentrin3)，SUM03 (Smt3b 或 Sentrin2)，以及通过基因组范围扫描预测得到的SUM04[7]，现在还并不确切知道SUM04的表达和功能。其中SUM02和SUM03只是在N端的三个氨基酸残基有差别，有时它们亦称为SUM02/3，与SUMOl在序列上有50%的同源性，但已经发现了在功能上的差别[8，9]。现阶段的研究主要集中SUMOl的共价修饰作用，而在[8]推测可能SUM02/3可能具有更大范围修饰的靶目标蛋白，而且除了 RANGAP1被SUMOl特异性的修饰外[8]，更多的情况依赖于细胞环境中的SUMOl和SUM02底物的相对数量，以及细胞所受的外界压力(stress)。现阶段，已经发现了大量的蛋白质存在SUMO化的过程，包括染色质的组装，蛋白质的转录，RNA代谢过程[10-13]。研究蛋白的SUMO化已经成为了当前研究蛋白质翻译后修饰的重要组成部分。同泛素一样，所有的Ubls通过多个酶的级联作用实现对靶蛋白的共价修饰，包括T Ubl激活酶(El)，Ubl转移酶(E2)和具有特异性的Ubl连接酶(E3)。SUMO具有相同的修饰机理。新翻译的SUMO蛋白在C端被剪切从而形成具有GG末端的成熟形式，这种剪切在酵母中有 Ulpl (Ubiquitin-1 ike-protein-specific proteases,泛素样蛋白特异性蛋白酶)催化，在哺乳动物中则有SENPs (sentrin-specific proteases, sentrin特异性蛋白酶)剪切完成[14]。所有的SUMO化修饰公用同样的El活化酶和E2接合酶。这两种酶在结构和催化方式上与泛素化酶系统类似[15]。酵母的El酶是由Aoslp (在脊椎动物中叫做SaeI)和Uba2p (在脊椎动物中叫做SaeII)组成的异质二聚体[16]。Aoslp-Uba2p催化作用下成熟形式的SUMO的C端和Uba2p形成了硫酯键从而使SUMOl得到活化，此过程消耗一个 ATP[17]。2. SUMO和疾病之间的关系SUMO化从分子水平、细胞水平、甚至发育的个体水平影响各种生命活动过程，下面简要介绍下SUMO和疾病之间的关系[18]对许多蛋白来讲，被SUMO共价结合对自身的功能调节是很重要的。现在已经被证明可以被SUMO化的底物中有很多是与疾病相关的，例如癌症、亨廷顿症、阿尔茨海默病、帕金森、脊髓小脑性共济失调和肌萎缩侧壁增生等[19]。SUMO 和癌症
一系列研究都指出SUMO化在肿瘤发生中有作用[18]。例如在许多人类癌症中都有发现UBC9水平的升高，并且过表达UBC9会促进癌细胞的生长[19]。在一些类型的癌症中SUMO E3酶PIAS3也有高的表达[20]，并且患有低生存率肝癌病人的肿瘤中SUMO El酶的蛋白水平也有所提高[21]。另外，许多肿瘤抑制因子的活性受SUMO化的调节，比如p53、p63、p73和Mdm2 [22]。另外，去SUMO化酶SENP在前列腺癌和甲状腺癌中的水平提高[23]。SUMO和神经退行性疾病许多在神经退行性疾病中有重要作用的蛋白都可以被SUMO化。这些神经退行性疾病及相关蛋白包括亨廷顿症(huntingtin),脊髓小脑性共济失调(ataxin_l),帕金森症(tau, a-synuclein, DJ-1),阿尔茨海默症(tau, APP)。APP阿尔茨海默病是最常见的老年神经性疾病，它能降低人的认知能力。现在普遍认为APP通过淀粉样蛋白水解途径产生Ab蛋白是阿尔茨海默产生的原因。而APP蛋白则在体外被证明是SUMO的靶蛋白，而其N端的b-secetase的酶切位置K587或K595可以被SUMOl和SUM02修饰。K587和K595的缺失则增加了 A_beta蛋白的聚集[24]暗示了 sumo化可以降低A-beta的聚集水平。进一步的实验证明过表达SUMO E2酶UBC9可以提高APP的sumo化并降低A-beta的聚集。因此，干预APP的SUMO化反应可以提供另一种治疗阿尔茨海默病的方法。亨廷顿症亨廷顿症病人的蛋白huntingtin的N端有过多的多聚谷氨酸，由此导致了一些神经效应，包括运动功能的降低和认知功能的缺陷。已经证明huntingtinde在N端的Lys6、Lys9和Lysl5位点可以被SUMO化。这些位点的SUMO化被认为可以降低huntingtin的聚集和提高huntingtin的稳定性,从而降低Poly-Q介导的多聚体的毒性[25]。DJ-IDJ-I的功能包括抗氧化，转录促进因子和分子伴侣，在早发性帕金森病中有1-2%是由DJ-I的突变引起的。DJ-I的K130位点可以被SUMO化，被SUMO修饰的DJ-I的Ras依赖的转化和细胞生长促进活性，并且能够使细胞抵抗UV引起的细胞凋亡[26]。3.