Gst标签蛋白纯化简易方法
【专利摘要】本发明属于蛋白纯化的【技术领域】，本发明公开了GST标签蛋白纯化简易方法，以GST-4B原液为填料，可纯化在上清中表达的GST标签蛋白。该GST标签蛋白纯化方法简便易行，无需进行过柱处理，仅需要水平摇床和低速自动平衡离心机两种简易仪器即可，并且所得的纯化蛋白的纯度和浓度均较高。
【专利说明】GST标签蛋白纯化简易方法
【技术领域】
[0001]本发明属于蛋白纯化的领域，涉及一种GST标签蛋白纯化的简易方法。
【背景技术】
[0002]蛋白质的分离纯化在生物化学研究应用中使用广泛，是一项重要的操作技术。一个典型的真核细胞可以包含数以千计的不同蛋白质，一些含量十分丰富，一些仅含有几个拷贝。为了研究某一个蛋白质，必须首先将该蛋白质从其他蛋白质和非蛋白质分子中纯化出来。
[0003]蛋白纯化要利用不同蛋白间内在的相似性与差异，利用各种蛋白间的相似性来除去非蛋白物质的污染，而利用各蛋白质的差异将目的蛋白从其他蛋白中纯化出来。每种蛋白间的大小、形状、电荷、疏水性、溶解度和生物学活性都会有差异，利用这些差异可将蛋白从混合物如大肠杆菌裂解物中提取出来得到重组蛋白。
[0004]GST采用小配体亲和填料，可用于纯化转移性的结合丝氨酸蛋白酶、胰蛋白酶、类胰蛋白酶等。主要用到的产品有凝胶、预装柱和酶。但纯化过程中受很多因素的影响，如流速、样品浓度、洗脱以及洗脱时的PH值等等，而且常用的GST标签蛋白纯化的方法无法达到操作简单、简便易行。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种GST标签蛋白纯化的简易方法。该法以GST-4B原液为填料，可以纯化在上清中表达的GST标签蛋白`。该GST标签蛋白纯化方法的最大特点是简便易行，无需进行以往在常规纯化过程中的过柱处理，而且仅需要水平摇床和低速自动平衡离心机两种简易仪器即可，并且所得纯化蛋白的纯度和浓度均较高。
【具体实施方式】
[0006]本发明中简易GST标签蛋白纯化的方法步骤如下:
1、IPTG诱导表达后，收集菌体并且用10mL Buffer A重悬，反复冻融后超声波破碎，收集上清液；
2、上清加入盛有约GST-4B原液的离心管中，放在水平摇床于室温或更低温条件下缓慢摇动结合；
3、用PBS洗脱杂蛋白，10mM还原型谷胱甘肽溶液洗脱得到即为所要纯化的融合蛋白。
[0007]下面结合具体实例进一步说明本发明。
[0008]实施例1
将表达蛋白的菌株以体积比1:100加入200 mL液体培养基中振荡培养3-4 h，再次以1:1000体积比加入IPTG诱导4 h后，收集菌体并用10 mL Buffer A重悬。反复冻融三次后进行超声波破碎，12000 r/min离心15 min,收集上清。
[0009]该条件下收集的上清液中几乎包含了该菌株细胞液中表达的全部蛋白，也会含有少量包涵体中表达的蛋白。
[0010]实施例2
将上清加入盛有约I mL GST-4B原液的离心管中，放在水平摇床于室温或更低温度条件下缓慢摇动lh，以达到GST-4B原液与上清液中表达的标签蛋白的结合。
[0011]该条件下可以充分保证GST-4B原液与上清液中表达的标签蛋白的结合，而且不会导致操作过程中所要纯化蛋白的变性。
[0012]实施例3
充分结合后，将试管于低速自动平衡离心机中，以2100 r/min的转速离心5 min,上清转入另一离心管，沉淀加至少10倍体积的PBS于摇床摇约10 min，然后再次以2100 r/min离心5 min，从而洗脱掉不需要的杂蛋白，至少洗涤2次。
[0013]该条件下可以将杂蛋白充分洗脱掉，如不能确定杂蛋白是否完全洗脱，可以洗脱多次以提高所要纯化蛋白的纯度。
[0014]实施例4
杂蛋白充分洗脱后，加入I mL 10 mM还原型谷胱甘肽溶液并且于摇床上洗脱所需蛋白至少10 min，然后再次于2100 r/min离心5 min，所得上清液中既含有高浓度的所要纯化的蛋白，可以同样操作来洗脱所要纯化的蛋白4-5次，以便得到更很多所需蛋白。
[0015]该条件下纯化的所需蛋白浓度很高，但多次洗脱后浓度会稍微有所减低，但所纯化蛋白的纯度一般都很高。·
【权利要求】
1.一种GST标签蛋白纯化的简易方法，该纯化方法中以GST-4B原液为填料，操作简单，所得纯化蛋白的纯度和浓度均较高。
2.根据权利要求1所述的以GST-4B原液为填料，其特征在于纯化在上清中表达的GST标签蛋白，并且简便易行。
3.根据权利要求1所述的简易的GST标签蛋白纯化方法，其特征如下:无需进行以往常规纯化的过柱处理，且仅需要水平摇床和低速自动平衡离心机两种简易仪器即可。
4.根据权利要求1所述的简易的GST标签蛋白纯化方法，其所用BufferA的配置特征在于:6.057 g Tris, 0.1861 g EDTA，2.922 g NaCl，甘油50 mL，溶解于去离子水后定容至1000 mL，室温保存，使用时加0.5 mM DTT0
5.根据权利要求1所述的简易的GST标签蛋白纯化方法，其所用50mM Tris-Hcl(pH8.0)的配置特征在于:3.0275 g Tris溶于450 mL去离子水，调pH至8.0后定容至500mL,室温保存。
6.根据权利要求1所述的简易的GST标签蛋白纯化方法，其所用10mM还原型谷胱甘肽溶液的配置特征在于:0.307 g还原型谷胱甘肽溶于100 mL 50 mM Tris-Hcl (pH8.0)，4°C 保存。
【文档编号】C07K1/14GK103848884SQ201210520115
【公开日】2014年6月11日 申请日期:2012年12月7日 优先权日:2012年12月7日
【发明者】马丰英, 郝智慧, 贾德强 申请人:青岛宝依特生物制药有限公司