磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-叶酸修饰的纳米紫杉醇脂质体及其制备方法

专利名称：磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-叶酸修饰的纳米紫杉醇脂质体及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种治疗肿瘤的药物，具体涉及一种磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇 2000-叶酸修饰的纳米紫杉醇脂质体及其制备方法；本发明还涉及所述脂质体在制备治疗卵巢癌药物方面的应用。
背景技术：
细胞毒性药物在对肿瘤进行化疗时，常因药物不能在肿瘤部位达到有效浓度而导致化疗失败，同时也会增加毒副作用。卵巢癌是妇科肿瘤的元凶，死亡率很高。因为卵巢癌>90%为叶酸受体阳性表达， 表达量高，而正常卵巢上皮叶酸受体阴性，在叶酸受体(叶酸)介导的卵巢癌靶向治疗中， 将药物与叶酸结合，利用叶酸受体在肿瘤细胞的过度表达，以叶酸受体为作用靶点，即可将药物主动靶向肿瘤细胞，从而提高药物在肿瘤组织分布，达到靶向诊断、治疗的目的。紫杉醇是临床常用的有效治疗卵巢癌的药物。纳米技术是药物传输的良好工具和载体方法新颖，装载药物量大，体积小易于进入细胞；在机体内可被生物降解从而不造成对机体毒害。因此叶酸偶联纳米紫杉醇脂质体是对卵巢癌非常有效的靶向治疗药物。以下文献报道了不同的叶酸-紫杉醇脂质体及其制备方法1, Yuan H, Miao J, Du YZ, et al. Cellular uptake of solid lipid nanoparticles and cytotoxicity of encapsulated paclitaxel in A549cancer cells. Int J Pharm. 2008Feb 4 ；348 (1-2) :137_45Yuan中，分别制备了聚乙二醇修饰的紫杉醇脂质体和叶酸偶联紫杉醇脂质体。但是该方法制备的脂质体有如下缺点一是制备脂质体所用的原料仅有硬脂酸，缺乏胆固醇等对脂质体膜起稳定作用的物质，造成脂质体膜的流动性较强，包封的药物容易泄漏；二是叶酸偶联紫杉醇脂质体仅将叶酸与脂肪酸相连接，中间没有聚乙二醇连接， 制成的脂质体在体内代谢过快，影响药效，而不具备长循环脂质体延缓药物代谢，增加体内循环时间等优越性；三是制成的两种脂质体粒径均较大，分别为374. 3 士 9nm, 369. 3 士 49. 3nm，所以药效很低对A549细胞(肺腺癌细胞)的IC5tl分别为1.86士0. 13 μ g/ml，0. 21 士0. 02 μ g/ ml。远大于本发明制备的叶酸偶联纳米紫杉醇的粒径140. 5士 10. 3nm，及对SKOV 3细胞的 IC50 0. 027 士 0. 002 μ g/ml，药效远低于本发明的药物。2、k folatere ceptor-targeted liposomal formulation for paclitaxel Jun Wu, Qing Liu, Robert J. Lee. A Folate receptor-targeted liposomal formulation for paclitaxe 1[J]. International Journal of Pharmaceutics. 316(2006) 148 153。
备中先将DSPE-PEG-FA (磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-叶酸)放入脂材中，然后用薄膜分散-挤压法制备叶酸偶联纳米紫杉醇脂质体。在容器中分别加入紫杉醇、磷脂、胆固醇和无
3水乙醇，溶解后除去乙醇，当容器内容物呈薄膜状附着于容器壁时，加入水并进行超声波震荡，然后将所得混合物用挤压器通过0. Ium的微孔滤膜，即得紫杉醇纳米脂质体混悬液；该方法制备的脂质体有如下缺点一是所得到的脂质体连接叶酸前后的粒径变化较大，加靶前紫杉醇脂质体粒径在 60nm左右，加靶后增大约30nm左右。原因在于制备中DSPE-PEG-FA(磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-叶酸)的FA侧(即亲水性的靶头叶酸端)在制备中有可能隐藏于脂质体内部 (位于双层磷脂之间的水相中)，可能会减弱叶酸的靶向能力；二是药效也较低，对KB细胞(人口腔鳞癌细胞)的IC5tl为0.048um;而本发明制备的药物与文献1的包封率相近，对SK0V3细胞的IC50仅为0. 036nm。三是磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-叶酸在脂质体中含量较高，与磷脂的摩尔比达0.5%，由于其中的叶酸可与人体内的叶酸受体结合，而导致用药者正常叶酸摄入的不足，引起疾病，如巨幼细胞性贫血，周围神经病。