目前检测SUMO化的方法 SUMO化修饰对靶蛋白的功能起着重要的调节作用，鉴定特定的蛋白在特定的条件下是否能被SUMO修饰就变的异常重要。最直接最充分的方法是将内源的蛋白IP后用质谱分析。其次的方法是将内源蛋白IP后用SUMO抗体做WesternBlot检测。但是对于大部分的修饰靶蛋白来说只有很少比例的蛋白可以被修饰，使得上述两种方法都有困难，所以细胞过表达SUMO来增强靶蛋白的修饰是很多检测方法所采用的[27]。用过表达标签SUMO融合蛋白与质谱联用的方法是高通量检测蛋白翻译后修饰的常见思路，比如6His-SUM0的融合蛋白方法[28]，但这种方法的一个缺点是由于镍柱纯化His融合蛋白时与SUMO非共价结合的蛋白也可能纯化下来而被检测导致假阳性太多。解决的这个问题的办法是在变形条件下用镍柱来纯化，这样可有效去除和SUMO非共价结合的蛋白，例如含有SIM的蛋白等[27]。但是使用镍柱本身系统性问题还存在，镍柱的纯化原理是非共价结合，和哺乳动物细胞裂解液会有非共价结合从而导致假阳性，如果用更加严格的变形条件会使镍柱纯化效率降低而遗漏部分可能的底物。3. I.体外SUMO化检测体系A.用兔网织红细胞转录翻译体系表达被检测蛋白，然后用western blot来检测目的蛋白是否会有迁移条带出现[29]。 B.在体外纯化SUMO酶EI (SAEI，SAEII)、E2、Ubc9和待检测的底物，然后在缓冲液中30°C反应或者4°C过夜，western检测[30]。3. 2.细胞内检测体系A. 6Hi s-SUMO 纯化[30]将Tag-底物和His6_SUM0的表达克隆转染进选定的细胞株内，培养36h后裂解细胞，用Ni+柱将SUMO及其SUMO结合物纯化下来,并用抗-tag的抗体western检测目的条带。B. 6Hi s-SUMO 稳定细胞株[27]此方法是将6His_SUM0整合进目的细胞株基因组，形成稳定的表达株，然后就可以用上述A方法只用转染目的蛋白就可以，也可以不用转染直接检测生理条件下全细胞被SUMO化的蛋白，前提是要有对应蛋白的抗体。C. PRET 方法[31]以上的方法均是以western为基础，而Calsion[31]所发展的方法则是以时间分辨荧光共振能量转移(TR-FRET)为基础的试验方法检测的，在SUMO上连上标记FI，当底物被SUMO修饰后，抗底物上tag的抗体上的Tb激发Fl从而可以被检测到，这种方法特别适合于高通量筛选底物。4.常用蛋白标签(Tag)目前蛋白Tag的主要作用是用来蛋白纯化和显影葡萄球菌蛋白A (Protein A)和LacZ是最早用来亲和纯化蛋白的两个标签,蛋白A是具有280个氨基酸的肽段，可以增强异源蛋白的稳定性和表达量，但是由于需要用IgG来亲和层析并且在PH比较低的条件下纯化，对融合蛋白的功能活性会有影响并且使用免疫方法分析蛋白复杂化。LacZ，也叫β_半乳糖苷酶，是具有蛋白水解稳定性的1024个氨基酸的肽段，可以和固定化的APTG亲和层析而得到纯化，但是由于蛋白太大会影响融合蛋白的功能活性而且在纯化条件下容易形成四聚体而现在不常用于蛋白纯化[32]。His标签最早在1991年His标签与被固定的金属离子被用于纯化半乳糖脱氢酶。一般常用的是6His标签，它可以和二价的金属离子相互非共价结合从而将融合蛋白纯化出来，事实上2-10个His都可以用来与金属离子结合，金属离子包括Co2+，Cu2+，Ni2+，Zn2+，Ca2+甚至Fe3+，其中以固定化的Ni2+最为常用，对于不同的蛋白也可根据经验来选择金属离子。His tag由于很小很少对蛋白的功能造成影响，在原核表达体系中是比较理想的纯化标签，但是在昆虫和哺乳动物表达体系中由于很多蛋白具有多His序列导致纯化的背景很强，所以不适于用于昆虫和哺乳动物表达体系。谷胱甘肽转移酶(GST)蛋白标签pGEX蛋白纯化系统被广泛采用，此质粒编码谷胱甘肽转移酶的N端肽段——通常所说的GST蛋白标签[34]。GST融合蛋白可以和谷胱甘肽琼脂柱相结合而得到层析纯化，但是由于细胞裂解液中的Y-谷酰基转肽酶对谷胱甘肽的影响，谷胱甘肽亲和柱使用寿命有限，只能重复使用4-20次。另外，26kDa的GST还可以在结合柱上从融合蛋白上移除，从而得到感兴趣的蛋白[32]。GST标签的缺点是表达的融合蛋白容易形成包涵体，由于GST与谷胱甘肽的结合需要三维结构，所以还要将包涵体复性才能得到纯化。另外就是GST标签比较大，而且还容意形成二聚体，会对融合蛋白的功能活性有所影响。
