专利名称：蛋白标签的联合应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域；更具体地，本发明涉及一种新型的蛋白标签及其应用。
背景技术：
淀粉结合域(Starchbindin g domain, SBD)淀粉是植物的主要能源的储存形式，同时也是人类食物最重要的能源来源。从化学结构看，淀粉可以分为直链淀粉和支链淀粉两大类。直链淀粉是由几百个D-葡萄糖基以a-(l，4)糖苷键连接的葡聚糖，分子量较小，在50000左右；支链淀粉则由几千个葡萄糖以α-(1，4)糖苷键连接为主链，并有α-(1，6)糖苷键连接作为分支点而形成的葡聚糖，分子量比直链淀粉大得多，在60000左右[I]。在天然淀粉中直链的占20% 26%，它是可溶性的，其余的则为支链淀粉。自然界存在很多催化淀粉降解的淀粉酶，在这些酶中大多具有淀粉结合区域(starch binding domain, SBD),如淀粉葡萄糖苷酶(glucoamylase,GA)、a-淀粉酶、β -淀粉酶、麦芽糖四糖水解酶、麦芽五糖水解酶、环化糊精葡萄糖转移酶等。例如来源于米根霉菌(Rhizopus oryzae)的淀粉葡萄糖苷酶(RoGA)。GA是一种外切葡萄糖水解酶，能够从淀粉的非还原水解释放出β -D-葡萄糖，制糖工业上RoGA广泛用于水解淀粉为葡萄糖浆。RoGA由C-端催化结构域和N-端淀粉结合域(SBD)两部分组成，两个结构域通过O-型糖基化接头连接。碳水化合物活性酶数据库(Carbohydrate-ActiveenZYmes Database, CAZY, http://www. cazy. org/)按照序列的同源性把 RoGA 的 SBD 归类到 CBMs (carbohydrate-binding modules)家族 21(RoGA CBM21)。从一级结构来看，RoGA SBD含有106个氨基酸残基，但是从二级结构来看，RoGASBD与其他SBD家族蛋白一样具有保守的β折叠片段，并且组成类似免疫球蛋白状结构，如图13Α,从图中可以明显看到,RoGA SBD有两个配体结合位点(ligand-binding sites),位点I由Tyr32，Phe58，Tyr67氨基酸残基组成，位点2则包含Trp47，Tyr83，Tyr94氨基酸。正是由这六个带有芳香族侧链的氨基酸和糖环的疏水作用决定了 SBD结合底物的亲和力和特异性[Chou, W. I.，et al. The family 21 carbohydrate binding module ofglucoamylase from Rhizopus oryzae consists of two sites playing distinct rolesin ligand binding. Biochem. J. (2006) 396，469-477]。RoGA SBD 整个二级结构含有 8 个反向平行的 β 折叠片段，分别是 β I (V9-Y16)，β 2 (F21-V27)，β 3 (V34-D42)，β 4 (I53-G60)，β 5 (Υ67-Α74), β 6(I79-V88), β 7 (Τ92-Ν95)和 β 8 (Y102-V104)，如图 13Β。目前有很多纯化蛋白标签如polyhistidine (Poly-His)，maltose-bindingprotein (MBP) glutathione S-transferase (GST),但是由于亲和介质造价昂贵，这些标签难以在工业化水平大规模使用。而淀粉分布广，来源丰富，化学性质稳定，无毒，容易回收，具有被广泛应用的前景，作为一种很好亲和分离的载体[L. J. Chen, C. Ford, Z. Nikolov.A dsorption to starch of a beta—galactosidase Fusion protein containing thestarch-binding regionof Aspergillus glucoamylase, Gene99 (1991) 121-126]。融合蛋白标签(fusion tag)技术
融合标签(fusion tag)技术是一种基于报告基因(reporter gene)的重组DNA技术，其主要的过程是在目的蛋白编码基因的3’端或5’端融合某种特定的蛋白标签的编码基因，通过合适的宿主来表达重组蛋白质[Nilsson, J. , et al. , Affinity fusionstrategies for detection, purification, and immobilization of recombinantproteins. Protein Expr Purif, 1997. 11 (I) p. 1-16]。融合标签技术的发展最初是为了简化蛋白质的纯化，即通过重组蛋白质所含融合标签同固相介质中配体的特异相互作用，实现重组蛋白质的亲和纯化。现有的融合标签系统如6-His，SUMO, Avi, FLAG, HA, GST, Halo,MBP, SNAP, c-Myc 等[Stevens, R. C. , Design of high-throughput methods of proteinproduction for structural biology. Structure, 2000. 8 (9) :p. R177-85]。根据其融合标签的特性表达重组蛋白质，可以对目标蛋白进行分子标记，便于目的蛋白的检测和定向固定，方便对其进行定位和追踪，实现细胞和整体动物体内蛋白反应过程的可视化；还可以与包被在固相基质上的特异配基共价或非共价结合，实现蛋白质的固相化，方便后续的反应以及重组蛋白质的获得和纯化。另外随着各种不同特性融合标签的不断出现，融合标签串 联的使用也日益增多。总之，融合蛋白标签技术已经成为一种必不可少的研究工具，极大地促进了生命科学与医学领域的发展。多数情况下，由于多肽标签相对较小，对融合蛋白结构和活性影响很小，不需要从融合蛋白中切除，因而多肽融合标签较蛋白质标签更为常用。融合标签的存在有时候会影响待研究蛋白的重要特性或功能。通常人们会在标签蛋白和目的蛋白之间引入一些特异性酶切位点，再通过相应的蛋白酶切除标签蛋白，获取目的蛋白。在融合标签切除过程中，许多蛋白质要保持生物活性以及结构的稳定性都需要特定的N端氨基酸残基。在细胞内所有新合成的蛋白质在其N端都是甲硫氨酸，然后经过翻译后加工修饰才形成其它不同的氨基酸。因此在融合标签切除过程中如何避免产生非天然N端氨基酸或产生特异的N端氨基酸，是很多蛋白酶使用过程中所要解决的重要困难[Marblestone, J. G. , et al.Comparison of SUMO fusion technology with traditionalgene fusion systems enhanced expression and solubility with SUMO. Protein Sci,2006. 15(1) p. 182-9]。蛋白酶虽然能将融合蛋白标签切除，但少量未除去的蛋白酶会对已纯化的蛋白产生污染，从而影响蛋白的纯度，还需要进一步纯化以去除切除反应体系中残留的蛋白酶。类泛素小修饰蛋白(small ubiquitin-like modifier, SUM0)标签有多种普通融合蛋白标签不具备的优点，首先SUMO作为分子伴侣帮助融合蛋白的正确折叠，从而增加融合蛋白的可溶性，稳定性以及表达量。SUMO具有的高度保守类似泛素的桶状蛋白质结构，即β折叠(sheet)-i3折叠-α螺旋-β折叠-β折叠-β折叠的高度折叠压缩稳定的球形结构域，此结构域能够提供目的蛋白正确折叠的核心，促进目的蛋白的快速正确折叠。SUMO折叠后的球形结构外部具有高度的亲水性，内部具有高度的疏水性，对原来溶解性不好的重组蛋白质可以发挥类似于去垢剂的作用[Mossessova, E. and C. D. Lima,Ulp1-SUM0 crystal structure and genetic analysis reveal conserved interactionsand a regulatory element essential for cell growth in yeast. Mol Cell,2000. 5(5)p. 865-76]。SUMO标签融合蛋白可以通过特异的SUMO蛋白酶，如酵母去SUMO修饰的酶Ulpl高效地切除[Li, S. J. and M. Hochstrasser, A new protease required for cell-cycleprogression in yeast. Nature,1999. 