3、A Folate Receptor Targeted Lipid Nanoparticle Formulation for a Lipophilic Paclitaxel ProdrugPhillip J. Stevens, Ma saru Sekido, Robert J. Lee. A Folate Receptor Targeted Lipid Nanoparticle Formulation for a Lipophilic Paclitaxel Prodrug[J]. Pharmaceutical Research. 21 (2004) :2153-2157该文献中的药物是合成产物，将I^aclitaxel-CHOL (紫杉醇-胆固醇)进行化合连接，合成所得药物药效非常低，对KB细胞的IC50仅为0.61um。可能因紫杉醇-胆固醇合成物严重影响紫杉醇的药效。4> Preparation and characterization of methoxy poly (ethylene glycol)/poly (e-caprolactone)amphiphilic block copolymeric nanospheres for tumor-speci □ c fοlate-mediated targeting of anticancer drugsEun Kyoung Park, Sang Bong Lee, Young Mong Lee. Preparation and characterizat ion of methoxy poly (ethyleneglycol)/poly (e-caprolactone) amphiphilic block copolymericnanospheres for tumor-speci □ c fοlate-mediated targeting ofanticancer drugs. Biomatrials. 26(2005) 1053-1061.此方法的合成原料中，使用PCL聚己内酯，这是一种常用于研究的合成支架聚合物，因为生物相容性不好，未被批准临床应用。5、叶酸靶向紫杉醇纳米脂质体的制备及其生物学效应的研究(苏州大学2008届放射医学毕业生汪梅花的毕业论文，导师许玉杰)文献中提到使用吐温-80协助DSPE-PEG-FA进入脂质体中，未测包封率，而合成药物对KB细胞的IC50为0. 095um,药效低于文献2。因为上述文献方法所制备的叶酸-紫杉醇纳米脂质体或者药效较低，影响了临床的使用效果，或使用不允许临床使用的物质。因此有必要开发出新的叶酸-紫杉醇纳米脂质体的制备方法。

发明内容
本发明的目的是克服现有技术的缺点，不使用未被批准临床允许使用的材料，制备出粒径小、药效高的叶酸偶联纳米紫杉醇脂质体，用于治疗卵巢癌。本发明提供了一种磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-叶酸修饰的纳米紫杉醇脂质体，制备该脂质体的原料为磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-叶酸、紫杉醇、蛋黄卵磷脂和胆固醇，其特征是磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-叶酸与蛋黄卵磷脂的摩尔比为0. 05% 0. 15%，且所述脂质体的粒径小于150nm。上述磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-叶酸修饰的纳米紫杉醇脂质体的制备方法， 其步骤是1)制备磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-叶酸胶束将磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-叶酸(以下简称DSPE-PEG2000-FA)溶解于甲醇和氯仿混合溶液(1 9，体积比)，加入蒸馏水进行水浴超声乳化后，除去甲醇和氯仿，得到澄明DSPE-PEG2000-FA胶束溶液。2)用薄膜分散-挤压法制备纳米紫杉醇脂质体混悬液在容器中分别加入紫杉醇、蛋黄卵磷脂、胆固醇和无水乙醇，溶解后除去乙醇，当容器内物呈薄膜状附着于容器壁时，加入水并进行超声波震荡，然后将所得混合物用挤压器通过0. Ium的微孔滤膜，即得紫杉醇纳米脂质体混悬液，呈细小油滴悬浮于水中。如果需要得到用于细胞实验中激光共聚焦显微镜动态观察药物在癌细胞内的富集过程的样品，此步骤中，还可加入异硫氰酸荧光素作为荧光指示剂。如果需要得到冻干制剂，此步骤中，还可以将所得混悬液加入适量蔗糖，经冷冻干燥制成冻干制剂。