麦芽糖结合蛋白-MBP标签能够编码MBP融合蛋白的E. Coli表达系统pMAL在1988年建立[35]。麦芽糖结合蛋白分子量45kDa，可以促进融合蛋白的表达量和可溶性。MBP融合蛋白一般用商业化的淀粉交联柱来亲和纯化，和谷胱甘肽柱一样，细胞裂解液也能减少淀粉交联柱的使用寿命，一般可以只使用3-5次。和GST—样，由于MBP分子量比较大，也会对融合蛋白的功能活性有影响。另外，MBP不能直接在纯化柱上切下，只能在游离的蛋白中切除，随后去除游离MBP有增加了蛋白纯化的复杂度。几丁质内含子结合蛋白(Intem-Chitin Binding Domain, Intein-CBD)Intein-CBD是可以自我剪切而不需要外加蛋白酶就可以得到原生蛋白的蛋白标签，来自与几丁质结合蛋白的内含子。Intein-CBD大肠杆菌表达质粒系统在1997年建立[36]。CBD融合蛋白可以通过和几丁质树脂结合而得到纯化，商业化的几丁质树脂可以至少重复利用五次，非特异性的结合可以用高盐或去垢剂洗除。几丁质内含子的剪切需要在50mM DTT条件下4摄氏度过夜。Avi标签:AviTag蛋白是含有15个氨基酸的肽段，可以被体内或体外的生物素连接酶生物素化，而且抗生物素蛋白或链霉亲和素可以专一地与生物素结合，基于这两个反应，AviTag 技术可以应用于蛋白的固定，纯化和显影[37，38]。固定化的AviTag标签融合蛋白的应用广泛，包括从高通量筛选到表面等离子体共振检测蛋白间相互作用等方面。与抗生物素或链霉亲和素结合之后，AviTag标签融合蛋白就可以被多种方法检测，例如Western Blots和T细胞染色与分选中的MHC四聚体。SNAP标签SNAP蛋白标签是分子量为20kDa 06-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶的突变蛋白，可以用06-烷基鸟嘌呤来共价标记。和其他标记标签相比，SNAP在细胞内特异性标记不受细胞分区的影响，并且不需要添加额外的试剂[40]。SNAP所带的活性巯基位点可以接受了苯甲基鸟嘌呤所携带的侧链苯甲基基团，释放出了鸟嘌呤，这种新的硫醚键共价结合使SNAP所带的目的蛋白携带上了苯甲基基团所带的标记物。苯甲基鸟嘌呤在生化条件下稳定，并且没有其他蛋白会和这类物质作用，所以SNAP标签反应是高特异的[41]。除了荧光标记，还可以事先将SNAP标签的底物一苯甲基鸟嘌呤固定在基质表面或纯化柱上，然后混合提取液中的融合蛋白即可特异与底物作用，形成共价键，融合蛋白间接固定在了基质表面或纯化出蛋白[42]。Halo标签HaloTag 标签蛋白是一种齒化烷脱齒素酶的遗传修饰衍生物，原生酶的分子量为33KDa的单体蛋白，可以切除卤代脂肪族化合物中的碳卤键，通过卤代烷烃对酶Aspl06位的亲核攻击从而在Halo配体和Halo蛋白之间形成共价酯键，由于Halo蛋白在催化三联体中有一个关键突变(His272突变为Phe)从而使此酯键不会水解而得到稳定[43]。Halo蛋白标签能融合在重组蛋白的N端或C端,并在原核或真核系统中表达。Halo标签的配体由两个关键组分组成一个通用的HaloTag反应联结子,结合HaloTag蛋白；另一个是功能基团，例如荧光 染料或亲和媒介，从而使Halo标签具有蛋白定位显影标记和富集等作用[44，45]。在文章[30]中作者将Tag-底物和His6-SUMO的表达克隆转染进选定的细胞株内，培养36h后裂解细胞，用Ni+柱将SUMO及其SUMO结合物纯化下来，并用抗-tag或感兴趣蛋白的抗体western检测目的条带的迁移可以确定待检测蛋白是否具有被修饰的能力。由于6His标签和Ni +柱的结合是非共价结合，用此种方法拉下来的总蛋白中总会有没有被SUMO化修饰的蛋白，比如说含有SIM(SUMO-Interaction-Motif)的蛋白和与SUMO修饰蛋白相互作用的蛋白[27]。在文章[27]中，作者在变性的条件下用6His和Ni+柱纯化体系来去除非特异性结合蛋白，但是此条件下有可能降低Ni+纯化效率。这个问题的一个解决办法就是通过采用共价结合方法来富集总蛋白的标签来和SUMO融合从而在变性条件下去除非与SUMO非共价结合的杂蛋白并且不会影响被修饰总蛋白的富集效果。
发明内容
本发明提供一种如下所示的融合蛋白Tag-SUMO其中，Tag表示蛋白标签，选自Avi标签，SNAP标签和Halo标签，SUMO即类泛素化小蛋白，所述融合蛋白具有SUMO化能力。实施方式之一中，所述融合蛋白包含有柔性连接肽，如下所示Tag-L-SUMO其中，L表示柔性连接肽。柔性连接肽的作用在于避免蛋白标签和SUMO之间在空间上相互干扰，是融合蛋白技术中的常用技术和常用元素，本领域技术人员可以在大量现成的柔性连接肽中进行选择，也可根据普遍原则和具体需要方便地自行设计。例如，本发明采用9个氨基酸的柔性连接肽。实施方式之一中，本发明选用了 SSGLVPRGS所示的柔性连接肽。如前所述，SUMO分子在结构上与高度一致，具有相同的修饰机理。因此，本发明SUMO可选用任一类泛素化小蛋白，尤其是其成熟形式。