398(6724) :p.246-51]。与泛素信号通路相似，所有的Ubls通过多个酶的级联作用实现对目的蛋白特异位点的共价修饰，其中包括了 Ubl激活酶(El)，Ubl转移酶(E2)和具有特异性的Ubl连接酶(E3)。在SUMO修饰的过程中，SUMO首先被El激活，然后通过SUMO转移酶E2将SUMO结合到底物上，再通过E3结合到特定底物上，然而这也是个可逆的过程SUMO也可以被去SUMO化的酶SENPs从底物上解离下来。SUMO的激活酶El，包括了 SAEl和SAE2两个亚基的异源二聚体[Hay, R. T. , SUMO :a history of modification. Mol Cell, 2005. 18(1) p. 1-12]。在SUMO的起始激活过程中，SAE1/SAE2通过在SUMO C端连接上 AMP实现腺苷化，通过AMP的水解使之与SAE2形成硫脂键，在SUMO的转移反应中，SUMO又被转移到SUMO转移酶Ubc9 (E2)，Ubc9直接将SUMO的C端羧基与目的蛋白的赖氨酸ε氨基形成异肽键[Kerscher，0.，R. Felberbaum, and M. Hochstrasser, Modification of proteins by ubiquitin andubiquitin-like proteins. Annu Rev Cell Dev Biol, 2006. 22 :p.159-80]。与大部分的Ubls反应过程相似，SUMO化过程经过一系列中间体过程，通过切割生成C端的甘氨酸残基，与目的蛋白的赖氨酸侧链相连。这个过程通过SUMO特异性的蛋白酶催化完成，其中这些酶还可以将SUMO从已经修饰的目的蛋白上除去。最早在酿酒酵母中发现两个SUMO特异的蛋白酶Ulpl和Ulp2，在细胞核孔和核质中都有分布，并与细胞周期相关[Kim, K. I. , S. H. Baek, and C. H. Chung, Versatile protein tag, SUMO its enzymologyand biological function. J Cell Physiol,2002. 191(3) :p. 257-68]。生物信息学方法在人类基因组中搜索到Ulpl蛋白酶的8个类似物SENP1-8，它们在C端都有保守的催化结构域，但SENP8是NEDD8特异性的蛋白酶。目前认为SENP1-3是SUMO特异性的，SENPI-8和SUMO之间存在一定的对应关系。目前的研究表明，SUMO化与蛋白分子的重定位[Kurepa, J. , et al. , The smallubiquitin-like modifier(SUMO)protein modification system in Arabidopsis.Accumulation of SUMOl and-2 conjugates is increased by stress. J Biol Chem,2003.278 (9) p. 6862-72 ；Lin,D. ,et al. ,Identification of a substrate recognitionsite on Ubc9. J Biol Chem, 2002. 277(24) :p. 21740-8]，与细胞周期以及目的蛋白稳定性的维持，转录调控，个体发育的调节等都有十分密切的联系，对于目的蛋白的泛素化和磷酸化还存在竞争性的拮抗抑制作用[Zhang, H.，et al.，SUMOmodification is requiredfor in vive Hex gene regulation by the Caenorhabditis elegans Polycomb groupprotein S0P-2. Nat Genet, 2004. 36(5) p. 507-11]。虽然目前对于 SUMO 的基本修饰机理有了一定的了解，然而对于其具体的目的蛋白选择过程的特异性及修饰后的相关调控及功能，个体发育上SUMO化的重要性等仍有待进一步研究。酶固相化技术酶作为一种特殊的生物催化剂，具有较高的选择性和催化效率、反应条件温和、催化活性可以调节控制等优点。但自由酶对所处环境十分敏感，在强酸、强碱、高温、高离子浓度和部分有机溶剂中均不够稳定，容易导致酶蛋白的变性，从而降低甚至丧失其催化活性。同时，自由酶反应后不易与底物和产物分离，既影响反应产物纯度又难以重复使用，这很大程度限制了酶促反应的广泛应用。固定化酶技术(Immobilized enzyme technology)克服了自由酶的上述不足，提高了酶的储存稳定性，而且酶可以回收及重复使用。
酶的固定化方法可大致分为吸附法、共价偶联法、交联法和包埋法等4种。固定化酶的性能主要取决于固定化方法和所使用的载体材料。其中，载体材料的性能直接影响其固定化酶的催化活性。酶的固定化对载体材料有很高的要求。设计、开发性能更优的载体材料已成为固定化酶研究的重点之一。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新型的蛋白标签及其应用。在本发明的第一方面，提供淀粉酶的淀粉结合域(SBD)的用途，用于作为目的蛋白固相化的标签。在另一优选例中，所述的淀粉酶的淀粉结合域是分离的。在本发明的另一方面，提供一种目的蛋白固相化的方法，所述方法包括(a)将目的蛋白与淀粉酶的淀粉结合域融合表达，获得包含(较佳地从N端至C端)淀粉酶的淀粉结合域-目的蛋白的融合蛋白的表达产物；(b)将所述的表达产物与淀粉基质(如淀粉树脂，淀粉珠)相接触(如流经淀粉基质柱)，从而淀粉酶的淀粉结合域-目的蛋白的融合蛋白被吸附到淀粉基质表面，所述目的蛋白被固相化。在另一优选例中，所述的方法还包括对目的蛋白进行纯化步骤(a)中，将目的蛋白与淀粉酶的淀粉结合域蛋白以及类泛素小修饰·蛋白(SUMO)相融合表达，获得包含(较佳地从N端至C端)淀粉酶的淀粉结合域蛋白-类泛素小修饰蛋白-目的蛋白融合蛋白的表达产物；步骤(b)中，将所述的表达产物与淀粉基质相接触，从而淀粉酶的淀粉结合域蛋白-类泛素小修饰蛋白-目的蛋白融合蛋白被吸附到淀粉基质表面；之后，利用类泛素小修饰蛋白特异性的蛋白酶从被吸附的淀粉酶的淀粉结合域蛋白-类泛素小修饰蛋白-目的蛋白融合蛋白上切除目的蛋白，从而获得纯化的目的蛋白。在另一优选例中，所述的类泛素小修饰蛋白特异性的蛋白酶选自酵母泛素样特异性蛋白酶I(Ulpl)或其活性片段。在另一优选例中，所述的目的蛋白是能酶切蛋白(所述的蛋白上有酶切作用位点)的酶步骤(a)中，将酶与淀粉酶的淀粉结合域蛋白(片段)相融合表达，获得包含(较佳地从N端至C端)淀粉酶的淀粉结合域蛋白-酶的表达产物；步骤(b)中，将所述的表达产物与淀粉基质相接触，从而淀粉酶的淀粉结合域蛋白-酶被吸附到淀粉基质表面，获得淀粉基质-淀粉酶的淀粉结合域蛋白-酶复合物；之后，将待酶切的蛋白与淀粉基质-淀粉酶的淀粉结合域蛋白-酶复合物接触，从而待酶切的蛋白被酶切。在另一优选例中，所述待酶切的蛋白是融合蛋白。在另一优选例中，所述的酶是类泛素小修饰蛋白特异性的蛋白酶；和所述的待酶切的蛋白是(较佳地从N端至C端)类泛素小修饰蛋白-靶蛋白(外源蛋白)的融合蛋白。在另一优选例中，所述的类泛素小修饰蛋白特异性的蛋白酶选自酵母泛素样特异性蛋白酶I(Ulpl)或其活性片段，去类泛素化蛋白酶蛋白(SENP，如选自SENPl SENP8中任一蛋白)。在另一优选例中，步骤(b)之后，还包括(C)加入潜在地可与目的蛋白相互作用的其它蛋白，观察目的蛋白与其它蛋白的相互作用情况。在另一优选例中，所述的目的蛋白是去类泛素化蛋白酶(SENP)蛋白(如选自SENPl SENP8中任一蛋白，或其活性片段，如C端蛋白)，所述的其它蛋白是含有类泛素小修饰蛋白序列的蛋白(如融合蛋白)，从而观察去类泛素化蛋白酶对于类泛素小修饰蛋白序列的识别或切割特性。在另一优选例中，所述的目的蛋白是对于蛋白的类泛素小修饰蛋白化有用的酶(如SAEI，SAEII和/或Ubc9)，步骤(b)之后，还包括