3)采用共孵育法制备DSPE-PEG2000-FA修饰的叶酸偶联纳米紫杉醇药物将步骤1所得胶束溶液和步骤2所得混悬液混合，置60°C环境中1小时，得到 DSPE-PEG2000-FA修饰的紫杉醇纳米脂质体药物，为混悬液。本发明的有益效果1、叶酸-紫杉醇纳米脂质体药物粒径小粒径测定以水为分散介质，稀释约20倍后，用激光粒度测定仪测得平均粒径为 140. 5 士 10. 3nm，多分散指数(PDI)O. 263 士0. 061，粒径在150nm以下可有效逃避非网状内皮系统(REQ的捕获，增强药效。而文献1的两种脂质体粒径分别是374. 3 士 9nm和369. 3 士49. 3nm。2、紫杉醇脂质体连接叶酸前后粒径变化小DSPE-PEG2000-FA为两亲性线型聚合物，一端DSPE链为亲脂性，另一端为亲水性。 在DSPE-PEG2000-FA修饰脂质体形成过程中，DSPE端可与磷脂膜结合，FA作为靶头暴露在脂质体表面，既增加了脂质体的体内循环时间，又可靶向作用于高表达叶酸受体的病变部位。因为本发明首先制备了磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-叶酸的胶束，胶束的脂相磷脂酰乙醇胺侧与脂质体的脂相外层磷脂间融合(即亲脂性端直接插入磷脂膜)。这样，可使亲水性的靶头FA侧(即磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-叶酸的的叶酸一端)全部在脂质体外，可以充分发挥叶酸的靶向能力。而现有技术的方法(如背景技术中所述文献2)由于没有先制备胶束，会有部分叶酸端存在于双层磷脂之间，脂质体粒径增大30nm，而减弱叶酸的靶向能力，降低药效。
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本发明的脂质体经测定，连接叶酸后，较步骤1所得的纳米紫杉醇的粒径 (121. 6士 12. 7nm，PDI 0.262士0.031)仅增大19nm(见图2、图3)，但此差异无统计学意义 (t 值 2. 013 ；ρ {t0. 114 ；P > 0. 05)。3、脂质体中药物的包封率高，保证了药物的纯度和有效性包封率的测定采用葡聚糖凝胶(Sephadex G-50)柱过滤法分离未包封药物，测定吸光度，计算浓度和含药量，作洗脱曲线(见图1)。按以下公式计算包封率包封率=脂质体含药量/(脂质体含药量+游离药物量)X100%o测得包封率高达97%，比较原料药紫杉醇纳米脂质体的包封率99%无显著下降， 符合文献(Shih-Jiuan Chiu, Shujun Liu, Danilo Perrotti. Efficient delivery of a Bcl-2-specific antisense oligodeoxy ribonucleotide(G3139)Via transferrin receptor-targeted liposomes [J]. Journalof Controlled Release. 2006 199 207)记载的< 2% 4%工艺标准，保证了药物的纯度和有效性。4、磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-叶酸比例低，仅0. 1 %，不会导致正常叶酸摄入的不足。实施例中，制备所用原料紫杉醇蛋黄卵磷脂胆固醇DSPE-PEG2000-FA具体含量分别是2.5mg 47. Hmg 11.60mg 0.48mg，摩尔比为紫杉醇蛋黄卵磷脂胆固醇DSPE-PEG2000-FA = 1 45 9 0. 045 其中DSPE-PEG2000-FA (磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-叶酸)与蛋黄卵磷脂的摩尔比是0. 1%，小于背景技术中所述文献2中0.5%的比例，降低了由于磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-叶酸中的叶酸结合叶酸受体导致正常叶酸摄入的不足的副作用，如巨幼细胞性贫血，周围神经病等。5、治疗卵巢癌的离体实验效果好1)叶酸偶联纳米紫杉醇药物在卵巢癌细胞内的富集程度检测用激光共聚焦显微镜动态观察叶酸偶联纳米紫杉醇药物在卵巢癌细胞内的富集过程，结果证实叶酸偶联纳米紫杉醇药物对SK0V3细胞膜具有趋向性，药物在癌细胞细胞内富集。2)叶酸偶联纳米紫杉醇药物的细胞毒效应分析药物作用后细胞生长曲线结果表明对敏感株细胞SK0V3、耐药株SK0V3/TAX细胞，叶酸偶联纳米紫杉醇的药效稍强于纳米紫杉醇。3)MTT检测药物对卵巢癌细胞的杀伤作用与纳米紫杉醇、市售紫杉醇注射液进行了对比，结果证实叶酸偶联纳米紫杉醇对卵巢癌细胞(SK0V3细胞或SKOV 3/TAX细胞)的杀伤效果强度均明显高于对照药物纳米紫杉醇或普通紫杉醇。