实施方式之一中，SUMO部分是人类SUMOl的成熟形式(NCBI登录号NP_001005781的蛋白质，登录号NM_001005781的编码核酸(mRNA)，http://www. ncbi. nlm. nih. gov/protein/54792065 from = l&to = 97&report=gpwithparts)其编码核苷酸序列为atgtctgaccaggaggcaaaaccttcaactgaggacttgggggataagaaggaaggtgaatatattaaactcaaagtcattggacaggatagcagtgagattcacttcaaagtgaaaatgacaacacatctcaagaaactcaaagaatcatactgtcaaagacagggtgttccaatgaattcactcaggtttctctttgagggtcagagaattgctgataatcatactccaaaagaactgggaatggaggaagaagatgtgattgaagtttatcaggaacaaacggggggt (SEQ IDNO 12)。本发明还提供一种核酸分子，可以是编码本发明融合蛋白的核酸分子或其互补链。本发明还提供一种载体，加载了以上所述的核酸分子，优选表达载体，例如原核生物表达载体，即能够在原核宿主细胞内表达目标蛋白的载体，和哺乳动物表达载体，即能够在哺乳动物细胞内表达目标蛋白的载体，这些都是本领域技术人员所熟悉的。本发明还提供一种在体外SUMO化修饰体系中检测SUMO化的方法，包括在体外SUMO化修饰体系中，将被检测蛋白与本发明的Tag-L-SUMO融合蛋白接触，然后检测被检测蛋白的SUMO化产物。体外SUMO化修饰体系之前已经建立，是将SUMO化修饰酶体系中的Ubl激活酶(El)(脊椎动物中的SaeI和SaeII)与Ubl转移酶(E2) (Ubc9)分别体外纯化，最后将SUMOl和待检测的靶蛋白加入该体系进行反应[46] 检测蛋白SUMO化产物的方法也是本领域技术人员所熟悉的，例如免疫沉淀(IP)、质谱(MS)、WesternBlot检测、时间分辨荧光共振能量转移法(TR-FRET)、电泳、蛋白质或肽或其它标签法、亲和及其它层析、免疫荧光，以及它们的联用等。本发明还提供一种体外检测SUMO化的系统，包含本发明的Tag-L-SUMO融合蛋白，纯化的Ubl激活酶(El)，Ubl转移酶(E2)和Ubc9,以及SUMO化反应缓冲液[30]。可以将所述系统包装为试剂盒的形式，其中包括装有上述组分的容器和关于使用该试剂盒体外检测SUMO化的说明。本发明还提供一种细胞内检测SUMO化的方法，包括用编码本发明的Tag-L-SUMO融合蛋白的核酸分子，可选的编码Ubc9的核酸分子和/或可选的编码待检测蛋白的核酸分子共转染宿主细胞，培养宿主细胞，裂解细胞，检测被检测蛋白的SUMO化产物。生理条件下检测蛋白SUMO化是不需要共转染过表达Ubc9和待测蛋白的，如参考文献[39，Kim, 2006]和[13，Tatham, 2009]所述。所述宿主细胞优选动物细胞，例如Hela细胞。转染动物细胞的方法是本领域技术人员所熟悉，例如Lip0-Plus转染法。实施方式之一中，还包括在检测蛋白SUMO化产物之前通过免疫沉淀或亲和层析步骤处理细胞裂解物。通过用免疫沉淀\亲和层析\磁珠纯化方法处理细胞裂解液可以进一步的富集待检测底物，便于后续的检测。实施方式之一，细胞内检测SUMO化的方法包括(I).将被检测蛋白的ORF装载到表达载体中，优选Mll，⑵.将步骤⑴制备的载体同本发明的Tag-L-SUMO融合蛋白和Ubc9的表达载体一同转染到宿主细胞中，优选Hela细胞，所述融合蛋白优选SNAP-L-SUM0或Halo-L-SUMO融合蛋白，(3).培养细胞以获得各蛋白的表达，⑷.收细胞后检测被检测蛋白的SUMO化产物，例如通过电泳(例如PAGE胶)和免疫荧光方法鉴定是否有蛋白条带迁移来检测SUMO化产物。本发明还提供一种检测细胞内SUMO化的系统，包含编码本发明的Tag-L-SUMO融合蛋白的表达质粒，可选的编码Ubc9的表达质粒和转染试剂。所述融合蛋白优选SNAP-L-SUM0或Halo-L-SUMO融合蛋白。所述转染试剂指完成转染所需的各种辅剂，例如转染诱导剂、强化剂等，例如Lip0-Plus转染法中的Iipo转染剂和plus转染剂。可以将所述系统包装为试剂盒的形式，其中包括装有上述组分的容器和关于使用该试剂盒体外检测SUMO化的说明。本发明还提供一种筛选SUMO化蛋白底物的方法，包括提供作为SUMO化底物的候选蛋白，优选在高置信条件下用预测蛋白的被SUMO化能力的分析软件筛选作为SUMO化底物的候选蛋白，检测候选蛋白的SUMO化，所述检测采用本发明所述在体外SUMO化修饰体系中检测SUMO化的方法，或者采用本发明所述细胞内检测SUMO化的方法，或者两者的联用，若检测到候选蛋白的SUMO化产物，表明候选蛋白是SUMO化蛋白底物。本发明还提供一种检测细胞内可被SUMO修饰的靶蛋白的方法，包括