加入底物蛋白；观察在与所述对于蛋白的类泛素小修饰蛋白化有用的酶接触后，所述的底物蛋白的类泛素小修饰蛋白化情况。在另一优选例中，所述方法还包括筛选出发生类泛素小修饰蛋白化的底物蛋白。在本发明的另一方面，提供一种表达载体，所述的表达载体含有以下可操作性相连的元件(较佳地，从5’端至3’端)淀粉酶的淀粉结合域蛋白编码基因-类泛素小修饰蛋白编码基因-多克隆位点；所述的多克隆位点用于插入目的蛋白编码基因。在本发明的另一方面，提供前述的表达载体的用途，用于表达、固相化及纯化目的蛋白。在本发明的另一方面，提供一种用于表达、固相化及纯化目的蛋白的试剂盒，其中包括用于将目的蛋白与类泛素小修饰蛋白和淀粉结合域蛋白相融合表达，形成淀粉酶的淀粉结合域蛋白-类泛素小修饰蛋白-目的蛋白融合蛋白的试剂；以及用于将目的蛋白与淀粉结合域蛋白-类泛素小修饰蛋白相分离的试剂。在另一优选例中，所述的试剂盒中包括前述的表达载体；和/或类泛素小修饰蛋白特异性的蛋白酶；和/或淀粉基质；和/或宿主细胞；和/或蛋白重组表达试剂(如制备感受态细胞的试剂，转化试剂，宿主细胞培养基，表达诱导剂，限制性内切酶，DNase或电泳试剂)；和/或蛋白纯化试剂(如洗涤液，洗脱液或溶菌酶)。在本发明的另一方面，提供一种融合蛋白，其包括淀粉酶的淀粉结合域，以及与之相连的选自下组的蛋白类泛素小修饰蛋白，酵母泛素样特异性蛋白酶1，去类泛素化蛋白酶蛋白(如选自SENPl SENP8中任一蛋白)，对于蛋白的类泛素小修饰蛋白化有用的酶(如SAEI，SAEII和/或Ubc9)，或它们的或其活性片段。在本发明的另一方面，提供一种表达载体，所述的表达载体含有以下可操作性相连的元件淀粉酶的淀粉结合域蛋白编码基因，以及与之操作性相连的选自下组的蛋白的编码基因类泛素小修饰蛋白，酵母泛素样特异性蛋白酶1，去类泛素化蛋白酶蛋白(如选自SENPl SENP8中任一蛋白)，对于蛋白的类泛素小修饰蛋白化有用的酶(如SAEI，SAEII和/或Ubc9)，或它们的活性片段。在本发明的另一方面，提供一种淀粉基质-淀粉酶的淀粉结合域蛋白-酶，其包括淀粉基质，以及吸附于淀粉基质的淀粉酶的淀粉结合域蛋白-酶融合蛋白(较佳地淀粉酶的淀粉结合域蛋白位于融合蛋白的N端)。在本发明的另一方面，提供 所述的淀粉基质-淀粉酶的淀粉结合域蛋白-酶的用途，用于酶切蛋白。在另一优选例中，所述的酶是类泛素小修饰蛋白特异性的蛋白酶；和所述的待酶切的蛋白是(较佳地从N端至C端)类泛素小修饰蛋白-靶蛋白(外源蛋白)的融合蛋白。在本发明的另一方面，提供一种用于酶切蛋白的试剂盒，其包括所述的淀粉基质-淀粉酶的淀粉结合域蛋白-酶复合物；或者其包括淀粉酶的淀粉结合域蛋白-酶融合蛋白，以及淀粉基质。本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
图I、淀粉结合域(SBD)编码序列的人工合成的引物设计示意图(318bp)。图中，1-8 分别对应于 Primerl_Primer8。F、R 分别对应于 PrimerF、PrimerR0图2、重叠PCR获得的目标基因SBD。M DNA Marker ;1 :引物1-4 PCR产物SBDl-4(166bp) ;2 :引物 5-8PCR产物 SBD5-8 (171bp) ;3:引物 1-8 PCR产物 SBD1-8 (316bp)；4 :带有酶切位点 Ndel/Nhel 的 SBD(342bp)。图 3、EGFP 的纯化。M :蛋白质 marker ；1 =Ulplc 从 SBD-SUMO-EGFP 切下来的 EGFP ；2 :留在淀粉珠上的SBD-SUMO ；3结合在淀粉珠上的SBD-SUMO-EGFP。图4、JNK2的纯化。M :蛋白marker I :结合在淀粉珠上的SBD-SUMO-JNK22 SBD-SUMO-JNK2 经 Ulpl 酶切结果。图5、左图为固相化Ulplc对SUM0-EGFP的催化反应的SDS-PAGE。M :蛋白marker ；I :阴性对照，不加入游离Ulplc酶的200ngSUM0-EGFP底物。2 :阳性对照，200ngSUM0_EGFP底物中加入2U的Ulplc 30°C反应lh。3 :固定化的Ulplc活性检测，200ngSUM0_EGFP底物中加入2U的SBD-Ulplc 30°C反应lh。右图为对左图各泳道相应的催化反应的说明。图6、SBD-Ubc9 (SBDUbc9)，SBD-SAE1 (SBDSAE1)和(SBDSAE2)的固相化。M :蛋白质Marker ；E :大肠杆菌细胞裂解的粗提物；F :穿出液；B :结合在淀粉珠。图7、固相化SAEI，SAEII，Ubc9 的 SUMO化反应的 Western Blot 检测。以 Anti-flag作为抗体。Lane I :蛋白 Marker。Lane 2 :阴性对照，不加三个游离酶 SBDSAEI、SBDSAE2、SBDUbc9。Lane 3 :阳性对照，同时加入三个游离酶SBDSAEI、SBDSAE2、SBDUbc9。Lane 4 :同时固相化 SAE1、SAE2、Ubc9 三个。Lane 5 =SBDSAEI 游离，SBDSAE2、SBDUbc9 固相化。
Lane 6 SBDSAE2 游离，SBDSAE1、SBDUbc9 固相化。Lane 7 SBDUbc9 游离，SBDSAEU SBDSAE2 固相化。Lane 8 :SBDSAEI、SBDSAE2 游离，SBDUbc9 固相化。Lane 9 SBDSAEK SBDUbc9 游离，SBDSAE2 固相化。LanelO :SBDSAE2、SBDUbc9 游离，SBDSAE1 固相化。图8、Ulplc内切酶活性。图9、SENPlc内切酶活性。图10、SENP2c内切酶活性。
图11、SENP7c内切酶活性。图12、SENP8内切酶活性。图13A、来源不同的SBD氨基酸序列比对示意图。图13B、RoGA SBD拓扑结构和晶体结构示意图。左图是RoGA SBD的拓扑结构图，不同颜色标有数字的箭头条带是不同的β折叠片段；右图是RoGA SBD的三维晶体结构示意图，图中标记的氨基酸Υ32，W47，Υ67，Υ58，Υ83，Υ93，Υ94，这些芳香族氨基酸位于SBD和底物的结合位点。图14、SBD和SUMO标签的联用示意图。图15、固相化Ulpl催化反应体系示意图。图16、SBD固相化SENPs反应体系。图17、三个酶同时固相化酶催化反应体系示意图。图18、基于荧光能量共振转移的快速筛选SENPs酶活性及其激动剂或抑制剂的方法。
具体实施例方式本发明人经过广泛的研究，开发了一种全新的蛋白标签——淀粉结合域(StarchBinding Domain, SBD)，目的蛋白在与该SBD融合后，由于SBD能够很好地与淀粉基质进行结合，可良好地应用于目的蛋白的固定化或目的蛋白的纯化，还可应用于观察目的蛋白与其它蛋白的相互作用。经验证，所述的SBD是一种廉价而可靠的标签蛋白。术语如本文所用，所述的“标签”是指蛋白标签，其通常与其它蛋白融合表达，用于分离、鉴定或纯化蛋白。如本文所用，所述的“淀粉酶的淀粉结合域(SBD) ”是指来源于淀粉酶的一段蛋白片段，其是在淀粉酶中发挥与淀粉相互结合作用的结构。SBD作为一种蛋白标签，不管是处于融合蛋白的C端还是N端，都不影响其作为标签的作用。如本文所用，所述的“固相化”或“固定化”可互换使用，是指目的蛋白固定于特定的固相基质或固相载体上的过程。如本文所用，所述的淀粉基质是指原始淀粉(直链淀粉或支链淀粉)或商品化的淀粉树脂或淀粉珠(淀粉beads,或简称beads)。所述的淀粉基质可良好地吸附和固定所述的淀粉酶的淀粉结合域，该吸附是非共价的特异性吸附。如本文所用，术语“含有”、“包括”或“具有”包括了“包含”、“主要由......构成”、“基本上由......构成”、和“由......构成”。淀粉结合域SBD是来源于淀粉酶的一段蛋白片段，其是在淀粉酶中发挥与淀粉相互结合作用的结构。自然界存在很多催化淀粉降解的淀粉酶，在这些酶中大多具有SBD，如淀粉葡萄糖苷酶(GlucoAmyIase,GA)、α -淀粉酶、β -淀粉酶、麦芽糖四糖水解酶、麦芽五糖水解酶、环化糊精葡萄糖转移酶等。例如，本发明实施例中的SBD来源于米根霉菌(Rhizopus oryzae)的淀粉葡萄糖苷酶(RoGA)，其具有NCBI protein entry :ABB77799所示的氨基酸序列(其中SBD结构域位于第26 (A)-131 (T)位)。SBD的经过一个或多个(如1-20个，较佳地1-10个，更佳地1_5个，如2个，3个)
氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的变异形式也包括在本发明中。其变异形式包括一部分保守氨基酸的替代序列，所述经氨基酸替换的序列并不影响其活性或保留了其部分的活性。适当替换氨基酸是本领域公知的技术，所述技术可以很容易地被实施，并且确保不改 变所得分子的生物活性。这些技术使本领域人员认识到，一般来说，在一种多肽的非必要区域改变单个氨基酸基本上不会改变生物活性。所述的SBD标签可应用于与目的蛋白融合，从而分离或固定该目的蛋白。SBD作为一个纯化标签，能够很好地和淀粉基质进行结合。SBD标签与目的蛋白的融合蛋白能够和淀粉基质有效的结合，而且这种结合是特异性的。SBD标签与淀粉基质的结合可以被麦芽糖(如浓度为Ι-lOOmM，较佳地2-50mM，更佳地5_20mM)洗脱。SBD有自身的优势如强大的结合能力和较好的结合容量，简便的洗脱过程，廉价而又易得的结合基质等。SBD标签和SUMO标签共同应用于目的蛋白的表达纯化本发明人经过深入的研究，揭示了通过SBD和SUMO 二者的联合应用来进一步的优化重组蛋白分离和纯化的过程的方法。SBD和SUMO作为不同的蛋白融合标签，各有其自身的特点，SBD和SUMO的联用，一方面利用SBD与淀粉基质强大的亲和结合能力，简单的一步化洗脱去除非目的蛋白，另一方面利用SUMO在重组蛋白表达过程中的促溶效果，其在C末端切除并在目的蛋白的N-末端不残留氨基酸残基的特点，简单快速地获得不带任何多余氨基酸残基的目的蛋白。SBD和SUMO 二者的联合应用的原理如图14，N端的SBD标签作为固相化标签可以和淀粉基质特异性结合，融合的SUMO标签可以提高目的蛋白的表达量和可溶性。利用SUMO蛋白酶(Ulpl或Uplc)对SUMO的特异性切割，可以在固相化之后将目的蛋白切下获得不含N端残基的天然蛋白，而SBD和SUMO标签仍将留在淀粉基质上。SUMO能够在蛋白表达中形成一个很好的折叠核心，有利于重组融合蛋白的构象形成。同时SUMO能够被SUMO蛋白酶特异性的识别并切割，这样的切割过程能够获得N端不含有任何多余氨基酸残基的目标蛋白。本发明的实例证明，SUMO蛋白酶Uplc的确能从固相化的SBD-SUMO融合蛋白上将目标蛋白切下，从而快速完成蛋白纯化过程。SUMO的经过一个或多个(如1-20个，较佳地1_10个，更佳地I_5个，如2个，3个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的变异形式也包括在本发明中。其变异形式包括一部分保守氨基酸的替代序列，所述经氨基酸替换的序列并不影响其活性或保留了其部分的活性。适当替换氨基酸是本领域公知的技术，所述技术可以很容易地被实施，并且确保不改变所得分子的生物活性。这些技术使本领域人员认识到，一般来说，在一种多肽的非必要区域改变单个氨基酸基本上不会改变生物活性。SUMO的各种同源物也可被应用于本发明的方法中。SBD标签应用于固相化基于SBD标签可良好地与目的蛋白融合表达，以及其与淀粉基质具有强大的亲和结合能力且易于被洗脱，其可良好地用于对各种目的蛋白进行固相化。所述的目的蛋白没有特别的限制，如各种酶、功能蛋白。所述的目的蛋白也包括一些蛋白片段或活性结构域。SBD也可应用于观察蛋白之间的相互作用，把一种或多种蛋白固定于淀粉基质上，加入另一种或多种蛋白，观察这些蛋白之间的相互作用。例如将酶固定于淀粉基质上，加入反应底物，来观察酶催化作用。反应的底物也可以有多种的选择，相信该系统能够被广泛应用于酶催化反应，高通量筛选，蛋白纯化等一系列领域中。 所述的SBD可应用于酶的固相化。本发明已经证明，在SBD固相化酶催化反应体系中，固相化酶并进行固相化酶催化反应时，可取得比较满意的催化效果。重组表达且固相化的酶相比于天然构象纯化后的酶来说，仍然具有较好的反应活性和反应效率。固定化酶有个优点是通过简单离心就可以终止反应，也利于可后续反应或者检测过程。作为本发明的一个实施方式，利用SBD作为一个固相化标签，与SUMO蛋白酶(如Ulpl或Ulplc)融合表达，将SUMO蛋白酶特异性地固相化到淀粉基质上。固相化SUMO蛋白酶可对带SUMO标签的融合蛋白进行酶催化切割反应，从而获得N-末端与天然构象一样的目的蛋白。一种原理示意图如图15所示，首先重组表达的SBD-Ulpl的融合蛋白，可以通过与淀粉树脂混合获得所需的固相化Ulpl酶，在固相化的Ulpl介质体系中加入感兴趣的含有SUMO融合标签的目标蛋白，在低温条件下(4°C 37°C)进行酶催化切割反应，从而获得有天然N端的目标蛋白。在此过程中，由于SBD与淀粉的高度亲和结合能力，固相化的Ulpl的获得变的十分简单，不需要通过繁琐的制备纯化过程。在对SUMO融合重组蛋白进行切割反应的过程中，由于Ulpl的固相化，Ulpl不会或极少进入到反应的流动液相中，从而可以避免酶对后面可能进行的反应和检测的影响。另一方面，酶催化反应后，Ulpl温和反应条件能保持Ulpl活性和目标蛋白的构象，因而固相化的酶体系经过简单的洗涤步骤可以多次反复的使用，减少重复纯化目标蛋白的流程，降低了成本提高了效率。这些优点为该系统的商业化应用打下了良好的基础。通过淀粉珠一步亲和固定Ulpl酶，并且切割SUMO的酶催化反应，可以观察到与游离状态下的Ulpl类似的活性。作为本发明的一个实施方式，利用SBD作为一个固相化标签，在酵母中，仅有一种，称为SUMO ;而在哺乳动物中，有四种分别为SUM01，SUM02, SUM03, SUM04,同时有6种去SUMO化修饰的酶，分别是SENP1，SENP2，SENP3, SENP5, SENP6, SENP7。这种酶具有内切酶和异肽酶两种活性。目前系统性分析SENPs识别SUMO的特异性的研究少有报道。利用SBD固相化的特性，本发明人固相化了 SENPs的C-端催化结构域，并在体外进行了酶切反应，系统性地分析SENPs对SUMO识别的特点。如图16，融合表达的SBD-SENPs与淀粉树脂混合，固定在淀粉树脂上，再与ECFP-SUMOs-EYFP反应，很容易检测到SENPs酶切活性和特异性。作为本发明的一个实施方式，利用SBD作为一个固相化标签，应用于固相化酶体外检测SUMO化反应体系。除了生物信息学对氨基酸序列的分析预测SUMO化底物外，急需一种高通量的筛选能够被SUMO化的蛋白的方法。在体外，SUMO化的反应需要一些酶的协同参与，SPEl (SAEI/SAEII)和E2 (Ubc9)。本发明人将多个酶同时进行固相化并进行相关催化反应，如图17。SUMO化反应需要SAEI，SAEII, Ubc9三个酶的协同作用，将三个酶同时固相化，在固相化体系中加入底物蛋白和SUM0，从而能在流出液中检测到被SUMO化的底物蛋白。该方法可应用于筛选出被SUMO化的蛋白。本发明的主要优点在于(I)首次揭示了一种全新的蛋白标签SBD，目的蛋白在与该SBD融合后，由于SBD能够很好地与淀粉基质进行结合，可良好地应用于目的蛋白的固定化或目的蛋白的纯化， 还可应用于观察目的蛋白与其它蛋白的相互作用。(2)与其他一些亲和载体如最常见的Ni-NTA树脂，Protein A树脂等相比较，原始淀粉或相关商品化淀粉树脂是一种非常廉价的基质。这些特点使得SBD可以作为一种较经济和实用的新型蛋白质标签。(3) SBD固相化酶催化反应对于工业化酶的应用有较好的商业前景。尤其是对目标蛋白纯度要求不是很高的重组蛋白(80%纯度)的工业用酶，可以大量地节约成本。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。实验材料与方法菌种、细胞系和载体菌株E.coli DH5 a，E. coli BL21 (DE3)。细胞株HEK293T(ATCC)。质粒和DNA pET28a (自带 His 标签，Novagen), pEGFP-Cl (Clontech)。主要试剂酶类各种限制性内切酶(NEB)，Pfu DNA聚合酶(上海生工)，T4 DNA连接酶(Invitrogen)。试剂盒类质粒抽提QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN),胶回收试剂盒 QIAEX
IIGel Extraction Kit(QIAGEN)0化学试剂蛋白胨，酵母提取物(OXOID);常用无机盐无特别注明均来自上海国药集团，有机盐无特别注明均购自Sigma。分子量Marker:IOObp DNA Marker (Bio-Rad) ； Ikb DNA Marker (Bio-Rad);蛋白质分子量Marker (上海生化细胞所)；预染蛋白质分子量Marker(Bio-Rad)。培养基和溶液
LB培养基
蛋白胨IOg
酵母抽提物5g
NaClIOg
加 dH20 至IOOOml
pH7.0灭菌(121。〇，20min)。氨节青霉素钠Amp (100mg/ml)灭菌dH205mlAmp 粉末0. 5g工作浓度100yg/ml。LBA 培养基在LB培养基中，加Amp，终浓度为100 μ g/ml。LB琼脂平板培养基在LB培养基中加入I. 2%琼脂粉，高压灭菌15分钟，冷却至60 °C左右，加入Amp (终浓度为 100 μ g/ml)。TE缓冲液Tris · Cl (pH8. O)10mmol /I,EDTA (pH8.0)lmmol/L。DNA电泳试剂50 X TAE 冰乙酸57. ImlO. 5mol/L EDTA (ρΗ8· O) IOOml加dH20 至1000ml。6 X加样缓冲液溴芬蓝0.25%二甲苯青0.25%甘油30%。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂30%胶贮备液