4)流式细胞术测定细胞增殖和凋亡指数结论叶酸偶联纳米紫杉醇细胞凋亡率均明显高于对照药物纳米紫杉醇或普通紫杉醇。5)电镜观察细胞形态学改变结论叶酸偶联纳米紫杉醇比对照药物纳米紫杉醇穿膜作用好，在细胞内聚集浓度高、杀伤作用更强。6、治疗卵巢癌的动物体内实验效果好1)裸鼠腹腔种植瘤卵巢癌模型不给药的荷瘤裸鼠生存期约为35天，而给药后荷瘤裸鼠的生存期> 88天，证明了紫杉醇治疗卵巢癌具有非常好的疗效。2)流式细胞仪检测肿瘤细胞凋亡结果表明腹腔给药凋亡晚期和坏死细胞比较多，肿瘤细胞杀伤效果腹腔组效果最好。3)电镜观察肿瘤细胞形态学改变结果表明给药后肿瘤细胞形态学改变明显，出现明显的凋亡形态学改变。上述细胞及动物实验表明叶酸-紫杉醇纳米脂质体可靶向作用于肿瘤特异性叶酸受体，使传统的化疗药物和肿瘤特异性的抗体结合，增强了药物对肿瘤靶向选择，提高了疗效并减少药物的毒副作用，有很可观的临床应用前景。总之，本发明提供了的靶向叶酸偶联纳米紫杉醇的新制剂及其制备方法。先将DSPE-PEG2000-FA制备成胶束，然后再将其与紫杉醇纳米脂质体共同孵育制备 DSPE-PEG2000-FA修饰的紫杉醇纳米脂质体。该制剂有良好的药物包封率和胶体稳定性，并可被叶酸(+)的敏感和耐药的卵巢癌细胞有效摄取，显示叶酸依赖性的细胞毒性，药效明显强于紫杉醇注射液，同时该药腹腔注射抗肿瘤疗效明显优于静脉注射。为叶酸偶联纳米紫杉醇靶向治疗卵巢癌的临床应用提供了理论依据。


图1是对本发明制备的叶酸-紫杉醇纳米脂质体药物进行包封率测定时的洗脱曲线图；图2是本发明制备的叶酸-紫杉醇纳米脂质体药物进行粒径测定时所得的粒径透射电镜图，药物的粒径范围140. 5 士 10. 3nm，多分散指数(PDI)O. 263 士0. 061 ；图3是制备步骤1所得的纳米紫杉醇进行粒径测定时所得的粒径透射电镜图，粒径范围 121. 6士 12. 7nm。图4SK0V3细胞叶酸受体免疫组化染色阳性40X ；图5SK0V3/TAX细胞叶酸受体免疫组化染色阳性40X ；图6无叶酸培养基中叶酸偶联纳米紫杉醇作用后SK0V3细胞死亡率；图7加叶酸培养基中叶酸偶联纳米紫杉醇作用后SK0V3细胞死亡率；图820min后叶酸偶联纳米紫杉醇药物在SKOV 3细胞内的富集；图940min后叶酸偶联纳米紫杉醇药物在SKOV 3细胞内的富集；图IOlh后叶酸偶联纳米紫杉醇药物在SK0V3细胞内的富集；图11 后叶酸偶联纳米紫杉醇药物在SK0V3细胞内的富集；图124h后叶酸偶联纳米紫杉醇药物在SK0V3细胞内的富集；图13 后叶酸偶联纳米紫杉醇药物在SK0V3细胞内的富集；图14细胞生长曲线；图150. 02 μ g/ml叶酸偶联纳米紫杉醇对SK0V3细胞作用1 后的细胞周期分布，凋亡率为2. 36% ；图160. 02 μ g/ml叶酸偶联纳米紫杉醇对SK0V3细胞作用24h后的细胞周期分布， 凋亡率为15. 88% ；图170. 02 μ g/ml叶酸偶联纳米紫杉醇对SK0V3细胞作用4 后的细胞周期分布， 凋亡率为32.81% ；图180. 02 μ g/ml纳米紫杉醇对SK0V3细胞作用1 后的细胞周期分布，凋亡率为 2. 07% ；图190. 02 μ g/ml纳米紫杉醇对SK0V3细胞作用24h后的细胞周期分布，凋亡率为 10. 55% ；图200. 02 μ g/ml纳米紫杉醇对SK0V3细胞作用4 后的细胞周期分布，凋亡率为 16. 7% ；图210. 02 μ g/ml紫杉醇注射液对SK0V3细胞作用1 后的细胞周期分布，凋亡率为 0. 11% ；图220. 02 μ g/ml紫杉醇注射液对SK0V3细胞作用24h后的细胞周期分布，凋亡率为 0. 92% ；图230. 02 μ g/ml紫杉醇注射液对SK0V3细胞作用4 后的细胞周期分布，凋亡率为 1. 17% ；图M0. 02 μ g/ml叶酸偶联纳米紫杉醇对SK0V3细胞作用1 后的细胞周期分布， 凋亡率为2. 36% ；图250. 2 μ g/ml叶酸偶联纳米紫杉醇对SK0V3细胞作用1 后的细胞周期分布， 凋亡率为6. 34% ；图262 μ g/ml叶酸偶联纳米紫杉醇对SK0V3细胞作用1 后的细胞周期分布，凋亡率为7. 42% ；图270. 02 μ g/ml纳米紫杉醇对SK0V3细胞作用1 后的细胞周期分布，凋亡率为 2. 07% ；图观0. 2 μ g/ml纳米紫杉醇对SK0V3细胞作用1 后的细胞周期分布，凋亡率为
2.57% ；图292 μ g/ml纳米紫杉醇对SK0V3细胞作用1 后的细胞周期分布，凋亡率为
3.47% ；图300. 02 μ g/ml紫杉醇注射液对SK0V3细胞作用1 后的细胞周期分布，凋亡率为 0. 11% ；图310. 2 μ g/ml紫杉醇注射液对SK0V3细胞作用1 后的细胞周期分布，凋亡率为 0. 62% ；图322 μ g/ml紫杉醇注射液对SK0V3细胞作用1 后的细胞周期分布，凋亡率为 0. 94% ；图332 μ g/ml叶酸偶联纳米紫杉醇作用于SK0V3细胞24h后的细胞周期分布，凋亡率为32. 48% ；图342 μ g/ml叶酸偶联纳米紫杉醇作用于SK0V3/TAX细胞24h后的细胞周期分布，凋亡率为13.4% ；