·
在细胞内重组表达SNAP-SUM0融合蛋白，将细胞裂解液与结合、优选共价结合所述融合蛋白中标签的载体接触，所述载体优选微载体，例如珠粒可选性地包括在变性条件下去除非特异非共价结合的杂蛋白，所述变性条件是指在纯化过程中可以使用任何严格的条件使非共价结合的蛋白洗除得到低背景的质谱结果。这样的变形条件是本领域技术人员所知道的，例如SNAP使用中的变性条件[见前文]。His等非共价纯化则不能使用此条件。分析与载体接触的祀蛋白信息,例如采用WesternBlot或者MS等方法。本发明所述Tag-L-SUMO融合蛋白或编码本发明Tag-L-SUMO融合蛋白的核酸分子可用于制造诊断SUMO化相关疾病的制剂的用途，所述疾病例如癌症、亨廷顿症、阿尔茨海默病、帕金森、脊髓小脑性共济失调和肌萎缩侧壁增生。本发明采用的是不同于6His纯化的标签Avi，SNAP和Halo。Avi生物素化后有非常强的亲和力，甚至强于某些共价键；SNAP和Halo是最近常用的细胞内显影蛋白标签，可以和底物形成共价键从而得以纯化和标记。用共价键纯化系统要比His变性体系方法步骤简单并且理论上有更少的假阳性。本发明建立了 SNAP标签融合SUMO蛋白的方法来检测可被SUMO修饰的靶蛋白。SNAP标签在生物学上可用于显色标记、蛋白纯化，本方法的基本原理为在细胞内表达SNAP-SUM0融合蛋白一段时间后用可与SNAP标签共价结合的珠粒(Beads)拉出所有被SNAP-SUM0修饰的靶蛋白，然后用WesternBlot或者MS进行分析可得到所有靶蛋白信息。相较于其他检测蛋白SUMO化的方法，此方法在细胞内能够高效的对蛋白进行SUMO化修饰，并能够利用成熟方法拉出(pull-down)所有被融合蛋白SUMO化修饰的革巴蛋白，还能够在变性条件下有效去除非特异非共价结合的其他杂蛋白，从而得到比较准确的检测结果。同时还可以将此方法与质谱连用，能够高通量检测全细胞蛋白的SUMO化修饰。利用建立的SNAP-SUM0融合蛋白的检测方法小规模的从14个转录因子中筛选出F0XP2和ESXl两个可以被SUMOl修饰的蛋白，并在体外进行了验证，第一次阐释了 SUMO化修饰可能在这两个蛋白所参与的人类语言形成和生殖系统发育过程中发挥重要作用。由此可以预见，可以通过调控F0XP2和ESXl的SUMO化来调控人类语言形成和生殖系统发育过程。例如，可以预见，F0XP2和ESXl的SUMO化调节剂可用于制备人类语言和精子发生的药物。本发明将Avi，SNAP和Halo标签技术应用到SUMO翻译后修饰检测体系中，并且首次在细胞内和体外阐释了这三种标签SUMO融合蛋白对靶蛋白修饰能力和效率的影响。在Hela细胞过表达体系中，用已知的靶蛋白RANGAP1和SARTl作为阳性底物结果显示，成熟形式的Avi-L-SUMOl，SNAP-L-SUM01和Halo-L-SUMOl都能够对靶蛋白修饰，而且和不带蛋白标签的SUMOl相比，SNAP-L-SUMOI与Halo-L-SUMOl对底物的修饰能力更强(图3)，甚至在不用富集的条件下就可以看到修饰的迁移条带，在Hela细胞过表达体系中四种SUMOl的修饰能力关系为SNAP-L-SUM01 > Halo-L-SUMOl > Avi-L-SUMOl = SUMOl。用在大肠杆菌中纯化的Ubl激活酶(El)，Ubl转移酶(E2)，SUMOls建立的体外修饰体系结果表明，不带标签(除去纯化标签6His，后同)的SUMOl对每种阳性底物都有很好的修饰活性，但是Avi-L-SUMOl，SNAP- L-SUMO I和Halo-L-SUMOl的修饰依据底物不同有所改变，比如对Topl-I的修饰能力和SUMOl相当，对SARTl的修饰能力弱于SUM01，但对RANGAPI的几乎检测不到迁移的修饰条带(图2)。这和在Hela细胞过表达的情况差别很大，也决定了此三种标签融合蛋白不适合用于体外SUMO化修饰的检测，但是可以辅佐证明细胞实验的结果。本发明在Hela细胞过表达体系中证明了 SNAP/Halo-L-SUMOl可以用于SUMO化修饰检测，并且与SUMOl相比SNAP/Halo-L-SUMOl修饰效率高以至于不用富集直接用裂解液Western就可以检测到蛋白修饰迁移条带。此检测体系相比其它反应体系更加简单通用，很适合小批量的检测SUMO化底物。本发明选用效率最高的SNAP-L-SUM01小范围的筛选SUMO化底物进一步证明该高表达体系的作用。