丙烯酰胺30g
N，N’-亚甲基丙烯酰胺0.8g加 dH20 至IOOOml
过滤(0·45μηι)4°C 保存。积层胶缓冲液(Tris· C1/SDS)Tris · Cl (ρΗ6· 8) O. 5mol/L
SDSO. 4% (w/v)。于4°C可保存I个月。分离胶缓冲液(Tris· C1/SDS)
Tris Cl(pH8.8)1.5 mol/L
SDS0.4%(w/v)
于4°C可保存I个月
过硫酸铵10%(w/v)N, N, N，N，-四甲基乙二胺(TEMED)。2X样品缓冲液4X Tris · Cl/SDS, pH6. 8 (O. lmol/L)25ml
甘油[20%(w/v)]20ml
SDS[4%(w/v)]4g
DTT3.Ig
溴芬蓝
10 mg加dH20至IOOml并混匀，等量分装成Iml于_20°C贮存。电泳缓冲液(5 X贮存液)
Tris base15.Ig
甘氨酸72g
SDS5g
加 dH20 至IOOOml脱色液甲醇冰乙酸水=4. 5 I 4. 5(体积比)染色液在脱色液中加入O. 25%考马斯亮蓝R250并用Whatman I号滤纸过滤染液。感受态细菌所需试剂液体SOB培养基
蛋白胨20g/L
酵母抽提物5 g/L
NaCl0.6 g/L
KCl0.5 g/L灭菌。用前加 入IM MgCl2 至终浓度 IOmM
IM MgSO4 至终浓度 10mM。Buffer I
RbCl (IOOmM)12 g/L
MnCl2-4H20 (5OmM) 9.9 g/L CaCl2-2H20 (I OmM) 1.5 g/L Glycerol (15%)150 g/L
KAc (3OmM)2.94 g/L10% HAc调节pH至5. 8，过滤除菌，4°C保存。Buffer 2
0.5M MOPS(pH 6.8) (IOmM) 20 ml/L RbCl (IOmM)1.2 g/L
CaCl2-2H20 (75mM)11 g/L
Glycerol (15%)150 g/L过滤除菌，4°C保存。固相化所需试剂Buffer
Tris-HCl (pH7.4)20mM
NaCl200mM
EDTAImM
β巯基乙醇10mM。镍柱纯化试剂裂解缓冲液(pH 8. O)
NaH2PO45 OmM
NaCl3 OOmM Imidazole IOmM Pmercaptoethanol IOmM glycerol 10%。洗涤缓冲液(pH 8. O)NaH2PO45 OmM
NaCl3 OOmM Imidazole 20mM Pmercaptoethanol IOmM glycerol 10%。
洗脱缓冲液(pH 8.0)
NaH2PO45 OmM
NaCl3 OOmM
Imidazole250mM
PmercaptoethanolIOmM
glycerol10%。SUMO化所需试剂SUMO化反应缓冲液SI DTT2mMATP5mMTris-HCl (pH7. 4)20mM。水解SUMO 反应 buffer
Tris-HCl, pH 8.050 mM
Igepal (NP-40)0.2%
NaCl150 mM
DTTImMWestern Blot 所需试剂5X Western Blot 电转移缓冲液 5L Tris 145. 2g, Gly 73. 2g。IOX TTBSTris200mMNaClI. 5NTween200.5%。SBD (Starch binding domain)目标序列的获得I、分步重叠 PCR 法扩增目的片段 Starch binding domain (SBD)如图I设计淀粉结合域(SBD)编码序列的人工合成引物。引物PrimerKSEQ ID NO 2) :5’ATGGCGAGCA TTCCGAGCAGCGCGAGCGTGC AGCTGGATAGCTATAACTAT GATGGCA 3’Primer2(SEQ ID NO :3) :5’AATGTTTTTC ACATAAATTT TGCCGCTAAAGGTGCTGCCATCATAGTTAT AGCTATCCA 3’primer3(SEQ ID NO :4) :5’ CGGCAAAATT TATGTGAAAAACATTGCGTA TAGCAAAAAAGTGACCGTGG TGTATGCGG 3’Primer4(SEQ ID NO :5) :5’ CCGCAATAAT GTTGCCGTTG TTGTTCCAGTTATCGCTGCCATCCGCATAC ACCACGGTC 3’Primer5(SEQ ID NO :6) :5’AACGGCAACA TTATTGCGGCGAGCTTTAGC GGCCCGATTAGCGGCAGCAA CTATGAATA 3’Primer6(SEQ ID NO :7) :5’ATTCTTTAAT GCCTTTCACG CTCGCGCTAAAGGTCCAATATTCATAGTTG CTGCCGCTA 3’
Primer7(SEQ ID NO :8) :5’AGCGTGAAAG GCATTAAAGAATTTTATATT AAATATGAAGTGAGCGGCAA AACCTATTA 3’Primer8(SEQ ID NO :9) :5’GGTGCTCACC TGATAGTTCG CGCTGTTGTTGTTATCATAATAGGTTTTGC CGCTCACT 3’Primer F(SEQ ID NO :10) :5’ GGAATTCCATATGGCGAGCATTCCGAGCAG 3，，下划线为NdeI识别位点Primer R :5’ GCCTAGCTAGCGGTGCTCACCTGATAGTTCG 3’ (SEQID NO :11)，下划线为NheI识别位点a. PCR反应体系I) SBD (1-4)片段模板(Primer2，3)各 I μ I ;Primer F/R (Primer1,4) 各 0· 2 μ I ;Pfu 酶I μ I ;IOXPfu 缓冲液5μ1;dNTP I μ I ；ddH20 41. 6μ I ；2) SBD (5-8)片段模板(Primer6,7)各 I U I ;Primer F/R (Primer5,8) 各 0. 2 μ I ;Pfu 酶I μ I ;IOXPfu 缓冲液5μ1;dNTP I μ I ；ddH20 41. 6μ I ；b.PCR 程序95 °C, 5min — (94 °C,30sec — 62 °C,30sec — 72 °C,40sec) X 25 — 72°C，IOmin — 4°C。2、分段 PCR 产物的胶回收(QIAEX II Gel Extraction Kit 150):参照 QIAGEN 产品说明书。3、二次 PCR将前面PCR反应得到的纯化好的2个片段SBD (1-4)和SBD (5-8)继续作为模板再次进行PCR反应，并将反应得到的目的基因SBD。
a.反应体系模板(SBDI-4, SBD5-8)各 I μ I ;Primer F/R各 I μ I ;Pfu 酶I μ I ;IOXPfu buffer 5 μ I ；