图35纳米紫杉醇作用SK0V3细胞后的电镜图；图36叶酸偶联纳米紫杉醇作用SK0V3细胞后的电镜图；图37纳米紫杉醇作用SK0V3/TAX细胞后的电镜图；图38叶酸偶联纳米紫杉醇作用SK0V3/TAX细胞后的电镜图；图39裸鼠腹腔注入SK0V3细胞后5周，可见裸鼠腹腔内有粟粒样病灶，分布于肠管表面；图40腹腔病灶HE染色后X 10镜下证实为卵巢浆液性上皮性腺癌；图41对照组裸鼠肿瘤细胞流式散点图；图42对照组裸鼠肿瘤细胞流式象限图；图43腹腔组裸鼠肿瘤细胞流式散点图；图44腹腔组裸鼠肿瘤细胞流式象限图；图45静脉组裸鼠肿瘤细胞流式散点图；图46静脉组裸鼠肿瘤细胞流式象限图；图47给药4天后对照组细胞凋亡坏死改变；图48给药7天后对照组细胞凋亡坏死改变；图49给药2天后腹腔组细胞凋亡坏死改变；图50给药7天后腹腔组细胞凋亡坏死改变；图51给药2天后静脉组细胞凋亡坏死改变；图52给药4天后静脉组细胞凋亡坏死改变；图53给药7天后静脉组细胞凋亡坏死改变。
具体实施例方式实施例1叶酸偶联纳米紫杉醇药物的制备(一)1.仪器与材料1.1 仪器高效液相色谱仪(ShimadzuLC-lOAT，日本岛津，包括SPD-10A紫外检测)；N2000 色谱工作站(浙江智达)；ZetasizerfOOO激光粒子测定仪(英国马尔文)；超声波清洗机 (JP-010S，深圳洁盟)；冷冻干燥机(FD-1A-50，成都比朗)；旋转蒸发仪(RE-501，北京来亨)；电热恒温干燥箱(101-3，北京久恒隆)1.2 药品紫杉醇(南京康海制药有限公司，含量98. 6%)；蛋黄卵磷脂(德国avanti polar lipids公司)；胆固醇(国药集团化学试剂有限公司)；磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-叶酸(德国avanti polar lipids公司)；紫杉醇对照品(中国药品生物制品检定所，含量 99. 08% )；甲醇、乙腈均为色谱醇，其他试剂为分析纯。2.制备过程2. 1纳米紫杉醇(紫杉醇脂质体)药物的制备处方紫杉醇2. 5mg:蛋黄卵磷脂47. Hmg 胆固醇11.60mg: DSPE-PEG2000-FA0. 48mg, FITC 0. 5mg (摩尔比为紫杉醇蛋黄卵磷脂胆固醇DSPE-PEG2000-FA = 1 45 9 0.045)。
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精密取处方量紫杉醇/紫杉醇+异硫氰酸荧光素(FITC 0.5mg)、蛋黄卵磷脂和胆固醇置茄形瓶中，加入20mL无水乙醇，水浴超声使药物和脂材溶解，于45°C旋转蒸发减压除去乙醇。加入适量水30°C水浴超声波震荡30min，用挤压器将脂质体依次过0. Sum, 0. 4um,0. 2um,0. Ium的微孔滤膜，即得紫杉醇脂质体混悬液。加入适量蔗糖，经冷冻干燥制成冻干制剂。2. 2DSPE-PEG2000-FA 胶束的制备采用超声乳化-溶剂挥发法制备DSPE-PEG2000-FA胶束。将lmgDSPE-PEG2000_FA 溶解于甲醇和氯仿混合溶液((1 9，体积比))，加入约5.3ml蒸馏水水浴超声乳化，除去甲醇和氯仿，得到澄清透明DSPE-PEG2000-FA胶束溶液。2. 3DSPE-PEG2000-FA修饰的叶酸偶联纳米紫杉醇药物的制备采用共孵育法制备DSPE-PEG2000-FA修饰的纳米紫杉醇药物。精密量取处方量的紫杉醇脂质体混悬液和DSPE-PEG2000-FA胶束溶液，充分混合，置60°C的电热恒温干燥箱1 小时，即得DSPE-PEG2000-FA修饰的紫杉醇纳米脂质体混悬液。3.产物叶酸-紫杉醇纳米脂质体药物的鉴定3. 1鉴定方法3. 1.1粒径测定取制备的脂质体混悬液和胶束适量，以水为分散介质，稀释约20倍后，用激光粒度测定仪测定样品的平均粒径。3. 1.2包封率的测定采用葡聚糖凝胶(S印hadex G_50)柱过滤法分离未包封药物，取脂质体混悬液 0. 5ml上柱分离，以水为洗脱液洗脱，流速控制为0. 8 1. OmL/min ；以每隔^iin分管接收洗脱液，共接取16份，分别稀释至一定浓度后；对所有样品于227nm测定吸光度，计算浓度和含药量，作洗脱曲线，见图1。含脂质体的接收液合并后以无水乙醇破乳，稀释至一定浓度后。测定含量，按以下公式计算包封率包封率=脂质体含药量/ (脂质体含药量+游离药物量)X 100%。3. 1. 