用SUM0sp2.0根据一些原则选出了 14个人转录因子(表3)，分别和SNAP-L-SUM01和E2共转染进Hela细胞，筛选到两个转录因子F0XP2和ESXl有迁移条带，进一步用SUMO特异的Ulpl酶切和体外反应体系验证确实是被SNAP-L-SUM01 修饰(图 4)。F0XP2 (Forkhead Box P2)位于人类染色体7q31，主要剪切体是具有715个氨基酸的Forkhead家族转录因子。突变的F0XP2能引起严重的遗传性说话和语言障碍[47]，而同源基因FOXPI，F0XP3, F0XP4在癌症中起作用[48]。人和黑猩猩的F0XP2在进化中有两个氨基酸的差别，目前认为正是这两个氨基酸的突变促进了人类的进化加速。马普人类进化学院的Svante Paabo通过将人F0XP2两个氨基酸位点引入到小鼠Foxp2，这些小鼠大体上健康，但是却有不同性质的超声发音[49]。相比黑猩猩F0XP2，人类F0XP2在人神经细胞中可以显著的上调了 61个基因和下调55geneS，这些基因可能参与人与黑猩猩言语差异的分子机制[50]。有实验证据显示Wnt信号转导通路中的Lefl可以与foxP2基因增强子结合，在CNS发育过程中Lefl对于foxP2的表达是必须的，说明F0XP2的上游受wnt信号调控[51] ο Foxp2还可与Nkx2. I的homeodomain相互作用从而抑制了 Nkx2. I介导的SP-C的转录[52]。现在发现了 F0XP2有SUMO化修饰，进一步可以确定SUMO化修饰的具体位点，研究SUMO化可能会改变F0XP2的空间定位或与蛋白质相互作用从而控制下游基因的转录或其它行为，乃至影响到人类语言的形成。人 ESXl (Extraembrionic spermatogenesis homeobox lgene, Xq22. 2)选择性表达在睾丸、胎盘、脑和肺组织中[53，54]，基因敲除雄性小鼠在精子发生没有明显的缺陷，但是会影响雌性小鼠的胚胎发育和胎盘大小[55]。人源ESXl和鼠源的Esxl都含有谷氨酸富集的具有同源异形结构域N端和脯氨酸富集的C端。全长的ESX165kDa,可以酶水解为N端45kDa和C端20kDa的两条肽,N端蛋白定位在核中作为转录因子而C端肽端在细胞质中稳定Cyclin[56]。ESXl人和鼠之间有34%的序列差异，这些差异大部分都在C端。生物信息学分析表明在灵长类动物中ESXlC端的进化速率大于X染色体上的进化速率，属于阳性选择，这也表明了 ESXl参与雄性生殖。人源ESXl在培养细胞中能够阻止有丝分裂Cyclin降解，ESXl的过表达可以使CyclinA和CyclinBI的聚集从而使细胞静息在M期[57]。ESXl作为SUMO化靶蛋白这一发现对ESXl进一步的研究提供了新的方向，暗示了 SUMO可能在生殖系统调控上也发挥重要作用。用SNAP-L-SUM01在细胞过表达体系中检测出两个SUMO化修饰靶蛋白F0XP2和ESXl，在低通量水平上证明了 SNAP-L-SUM01可以用于SUMO化底物的检测。用SNAP纯化珠将过表达细胞体系中所有SNAP-L-SUMO修饰的蛋白富集下来并用质谱方法分析可以在高通量水平上检测整个基因组在特定条件下的SUMO化修饰靶蛋白。考虑到SNAP的共价亲和特性，这种高通量方法理论上比6His标签检测体系更为精确。
图I :Tag-L-SUM01s融合蛋白在Hela细胞的表达和在大肠杆菌中的表达纯化； (A)显示 SUMO I、Avi-L-SUMO I、SNAP-L-SUMO I 和 Halo-L-SUMO I 在 Hela 中的过表达，LacZ 为阴性对照；(B)、(C)和(D)分别显示 Avi-L-SUMOl、SNAP-L-SUMO I 和 Halo-L-SUMOl体外的表达与纯化，其中，CC :对照细胞；IC :诱导表达细胞；CS :细胞上清；CP :细胞沉淀；Ft :穿出液；WS :洗脱液；10 :用含浓度为IOmM咪唑的洗脱缓冲液冲洗Beads流出液；250 用含浓度为250mM咪唑的洗脱缓冲液冲洗Beads流出液。图2 :用体外SUMO化体系检测SUM01融合蛋白的SUMO化修饰能力。A :检测SUM01，Avi-L-SUMOl、SNAP-L-SUMO K Halo-L-SUMOl 对靶蛋白 Topl-1-flag 的 SUMO 化修饰能力，SI 为不带标签蛋白的 SUM01，Avi/SNAP/Halo-Sl 分别表示 Avi-L-SUMO I、SNAP-L-SUMOI、Halo-L-SUMO I ;B :检测 SUMO 1，Avi-L-SUMO I、SNAP-L-SUMO K Halo-L-SUMOl 对靶蛋白 Flag-SARTl 的 SUMO 化修饰能力；C :检测 SUM01，Avi-L-SUMOl, SNAP-L-SUM0KHalo-L-SUMOl 对靶蛋白 Flag-RANGAPl 的 SUMO化修饰能力；D :f Iag-RANGAPl 和 Flag-SARTl在体外的表达与纯化，其中，CC :对照细胞；IC :诱导表达细胞；CS :细胞上清；CP :细胞沉淀；Ft :穿出液；WS :洗脱液；10 :用含浓度为IOmM咪唑的洗脱缓冲液冲洗Beads流出液；250 :用含浓度为250mM咪唑的洗脱缓冲液冲洗Beads流出液。