dNTP I μ I ；ddH20 39 μ I ;b. PCR 程序95 °C, 5min — (94 °C,30sec — 65 °C,30sec — 72 °C,45sec) X25 — 72 °C,IOmin — 4°C。在按前述胶回收步骤进行纯化回收得到目的基因。His-SBD-tagged原核表达载体的构建前述得到目的基因片段SBD经过NdeI和NheI双酶切定向克隆到原核表达载体pET28a(自带 His tag)，构建 pET28aHis_SBD 通用载体。对构建好的质粒进行酶切鉴定，确认目的片段正确插入载体，并委托美季公司进行序列测定。pET28a His-SBD-target gene 表达载体的构建分别设计四对引物1-8，用于构建质粒pET28aHis-SBD-ULPlc (引物I和 2)，pET28aHi s-SBD-SAEI (引物 3 和 4)，pET28aHis-SBD_SAE2 (引物 5 和 6)，PET28aHis-SBD-Ubc9 (引物7和8)，下划线为NheI识别位点或XhoI识别位点)引物I :5’ CTAGCTAGCCTTGTTCCTGAATTAAATGA 3’ (SEQ ID NO 12)引物2 :5’ CCGCTCGAGCTATTTTAAAGCGTCGGTTA 3’ (SEQ ID NO 13)引物3 :5，CGGAATTCGCTAGCATGGTGGAGAAGGAGGAGGCTGG 3，(SEQID NO 14)引物4 :5’ CCGCTCGAGTCACTTGGGGCCAAGGCACT 3’ (SEQ ID NO 15)引物5 :5，CGGAATTCGCTAGCATGGCACTGTCGCGGGGGCTG 3，(SEQID NO 16)引物6 :5’ CCGCTCGAGTCAATCTAATGCTATGACATCATC 3，(SEQ IDNO 17)引物7 :5’ CGGAATTCGCTAGCATGTCGGGGATCGCCCTCAGCAG 3’ (SEQ ID NO: 18)引物8 :5’ CCGCTCGAGTTATGAGGGCGCAAACTTCTTG 3’ (SEQ ID NO: 19)。用上述引物从相应的模板质粒pET28Ulplc(购自广州复能基因公司)，pET28SAEl (购自广州复能基因公司)，pET28 SAE2 (购自广州复能基因公司)，pET28Ubc9 (购自广州复能基因公司)通过PCR扩增得到相应目的基因片段。这些插入片段经过NheI和XhoI双酶切，克隆到前述构建的通用载体pET28a His-SBD的相应位点内，从而得到N端带有SBD标签的融合克隆。Ulp I的Genbank登录号为ΝΜ_001183834，截取其羧基端的催化结构域403L-621K，称为UlplCopET28a His-SBD-SUMO-target gene 表达载体的构建I、pET28a His-SBD-SUMO 构建Primer F :5’ CTAGCTAGCGGGTCGGACTCAGAAGTCAATCA 3’ (SEQ IDNO :20)下划线序列NheI识别位点；
Primer R5fCCCAAGCTTGGTCTCTACCTCCAATCTGTTCGCGGTGA 3，(SEQ ID NO :21)下划线序列BsaI识别位点；用上述引物，以pReCeiVer-B12质粒(广州复能基因公司)为模板，扩增获得酵母SUMO基因(GenBank登录号NM_001180818(SUM0蛋白全长101个氨基酸，此处获得的是第1-98位的氨基酸的编码基因))，以NheI和BsaI酶切后插入到经过同样酶切的通用载体pET28a His-SBD 中，得到 pET28a His-SBD-SUMO 载体。2、pET28a His-SBD-SUMO-target gene 构建分别设计两对引物1-2和3-4，从模板质粒ToplEGFP(购自广州复能基因公司)和pET28a JNK2(购自广州复能基因公司)PCR扩增得到目的片段EGFP和JNK2。然后以BsaI和XhoI酶切后插入到经过同样酶切的pET28a His-SBD-SUMO载体，构建得到N端带有SBD-SUMO 联合标签的质粒 pET28aHis-SBD-SUM0-EGFP，pET28a His-SBD_SUM0-JNK2。EGFP 和JNK2扩增引物如下所示引物I :5，GTGGGGTCTCCAGGTATGGCTAGCGTGAGCAAGGG 3，(SEQID NO 22)引物2 :5，CGAATTCTCGAGTCACTTGTACAGCTCGTCCATGC3’ (SEQID NO 23)引物3 :5，GAATTCGGTCTCTACCTATGAGCGACAGTAAATGT 3，(SEQID NO 24)引物4 :5’ CCGCTCGAGTTATCGACAGCCTTCAAG 3’ (SEQ ID NO 25)下划线BsaI识别位点或XhoI识别位点。3、SBD-SENPs 和 ECFP-SUMOs-EYFP 载体构建本发明人克隆了 SENPs C-端催化结构域SENPlc (419_643aa)，SENP2c(363-589aa), SENP3c (353-574aa), SENP5c(536-755aa), SENP6c(628-1112aa)，SENP7c (640-984aa)以及SENP8的编码基因片段，以上结构域的序列及位点的计算基于以下 GenBank 登录号的序列SENP1 ΝΜ_014554 ；SENP2 NM_021627 ；SENP3 NM_015670 ；SENP5 NM_152699 ；SENP6 NM_001100409 ；SENP7 NM_020654 ；SENP8 AF308450,这些片段都具有全长蛋白的酶活性。将上述SENP结构域的编码基因的片段克隆到N-His-SBD的B01. I载体(广州复能基因有限公司)；为了更好地检测SENPs的酶切酶活性，设计以下几种底物ECFP-SUM01-EYFP，ECFP-SUM02-EYFP，ECFP-SUM03-EYFP，ECFP-SUM04-EYFP，克隆到 B01. I载体当中。底物设计方法如下利用KpnI和XhoI把EYFP编码序列(参见GenBank登录号FJ493465)克隆到B01. I载体得到B01. I EYFP ;再利用XmnI和KpnI别将SUMOl编码序列(参见GenBank登录号NM_003352)，SUM02编码序列(参见GenBank登录号NM_006937)，SUM03编码序列(参见GenBank登录号NM_006936)，SUM04编码序列(参见 GenBank 登录号NM_001002255)克隆到 B01. IEYFP 得到 B01. 1SUM0-EYFP ;再利用 XmnI将ECFP编码序列(参见GenBank登录号FJ524330)克隆到B01. 1SUM0-EYFP得到相应的B01. 1ECFP-SUM0-EYFP。RbCl感受态细胞的制备(I)将 DH5 α 菌种划线到 LB 平板，37°C，10_12h ；(2)挑单克隆于30ml S. O. B中，37°C，培养过夜;(3)按 I 100 接过夜菌到 200ml S. O. B 中，37°C，培养至 0D550 = O. 35，约 2 小时；
(4)把菌液迅速转移至冰盐浴(_3 _5°C )中，预冷15min ( 3分钟轻轻摇动一次)，同时预冷500ml离心杯；(5)预冷离心机；(6)把菌液迅速转移至500ml离心杯中；(7) 4500rpmX 5min, 4°C,弃上清；(8)加 4X16ml Bufferl,轻混,悬浮,冰盐浴中 15min ;(9) 4000rpmX 5min, 4°C,弃上清；(10)加 4X4ml Buffer2，悬浮细胞，至冰上；
(11)立即分装成200 μ I/管(管预冷)；(12)液氮速冻；(13)-70Γ保存。转化(I)将5 μ I连接产物加入RbCl感受态细胞中，混匀后冰上放置30min。(2) 42°C温浴 2min，冰浴 2min。(3)加入 Iml LB，37t^jam45min lh。(4) 6，OOOrpm离心lmin，弃上清，留下约100 μ I液体将沉淀悬浮，吸出液体铺盘。(5)倒置放于37 °C培养箱中12 15h。蛋白表达和溶解性测试融合蛋白在E. coli中表达重组表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)后，接种单克隆菌落于LB培养液，37°C培养12 14小时；取上述培养菌液按I : 100比例接种于新鲜的LB培养基中，37°C培养至OD6tltl为O. 6 O. 8，加入异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，22°C培养16-20h。6000rpm离心收集菌体。将菌体溶于含有O. 5mg/ml溶菌酶的破菌缓冲液中，液氮冻融，反复三次，加入DNase I至终浓度为25mg/ml以及MgSO4至终浓度20mM，冰上消化至不粘，高速离心(18000rpm/min)后取上清S，沉淀P和全菌W，未诱导全菌Neg分别取样，进行SDS-PAGE电泳。His tag镍柱纯化用5mL的裂解缓冲液重悬50mL离心收的菌(含有目的蛋白)，加入溶菌酶至终浓度lmg/ml，冰上放置30分钟；超声每3秒一次间隔10秒，功率200W，一共40次；如果超声后裂解液比较黏稠，加入RNase A(10ug/ml)和DNase I (5ug/ml)冰上消化15分钟；4°C,IOOOOg离心30分钟，保留上清；上清加到预先用裂解缓冲液平衡好的Ni柱，洗去杂蛋白，洗脱得到目的蛋白，每步都留样品，进行SDS-PAGE电泳。SBD-SAEI, SBD-SAEII, SBD_Ubc9，SBD-Ulplc, SBD-SENPs 的固相化步骤如下(I) 5ml诱导表达的菌液离心后去除培养液加入500ul Buffer混匀。(2)加入溶菌酶至终浓度O. 5mg/ml，冰上I小时。(3)超声破菌，200w，40次，每次2s，间隔10s。(4)超声后的菌液4°C 13000rpm离心30分钟。(5)与此同时对淀粉树脂(淀粉珠，简称淀粉珠；购自NEB公司)进行处理，每份样品取淀粉珠IOOul，离心以去除保存液，并用Buffer洗涤3次。