3紫杉醇标准品溶液的配制、色谱测定及标准曲线的生成准确称取IOmg紫杉醇标准对照品，用甲醇溶解后定容，得到1000mg/L的紫杉醇标准溶液，再用甲醇稀释配制成100、50、25、10、5mg/L的标准溶液系列，4°C避光保存。色谱条件色谱柱DiamonsilC18(4. 6謹X 250謹，5 μ m)；流动相乙腈甲醇水 (40 12 48)；流速1.0ml/min ；检测波长227nm;柱温 40°C。标准曲线和线性范围取配制的紫杉醇标准溶液，按色谱条件进样，录色谱峰并对其积分、分析，以峰面积area(Y)和质量浓度concentration(X)作出标准曲线，进行回归确定线性范围，得出标准曲线方程为Y = 19946X+2617，r = 0. 999。线性范围为5 IOOmg/ L03. 1.4统计学处理采用Spssl6. 0软件，对不同数据进行方差分析、t检验及X2检验。3. 2鉴定结果3. 2.1所得产物的粒径
终产物叶酸偶联纳米紫杉醇药物的粒径(140. 5 士 10. 3)nm,多分散指数(PDI)O. 263 士0. 061，较步骤1所得的纳米紫杉醇的粒径(121. 6 士 12. 7nm, PDI 0. 262 士0. 031)仅增大19nm，但此差异无统计学意义(t值2. 013 ；ρ值0. 114 ；P > 0. 05)。 叶酸偶联纳米紫杉醇粒径仍控制在150nm以下，可有效逃避非网状内皮系统(RES)的捕获， 增强药效。见图2、图3。3. 2. 2 包封率叶酸-紫杉醇纳米脂质体药物的包封率高达97%，比较原料药紫杉醇纳米脂质体的包封率99%无显著下降，符合< 2% 4%工艺标准，保证了药物的纯度和有效性。实施例2叶酸偶联纳米紫杉醇药物的制备(二)方法同实施例1，但制备纳米紫杉醇脂质体时，原料中不加异硫氰酸荧光素 (FITC)，其它材料同实施例1。实验例1叶酸偶联纳米紫杉醇靶向治疗卵巢癌的体外细胞实验研究1.实验材料SK0V3细胞，军事医学科学院李春海教授馈赠；SK0V3/TAX，本实验室诱导，方法按 Sudimack JJ,Adams D,Rotaru J，et al. Folate receptor-mediated liposomal delivery of a lipophilic boron agent to tumor cells in vitro for neutron capture therapy. Pharm Res,2002,19 (10) :1502-1508;BALB/c雌裸鼠，购自北京大学医学部动物部；培养液RPM 1-1640 (Sigma)、无叶酸RPM 1-1640培养液(GIBCO)、叶酸受体单克隆抗体M0V18(EnZO life Science)、凋亡检测试剂盒均购自北京宝赛公司；叶酸偶联纳米紫杉醇实施例1。2.实验方法2. 1免疫组化染色筛查卵巢癌叶酸受体阳性细胞株参照文献(M R Buist, CFM Molthoff, P Kenemans, et al. Distribution of OV-TL 3and M0vl8in normal and malignant ovarian tissue[J]J Clin Pathol 1985 ； 48 :631-636methods[J], Cancer Res, 1990,50(2) :3218-3223)的方法，免疫组化染色筛查卵巢癌叶酸受体阳性细胞株。阳性细胞表现为胞膜着色(棕黄色)。2. 1. 1SK0V3细胞爬片入丙酮固定10分钟。PBS冲洗，5分钟X 3。2. 1. 2用3%过氧化氢孵育5-10分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。PBS冲洗， 5分钟X3。2. 1. 3正常动物非免疫血清工作液封闭，室温孵育30分钟，倾去血清，勿洗。2. 1.4滴加适当比例稀释的M0V18，37°C孵育1小时。PBS冲洗，5分钟X3。空白对照为不加一抗，其他步骤相同。2. 1. 5滴加生物素标记的二抗工作液，37°C孵育30分钟。PBS冲洗，5分钟X3次。2. 1. 6滴加链亲和素-过氧化酶工作液，37°C孵育30分钟。PBS冲洗，5分钟X 3次。2. 1. 7滴加新鲜配制的DAB工作液，显微镜下观察5-lOmin。MOV-18单抗免疫组化染色结果如图4、图5示。2. 1.8自来水冲洗，苏木素复染，脱水，中性树胶封片。