图3 :Hela细胞过表达实验检测标签-SUM01融合蛋白的SUMO化修饰能力。A :检测SUM01, Avi-L-SUMOl,SNAP-L-SUM0KHaIo-L-SUMOI 对靶蛋白 Flag-SARTl 的 SUMO 化修饰能力，其中，-:LacZ 质粒，SI :无标签 SUM01，Avi-Sl =Avi-L-SUMO 1，SNAP-S I SNAP-L-SUM0LHalo-S I Halo-L-SUM0 I ;B :检测 SUMO LAvi-L-SUMO I、SNAP-L-SUMO UHalo-L-SUMOI对靶蛋白Flag-RanGAP I的SUMO化修饰能力，其中，-LacZ质粒，NT :无标签SUM01，Avi Avi-L-SUMOl, SNAP SNAP-L-SUMO I, Halo Halo-L-SUM0 I。图4 :在Hela细胞系与体外SUMO化修饰体系证明F0XP2和ESXl可以被SUMO化。A :在Hela细胞过表达体系中Flag-F0XP2可以被SNAP-L-SUM01修饰；B :体外验证Flag-F0XP2 的 SUMO 化修饰。NT :无标签 SUM01，SNAP SNAP-L-SUMO I ；C :在 Hela 细胞过表达体系中Flag-ESXl可以被SNAP-L-SUM01修饰；D :体外验证Flag_F0XP2的SUMO化修饰。SNAP-SUM0 I :SNAP-L-SUM0 I。
本发明的实施方式除非特别说明，本发明所用术语的含义均按照相关领域公知的广义含义来理解。I.材料与方法I. I质粒的构建
I. I. I.材料与产物将SUMOl成熟蛋白的编码序列以EcoRl/XhoI双酶切位点分别装载到pET28a和M02 中得到质粒 SUM01-pET28a 与质粒 SUM01_M02Rx。以 SUM01-M02Rx 为模板用引对 P1/P2PCR 得 linker-SUMOl (人类 SUM01NG011679的成熟形式)的0RF，然后以限制性内切酶对ACC65I/NotI消化并分别装载到预先酶切好的 M05、M24. Ix 和 M49x 载体中，从而得到 Iinker-SUMO I-MO 5、linker-SUM01_M24· Ix、linker-SUM01-M49x。“linker” 或缩写 “L” 表示柔性连接肽 Avi-1 inker-SUMO l_pET28a、SNAP-Iinker-SUM01-pET28a、Halo-Iinker-SUM01-pET28a 贝丨J 是以 linker-SUM01_M05、linker-SUM01-M24. lx、linker-SUM01_M49x 质粒为模板用引物对 P3/P2、P4/P2、P5/P2PCR后限制性内切酶消化后装载到pET28a后得到。人类基因RANGAP1 (NM_002883. I)、F0XP2 (NM_148899)、ESXl (AK097704. I)，SARTl (BC001058. 2)基因模板均从Genecopoeia公司获得，分别通过引物对P6/P7，P8/P9，P10/P11 装载到 Mll 和 flag-pET28a 载体中得到质粒 FLAG-RANGAPl-pET28a，RANGAPl-Mll，FLAG-ESXI-pET28a,FLAG-F0XP2-pET28aο FLAG_SARTl_pET28a 和 SART1-M11 则通过直接酶切亚克隆获得。其他质粒均从Genecopoeia 公司得到，包括 DID01-M11，EPASl-MlI,MGC29891-M11, MYBL2-M11， NFIL3-M11， L3MBTL-M11, MYEF2-M1I, ESRRG-MlI, ERG-MlI,MLXb-Mll, F0XA2-M11, CREB5-M11, ATF4-M11, F0XM1-M11, LCORL-Ml I, ATF6-M11,FAM48A-M11。载体信息pET28a Jnvitrogen公司，带6His蛋白标签,用于在大肠杆菌株BL21中用IPTG诱