(6)超声后的菌液离心后，取其上清蛋白粗提物加入到洗涤后的淀粉珠。(7) 4°C混旋仪上旋转混匀I小时以充分结合。(8) 6000rpm离心I分钟，收集结合后的上清。(9)Buffer 500ul洗漆淀粉珠,6000rpm离心I分钟,洗漆2次,去除杂蛋白，从而得到固相化的目标蛋白。SBD-Ulplc的固相化酶催化反应阳性对照中Ulplc为表达纯化的Ulpl的C末端，其具有Ulpl (GenBank登录号NC_001148)的第403-625位蛋白质序列。Ulplc酶学活力定义按照Invitrogen公司的手册，I单位Ulplc活性定义为在 20μ1 体系，50mM Tris-HCl pH 8. 0,150mM NaCl, 5mM β-mercaptoethanol 条件下，3CTC I小时能够切割2ug的SUMO EGFP标准蛋白质底物的酶量。步骤如下(I)结合SBD-Ulplc后的淀粉珠再用Ulplc酶切反应buffer 500ul洗涤一次。离心，洗尽上清。(2)加入酶切反应缓冲液lOOul，底物蛋白2ug(参见CN200810036879. X)。4°C混旋仪反应过夜。(3)设置阳性对照和阴性对照，阳性对照底物蛋白2ug，Ulplc酶1U，缓冲液补足至20ul ;阴性对照底物蛋白(SUMO-GFP) 2ug，不加Ulplc酶，同样补足缓冲液至20ul，4°C混旋仪反应过夜。(4)过夜反应后，6000rpm离心I分钟，取上清样品，加入上样缓冲液100°C煮样品10分钟，留待SDS-PAGE胶电泳分析。(5)固相化的Ulplc酶在取尽上清后，再用酶切反应缓冲液500ul洗涤I次，再加入酶切反应缓冲液lOOul，底物蛋白2ug，继续4°C混旋仪反应8小时。SBD-SENPs的固相化酶催化反应SDS-PAGE检测(I)取固相化 SBD-Ulplc，SBD-SENPlc，SBD_SENP2c，SBD_SENP7c，SBD-SENP8 各
0.5ug,底物蛋白 2ug CFP-SUMOI-YFP，4ugCFP-SUM02_YFP，CFP-SUM03-YFP，CFP-SUM04-YFP，反应缓冲液体系50uL，混匀置30°C水浴反应I小时。(2)设置对照组，不加SBD-SENPs酶反应组，只加SBD-SENPs酶反应组，条件和(I)一样。(3)反应完，6000rmp离心I分钟，取上清40uL，加上8uL 6 X上样缓冲液100°C煮样10分钟，稍微离心，取3uL样品SDS-PAGE电泳分析免疫印迹(WesternBlot)检测采用的步骤如下(I)将要检测的样品进行SDS-PAGE电泳。(2)转膜(湿式电转仪，Bio-Rad):把SDS-PAGE胶浸泡在常规的电转移缓冲液中30分钟。在电转移板上依次铺两层缓冲垫片和一层滤纸，把胶铺在滤纸上，再铺上硝酸纤维素膜覆盖目的蛋白所在区域，再铺一层滤纸和两层缓冲垫片。把电转移板夹好。接通恒流电源(250mA)，转膜60分钟。(3)将转好的膜放置于5%脱脂牛奶中摇晃封闭I小时。用洗涤缓冲液(10X缓冲液的配方是=Tris 24. 2g ；NaCl 87. 74g ；Tween 5g ；pH 8. O ;加水至1L)漂洗5分钟，重复洗漆3次。(4)把膜浸在鼠源一抗(购自Sigma)溶液中摇晃I小时。用洗涤缓冲液漂洗5分钟，重复洗涤3次。(5)再将膜浸在含抗小鼠的二抗(购自Rockland)的溶液中摇晃O. 5小时，用缓冲液漂洗5分钟，重复洗涤3次。(6)用红外突光成像仪(Odyssey)观察结果。实施例I、SBD片段的获得如图I设计淀粉结合域(SBD)编码序列的人工合成引物。 在没有基因扩增的模板或者模板很难获取的情况下，重叠PCR技术是目前一种有效合成基因的方法和途径。本发明人利用分步重叠PCR技术人工合成SBD基因片段。按照SBD的序列共设计10条引物，1-8每两条引物之间都有一定长度的互补重叠序列(20bp)。利用中间两条引物作为模板(如引物2，引物3)，两边两条作为扩增引物(如引物1，引物4)，通过PCR的方式扩增出1-4，5-8，两段较长的DNA片段，然后再将纯化回收后的这两段片段(SBDl-4，SBD5-8)作为模板，利用引物F和引物R。经鉴定最终扩增出所需的目的基因片段SBD (Starch binding domain),如图2,为后续融合克隆的构建提供了模板。获得的SBD编码序列为Gcgagcattccgagcagcgcgagcgtgcagctggatagctataactatgatggcagcacctttagcggcaaaatttatgtgaaaaacattgcgtatagcaaaaaagtgaccgtggtgtatgcggatggcagcgataactggaacaacaacggcaacattattgcggcgagctttagcggcccgattagcggcagcaactatgaatattggacctttagcgcgagcgtgaaaggcattaaagaattttatattaaatatgaagtgagcggcaaaacctattatgataacaacaacagcgcgaactatcaggtgagcacc(SEQ ID NO 1)实施例2、SBD与促溶标签SUMO融合表达的纯化应用前面构建好的pET28a His-SBD-SUMO-EGFP, pET28a His-SBD_SUM0-JNK2，在大肠杆菌BL21(DE3)中经O. 5mM IPTG 22°C低温诱导表达20小时后，收集菌液进行超声破菌，离心后所得上清液蛋白粗提物与淀粉珠在4°C混旋结合I小时，溶液洗脱两次以去除杂蛋白。然后再用Ulplc酶(Ulpl的催化domain)进行酶切反应。如图3-4所示，可以看到SBD-SUM0-EGFP和SBD-SUMO-JNK2融合蛋白一步法很好地结合到淀粉珠，通过Ulplc酶切割后能有效纯化到目的蛋白。SBD自身作为一个固相化标签可以很好地和淀粉珠特异性结合，这种亲和结合比一般阴阳离子结合更为牢固，不易受PH值和离子浓度影响，因而在高盐改变离子浓度的情况下仍能够有效结合。在这种情况下，非特异性结合的杂蛋白由于离子浓度的改变而从淀粉珠上解离下来，从而达到分离纯化的效果。实施例3、固相化酶催化反应I、SBD固相化ULPl活性检测Ulpl作为特异性切割SUMO的酶，广泛用在SUMO标签融合表达蛋白时的SUMO标签切除。用游离的Ulplc酶切SUMO tag，Ulplc会残留混合在目的蛋白中，从而影响目的蛋白的纯度或者活性。本发明人试着通过表达SBD-Ulplc，简单洗脱过程可以将Ulplc酶固定在淀粉珠。此方法可以简单快速的固相化大量所需的较高纯度的重组蛋白酶。如图5所示，通过加入游离的Ulplc作为阳性对照,对比游离的Ulplc酶,固相化的Ulplc酶仍然具有较好的活性。在固相化体系中，由于酶的固相化，酶本身不会随着反应液的洗脱而存在于反应之后的底物中，更利于后续相应的检测和反应。同时可以看到，由于酶的催化反应本身的特性，在反应的过程中并不会被消耗或失活，利用温和的反应条件可以使固相化酶的重复利用成为可能。通过这些实验结果可以看出，该固相化酶的制备过程和催化反应体系具有很大的商业价值。2、SBD固相化SAEI/SAEII，Ubc9的体外检测 SUMO化反应体系flag标签的底物蛋白TopI-I (Tl-flag) =TopI-I为人源拓扑异构酶I (Topoisomerase I, Top I)的N-端l_200aa,本实施例所用的TopI-I蛋白常规方法将上述片段的编码序列(PCR时引入Flag标签)克隆入PET28获得重组质粒pET28His-f Iag-TopI-I，在大肠杆菌诱导表达通过镍柱纯化得到。在SBD固相化单个酶进行酶促反应得到较理想的结果后，本发明人探索了 SBD固相化多种酶促反应体系。以体外SUMO修饰过程作为研究模型。在SUMO化的反应体系需要El和E2两个酶的协同有序作用，把底物SUMO加到底物蛋白上。利用带有flag标签的底物蛋白TopI-I (Tl-flag)进行体外SUMO反应的检测。将三个酶分别通过SBD固相化(图6)后混合成固相化催化反应体系，通过加入底物和外源SUMOl能够一步性的完成底物的SUMO化催化过程。