2. 2检测游离叶酸对于叶酸偶联纳米紫杉醇药物的干扰作用参照文献(Paranjpe PV, Chen Y, Kholodovych V, et al. Tumor-targeted bio-conjugate based delivery of camptothecin :design, synthesis and in vitro evaluation. J Control Release, 2004,100(2) :275 292)原理设计实验。因叶酸偶联纳米紫杉醇对SK0V3细胞的杀伤作用是由叶酸受体介导的，则培养基内加入叶酸会与叶酸受体竞争性结合而降低药物对细胞的杀伤效果。2.2. 1将浓度为0.025yg/ml叶酸偶联纳米紫杉醇药物作用于对数生长期的 SK0V3细胞(培养基为加入ImM/L叶酸的1640)，对照组细胞采用无叶酸1640培养基。2. 2. 224h后用0. 25%胰酶消化细胞使待测细胞浓度为1. 5X 106/ml。取Iml细胞， 在 40C T 1000r/min 离心 lOmin，弃上清。2. 2. 3加入Iml冷PBS液，轻轻震荡使细胞悬浮，在4°C下1000r/min离心IOmin,
弃上清。重复该步骤两次。2. 2. 4 将细胞重新悬浮于 500 μ 1 Binding Buffer。2. 2. 5加入20 μ 1碘化丙啶(PI)，避光室温反应，1小时内上流式细胞仪检测细胞凋亡率，无叶酸组细胞死亡率明显高于加叶酸组细胞，差异有统计学意义(P < 0.01)。见表 1，图6、图7。表1叶酸偶联纳米紫杉醇作用后SK0V3细胞的凋亡率
凋亡细胞数总细胞数凋亡率加叶酸组272234441. 16% *无叶酸组1148782314. 67%*Ρ < 0. 01加叶酸组vs无叶酸组本实验的原理是叶酸偶联纳米紫杉醇与叶酸竞争性结合癌细胞上的叶酸受体，故加叶酸组，药物对细胞的杀伤率较低，定量的间接验证叶酸偶联纳米紫杉醇确实是通过叶酸受体起作用的。卵巢浆液性乳头状囊腺癌SK0V3细胞及其耐药株SK0V3/TAX细胞均为叶酸(+)细胞，可介导叶酸纳米紫杉醇药物通过叶酸受体介导的胞吞作用富集于细胞内，发挥抗肿瘤效果。细胞培养基中加入游离叶酸封闭叶酸受体可明显降低叶酸纳米紫杉醇药物对细胞的杀伤作用，也进一步证明了药物对细胞的作用是由细胞表面的叶酸受体介导的。文献报道约93%的卵巢癌患者中过表达叶酸(林凤云，朱照静.叶酸受体介导的靶向给药研究进展.国外医学药学分册.2006，33 (3) :178-181)，故本实验中使用卵巢癌细胞模型来探讨叶酸偶联纳米紫杉醇对卵巢癌的靶向治疗作用更接近临床实际，有一定的临床意义。2. 3叶酸偶联纳米紫杉醇药物在卵巢癌细胞内的富集实验方法用激光共聚焦显微镜动态观察叶酸偶联纳米紫杉醇药物在卵巢癌细胞内的富集过程，具体方法参照文献(Jun ffu, Qing Liu, Robert J. Lee. A Folate receptor-targeted liposomal formulation for paclitaxel[J]. International Journal of Pharmaceutics. 316(2006) :148 153)。
操作步骤为将浓度为0. 01mg/ml的异硫氰酸荧光素FITC标记的叶酸偶联纳米紫杉醇药物加入贴壁生长的SK0V3细胞中。药物分别作用20min，40min，lh,2h,4h,8h后，倒掉培养液，用PBS液冲洗2次，加入4%多聚甲醛4°C固定。1 后倒掉固定液，加入甘油/ PBS混合液封片，激光共聚焦显微镜下动态观察叶酸(+)的SK0V3细胞通过叶酸主动摄取叶酸偶联纳米紫杉醇药物的过程，即药物被细胞内吞的过程和药物富集于肿瘤细胞的浓度。结果随叶酸偶联纳米紫杉醇药物对SK0V3细胞作用时间的延长，细胞内药物浓度越来越大；同时在各时间点都观察到细胞膜处药物浓度聚集，说明叶酸偶联纳米紫杉醇药物对细胞膜的趋向性，肿瘤细胞对药物的摄取是通过叶酸受体介导的。但随着时间的推移，细胞膜上的叶酸受体饱和后，将会影响药物的继续吸收，表现为胞膜处荧光强度相对减弱。见图 8-13(叶酸偶联纳米紫杉醇药物在SK0V3细胞内的富集过程)。图8-13示随着药物作用时间延长，肿瘤细胞内绿色荧光强度逐渐增强，胞浆轮廓越来越清晰，胞膜处绿色荧光聚集以 4h最强，他开始减弱。结论叶酸偶联纳米紫杉醇药物对SK0V3细胞膜具有趋向性，药物在癌细胞细胞内富集。2. 4叶酸偶联纳米紫杉醇药物的细胞毒效应分析2. 4. 1药物作用后细胞生长曲线取对数生长期的SK0V3细胞、SK0V3/TAX细胞，分别用0. 25%胰酶消化后制成 IXioVml的单细胞悬液，以每孔Iml接种于M孔细胞培养板上。M小时后弃培养液，分三组加入含药培养液，空白组不加药，对照组加0. 2μ g/ml纳米紫杉醇注射液，实验组加 0. 2 μ g/ml叶酸偶联纳米紫杉醇。加药后每隔4 换相同培养液一次，每隔24h计数1次， 每次每组计数3孔的细胞，取平均数，连续7d。绘制细胞生长曲线，按I^tterson公式(Yang LY, Trujillo JM. Biological characterization of multidrug resistant human colon carcinoma sublines induced by two)计算细胞在对数生长期的细胞群体倍增时间(TD)。结果表明对敏感株细胞SK0V3、耐药株SK0V3/TAX细胞，叶酸偶联纳米紫杉醇的药效稍强于纳米紫杉醇。