导蛋白表达纯化。MO2Rx :Genecopoeia公司，不带标签,哺乳动物细胞表达载体,本发明中用于转染Hela细胞。MO5 Genecopoeia公司，带N端Avi标签,哺乳动物细胞表达载体，本发明中用于转染Hela细胞。Mil :Genecopoeia公司，带N端flag标签,哺乳动物细胞表达载体,本发明中用于转染Hela细胞。M24. Ix =Genecopoeia公司，带N端SNAP标签，哺乳动物细胞表达载体，本发明中用于转染Hela细胞。M49x Genecopoeia公司，带N端Halo标签,哺乳动物细胞表达载体，本发明中用于转染Hela细胞。引物信息
权利要求
1.一种如下所示的融合蛋白Tag-SUMO 其中，Tag表示蛋白标签，选自Avi标签、SNAP标签和Halo标签， SUMO即类泛素化小蛋白； 所述融合蛋白具有SUMO化能力。
2.如权利要求I所述的融合蛋白，如下所示Tag-L-SUMO 其中，L表示柔性连接肽。
3.如权利要求2所述的融合蛋白，L是9个氨基酸的柔性连接肽，例如SSGLVPRGS所示的柔性连接肽。
4.如权利要求I所述的融合蛋白，所述SUMO是人类SUMOl的成熟形式。
5.一种核酸分子，选自编码权利要求1-4中任一项所述融合蛋白的核酸分子或其互补链。
6.—种载体，加载了权利要求5所述的核酸分子,优选表达载体,例如原核生物载体和哺乳动物表达载体。
7.一种在体外SUMO化修饰体系中检测SUMO化的方法，包括 在体外SUMO化修饰体系中，将被检测蛋白与权利要求1-4中任一项所述的 融合蛋白接触， 检测被检测蛋白的SUMO化产物。
8.—种体外检测SUMO化的系统，包含权利要求1-4中任一项所述的融合蛋白，纯化的Ubl激活酶(El)，Ubl转移酶(E2)和Ubc9，以及SUMO化反应缓冲液，所述系统优选试剂盒形式。
9.一种细胞内检测SUMO化的方法，包括 (1)用编码权利要求1-4中任一项所述融合蛋白的核酸分子转染宿主细胞； (2)培养宿主细胞，获得蛋白表达； (3)裂解细胞； (4)检测被检测蛋白的SUMO化产物。
10.如权利要求9所述的方法，其中，步骤I)还包括用编码Ubc9的核酸分子转染宿主细胞。
11.如权利要求9所述的方法，其中，步骤I)还包括用编码待检测蛋白的核酸分子转染宿主细胞。
12.如权利要求9所述的方法，其中，还包括在步骤4)之前通过免疫沉淀或亲和层析步骤处理步骤3)所得细胞裂解物。
13.如权利要求9所述的方法，包括 (1).将被检测蛋白的ORF装载到表达载体中，所述载体优选Mll， (2).将步骤(I)制备的载体、权利要求1-4中任一项所述融合蛋白的表达载体和Ubc9的表达载体一同转染到宿主细胞中，优选Hela细胞，所述融合蛋白优选SNAP-L-SUM0或Halo-L-SUMO融合蛋白， (3).培养细胞，获得各蛋白的表达，(4).收细胞后检测被检测蛋白的SUMO化产物，例如用WesternBlot法、电泳、免疫荧光或其组合来检测。
14.一种细胞内检测SUMO化的系统，包含编码权利要求1-4中任一项所述融合蛋白的表达质粒，和转染试剂，，优选试剂盒形式。
15.如权利要求14所述细胞内检测SUMO化的系统，还包含编码Ubc9的表达质粒。
16.如权利要求14所述细胞内检测SUMO化的系统，所述融合蛋白是SNAP-L-SUM0或Halo-L-SUMO融合蛋白。
17.—种筛选SUMO化蛋白底物的方法， 提供作为SUMO化底物的候选蛋白，例如在高置信条件下用预测蛋白的被SUMO化能力的分析软件筛选作为SUMO化底物的候选蛋白， 检测候选蛋白的SUMO化，所述检测采用权利要求7所述体外SUMO化修饰体系中检测SUMO化的方法，或者采用权利要求9至13中任一项所述细胞内检测SUMO化的方法，或者两者的联用， 若检测到候选蛋白的SUMO化产物，表明候选蛋白是SUMO化蛋白底物。
18.一种检测细胞内SUMO修饰的靶蛋白的方法，包括 (1)在细胞内重组表达权利要求1-4中任一项所述的融合蛋白； (2)将细胞裂解液与结合、优选共价结合所述融合蛋白中标签的载体接触，所述载体例如微载体，例如珠粒； (3)分析与载体接触的祀蛋白信息，例如WesternBlot或者MS分析。
19.如权利要求18所述的方法，步骤(3)之前还包括在变性条件下去除非特异非共价结合的杂蛋白。
20.权利要求1-4中任一项所述融合蛋白或权利要求5所述核酸分子用于制造诊断SUMO化相关疾病的制剂的用途，所述疾病例如癌症、亨廷顿症、阿尔茨海默病、帕金森、脊髓小脑性共济失调和肌萎缩侧壁增生。
21.F0XP2和ESXl的SUMO化调节剂用于制备人类语言和精子发生的药物的用途。
全文摘要
本发明提供含蛋白标签的SUMO融合蛋白及其应用，尤其是在体外和体内系统中检测SUMO化以及筛选和检测SUMO化底物的应用。
文档编号A61P25/00GK102766214SQ20111011467
公开日2012年11月7日 申请日期2011年5月5日 优先权日2011年5月5日
发明者杨淑伟, 焦少灼 申请人:中国科学院上海生命科学研究院