在实际的结果中，可以看到当固相化其中的一个，两个或者三个全部固相化时，SUMO化底物条带不一样，表明它们的催化效率不一样(图7)。由图6，可以看到淀粉基质能很好地一步洗脱固相化SBD-SAEI，SBD-SAE2和SBD-Ubc9。由图7可以发现，固相化这些酶不同组合，产生的SUMO化的底物不一样，这可能是因为SAEI和SAEII是一对异源二聚体，在SUMO的起始激活过程中，SAEI/SAEII通过在SUMO C端连接上AMP实现腺苷化，通过AMP的水解使之与SAEII形成硫脂键。因此在lane8中，单一固相化Ubc9的情况下，游离的SAEII在与SAEI结合形成二聚体后，所受到的“空间位阻”影响最小，最易形成反应所需的复合体，因而SUMO化的催化效率比较高。总之图7可以说明利用SBD固相化的SAE1/SAE2，Ubc9体外检测SUMO化是具备可行性的，将来可以以此为基础建立一些高通量的筛选方法。 3、SBD固相化去SUMO化相关酶SENPs筛选其底物的特异性为了了解人的去SUMO化酶(SENPs)内切酶活性的底物特异性，本发明人利用SBD固相化了 SENP1，SENP2, SENP3, SENP5, SENP6, SENP7的C-端催化结构域，并用不同底物(SUM01, SUM02, SUM03, SUM04)来测试SENPs的内切酶活性。另外还测试了 SENPs的酵母同源物Ulpl对人的SUMO活性。从图8-12可以看出，SENPl，SENP2，Ulpl能很好地识别SUMOl，SUM02, SUM03，但不能识别 SUM04，SENP7, SENP8 不能识别 SUMOl，SUM02, SUM03, SUM04，几乎看不到内切酶活性。另外我们设计的SUMO底物的N端和C端分别融合了两个荧光蛋白ECFP和EYFP，当SENPs不能水解ECFP-SUM0-EYFP时，ECFP和EYFP产生荧光能量共振(FRET) ；SENPs水解ECFP-SUM0-EYFP时，不能发生荧光能量共振，这种光谱的改变可以通过荧光分光光度计或者多功能酶标仪检测到，从而可以建立基于荧光能量共振转移的快速筛选SENPs酶活性及其激动剂或抑制剂的方法，见图18。总结
本发明对于SBD蛋白标签在蛋白纯化和蛋白固相化的应用方面进行了研究和探索。I)利用其自身的特点应用于蛋白纯化；2)将SBD同促溶标签SUMO串联表达，利用SUMO的促溶效果和特性识别SUMO的蛋白酶Ulpl能在其C端切割获得天然蛋白的特点，进一步扩展SBD标签的应用；3)利用SBD与淀粉基质强大的亲和结合能力应用于固相化研究。我们把催化SUMOyltion的酶El (SAE1/SAE2)和E2 (Ubc9)通过SBD标签固相化，建立体外筛选SUMO化蛋白底物的固相化酶反应体系，用来高通量筛选SUMO修饰的候选蛋白。另外本发明人利用SBD标签固相化人的DeSUMOylation相关酶SENPs研究其内切酶活性的底物特异性。这些固相化研究提示，通过SBD标签可以建立一种非化学催化和非光学激活的蛋白偶联技术，并且可以应用于药物的高通量筛选和工业用 酶催化反应。在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
权利要求
1.淀粉酶的淀粉结合域的用途，用于作为目的蛋白固相化的标签。
2.一种目的蛋白固相化的方法，所述方法包括 (a)将目的蛋白与淀粉酶的淀粉结合域融合表达，获得包含淀粉酶的淀粉结合域-目的蛋白的融合蛋白的表达产物； (b)将所述的表达产物与淀粉基质相接触，从而淀粉酶的淀粉结合域-目的蛋白的融合蛋白被吸附到淀粉基质表面，所述目的蛋白被固相化。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，还包括对目的蛋白进行纯化 步骤(a)中，将目的蛋白与淀粉酶的淀粉结合域蛋白以及类泛素小修饰蛋白相融合表达，获得包含淀粉酶的淀粉结合域蛋白-类泛素小修饰蛋白-目的蛋白融合蛋白的表达产物； 步骤(b)中，将所述的表达产物与淀粉基质相接触，从而淀粉酶的淀粉结合域蛋白-类泛素小修饰蛋白-目的蛋白融合蛋白被吸附到淀粉基质表面； 之后，利用类泛素小修饰蛋白特异性的蛋白酶从被吸附的淀粉酶的淀粉结合域蛋白-类泛素小修饰蛋白-目的蛋白融合蛋白上切除目的蛋白，从而获得纯化的目的蛋白。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的目的蛋白是能酶切蛋白的酶 步骤(a)中，将酶与淀粉酶的淀粉结合域蛋白相融合表达，获得包含淀粉酶的淀粉结合域蛋白-酶的表达产物； 步骤(b)中，将所述的表达产物与淀粉基质相接触，从而淀粉酶的淀粉结合域蛋白-酶被吸附到淀粉基质表面，获得淀粉基质-淀粉酶的淀粉结合域蛋白-酶复合物； 之后，将待酶切的蛋白与淀粉基质-淀粉酶的淀粉结合域蛋白-酶复合物接触，从而待酶切的蛋白被酶切。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的酶是类泛素小修饰蛋白特异性的蛋白酶；和 所述的待酶切的蛋白是类泛素小修饰蛋白-靶蛋白的融合蛋白。
6.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(b)之后，还包括 (c)加入潜在地可与目的蛋白相互作用的其它蛋白，观察目的蛋白与其它蛋白的相互作用情况。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的目的蛋白是去类泛素化蛋白酶蛋白，所述的其它蛋白是含有类泛素小修饰蛋白序列的蛋白，从而观察去类泛素化蛋白酶对于类泛素小修饰蛋白序列的识别或切割特性。
8.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的目的蛋白是对于蛋白的类泛素小修饰蛋白化有用的酶，步骤(b)之后，还包括 加入底物蛋白；观察在与所述对于蛋白的类泛素小修饰蛋白化有用的酶接触后，所述的底物蛋白的类泛素小修饰蛋白化情况。
9.一种表达载体，所述的表达载体含有以下可操作性相连的元件淀粉酶的淀粉结合域蛋白编码基因-类泛素小修饰蛋白编码基因-多克隆位点；所述的多克隆位点用于插入目的蛋白编码基因。
10.权利要求9所述的表达载体的用途，用于表达、固相化及纯化目的蛋白。
11.一种用于表达、固相化及纯化目的蛋白的试剂盒，其中包括用于将目的蛋白与类泛素小修饰蛋白和淀粉结合域蛋白相融合表达，形成淀粉酶的淀粉结合域蛋白-类泛素小修饰蛋白-目的蛋白融合蛋白的试剂；以及 用于将目的蛋白与淀粉结合域蛋白-类泛素小修饰蛋白相分离的试剂。
12.如权利要求11所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中包括 权利要求9所述的表达载体；和/或 类泛素小修饰蛋白特异性的蛋白酶；和/或 淀粉基质；和/或 宿主细胞；和/或 蛋白重组表达试剂；和/或 蛋白纯化试剂。
13.一种融合蛋白，其包括淀粉酶的淀粉结合域，以及与之相连的选自下组的蛋白类泛素小修饰蛋白，酵母泛素样特异性蛋白酶I，去类泛素化蛋白酶蛋白，对于蛋白的类泛素小修饰蛋白化有用的酶(如SAEI，SAEII和/或Ubc9)，或它们的或其活性片段。
14.一种表达载体，所述的表达载体含有以下可操作性相连的元件淀粉酶的淀粉结合域蛋白编码基因，以及与之操作性相连的选自下组的蛋白的编码基因类泛素小修饰蛋白，酵母泛素样特异性蛋白酶1，去类泛素化蛋白酶蛋白，对于蛋白的类泛素小修饰蛋白化有用的酶，或它们的活性片段。
15.一种淀粉基质-淀粉酶的淀粉结合域蛋白-酶，其包括淀粉基质，以及吸附于淀粉基质的淀粉酶的淀粉结合域蛋白-酶融合蛋白。
16.权利要求15所述的淀粉基质-淀粉酶的淀粉结合域蛋白-酶的用途，用于酶切蛋白。
17.一种用于酶切蛋白的试剂盒，其包括权利要求15所述的淀粉基质-淀粉酶的淀粉结合域蛋白-酶；或者 其包括淀粉酶的淀粉结合域蛋白-酶融合蛋白，以及淀粉基质。
全文摘要
本发明涉及标签的联合应用。本发明开发了一种全新的蛋白标签--淀粉结合域(Starch Binding Domain，SBD)，目的蛋白在与该SBD融合后，由于SBD能够很好地与淀粉基质进行结合，可应用于目的蛋白的固定化或目的蛋白的纯化，还可应用于观察目的蛋白与其它蛋白的相互作用。所述的SBD是一种廉价而可靠的标签蛋白。
文档编号C07K1/14GK102757501SQ20111011035
公开日2012年10月31日 申请日期2011年4月29日 优先权日2011年4月29日
发明者李建中, 杨淑伟 申请人:中国科学院上海生命科学研究院