但实验组与对照组细胞SK0V3及SK0V3/TAX生长速度均极慢，未出现明显对数生长期。见图14细胞生长曲线。2. 4. 2MTT检测药物对卵巢癌细胞的杀伤作用实验分组用药物如下实验组实施例2叶酸偶联纳米紫杉醇；对照组1 纳米紫杉醇；(南京康海药业有限公司)对照组2 市售紫杉醇注射液。(海南中化联合制药工业有限公司)取对数生长期的卵巢癌敏感株SK0V3细胞、耐药株SK0V3/TAX细胞，浓度为 4 XioVml,以每孔200 μ 1接种于96孔细胞培养板，培养24h后弃培养基，分别加入含有叶酸偶联纳米紫杉醇(实验组)、纳米紫杉醇(对照组1)、紫杉醇注射液(对照组2)药物的培养液，药物浓度梯度均为200,20,2,0.2,0. 02，0. 002 μ g/ml，每孔设5个复孔。培养48h 后弃含药培养液，每孔加20 μ IMTT (5mg/ml)。4小时后弃MTT，每孔加入150 μ 1DMS0。振荡 5min后，用自动酶标仪测492nm处各孔吸光度OD值。对照孔培养液中不加药，空白孔中为无细胞的培养基。计算细胞存活率(实验孔OD值/对照孔OD值X100 % )，以浓度一存活曲线作回归方程，得出各种药物的半数抑制浓度(IC50)。见表2。表2各种药物对两组细胞IC50值(μ g/ml)
权利要求
1.一种磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-叶酸修饰的纳米紫杉醇脂质体的制备方法，其步骤是1)制备磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-叶酸胶束，将磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-叶酸溶于甲醇和氯仿混合溶液，加入蒸馏水进行水浴超声乳化后，除去甲醇和氯仿，得到澄明的胶束溶液；2)用薄膜分散-挤压法制备纳米紫杉醇脂质体混悬液，在容器中分别加入紫杉醇、蛋黄卵磷脂、胆固醇和无水乙醇，溶解后除去乙醇，当容器内容物呈薄膜状附着于容器壁时，加入水并进行超声波震荡，然后将所得混合物用挤压器通过0. Ium的微孔滤膜，即得紫杉醇纳米脂质体混悬液；3)采用共孵育法制备磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-叶酸修饰的纳米紫杉醇脂质体， 将步骤1所得胶束溶液和步骤2所得混悬液混合，置60°C环境中1小时，得到所述脂质体药物，为混悬液。
2.权利要求1所述的制备方法，步骤幻中，所述通过0.Ium的微孔滤膜是用挤压器将脂质体依次过过0. Sum, 0. 4um, 0. 2um的微孔滤膜后，再通过0. Ium的微孔滤膜。
3.权利要求1所述的制备方法，步骤幻中，所得混悬液加入蔗糖，经冷冻干燥制成冻干粉。
4.一种磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-叶酸修饰的纳米紫杉醇脂质体，制备该脂质体的原料为磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-叶酸、紫杉醇、蛋黄卵磷脂和胆固醇，其特征是磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-叶酸与蛋黄卵磷脂的摩尔比为0. 05% 0. 15%，且所述脂质体的粒径小于150nm。
5.权利要求4所述的脂质体，其特征是按权利要求1所述方法制备的。
6.权利要求4或5所述的脂质体在制备治疗肿瘤药物中的用途。
7.权利要求4或5所述的肿瘤，是卵巢癌。
8.一种治疗卵巢癌药物，其活性成分是权利要求4或5所述的脂质体。
全文摘要
一种磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-叶酸修饰的纳米紫杉醇脂质体，磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-叶酸与蛋黄卵磷脂的摩尔比为0.05％～0.15％，且所述脂质体的粒径小于150nm。制备方法为先将DSPE-PEG2000-FA制备成胶束，然后再将其与紫杉醇纳米脂质体共同孵育得到。本发明的原料中不使用临床不允许使用的材料。该脂质体粒径小、磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-叶酸的含量低，有良好的药物包封率和胶体稳定性，并可被叶酸(+)的敏感和耐药的卵巢癌细胞有效摄取，显示叶酸依赖性的细胞毒性，药效明显强于紫杉醇注射液。
文档编号A61K47/22GK102188382SQ20111011430
公开日2011年9月21日 申请日期2011年5月4日 优先权日2011年5月4日
发明者佟铃霞, 李红霞, 程光 申请人:李红霞