专利名称：一种以重组蛋白为标签的表达纯化系统的制作方法
技术领域：
本发明属生物技术领域，涉及一种蛋白表达纯化系统，尤其是一种以重组蛋白为 标签的表达纯化系统，该表达纯化系统能够提高目的蛋白产率、实施监测蛋白表达效果、纯 化过程。
背景技术：
已知蛋白质的生产、分离和纯化在生命科学研究和多肽类药物生产中具有重要的 地位。寻找使得蛋白质的产量提高、使得生产过程和纯化过程变的可视可控的良好方法，是 本领域研究人员的研究重点之一。目前广泛应用的是成熟的原核表达系统所用的标签有麦 芽糖结合蛋白标签(MBP)，谷胱甘肽转移酶(GST)标签、组氨酸His标签等，这些标签在提 高蛋白的溶解度、帮助蛋白折叠方面显示了一定的作用。该表达纯化系统主要操作方法包 括设计重组蛋白的融合片段，构建带有目的片段的载体，转入大肠杆菌表达，粗分离，层析 纯化和跑蛋白电泳验证。但是，实践表明，目前的技术仍存在如下问题对蛋白是否表达、表达量如何、是否 形成包含体沉淀、是否存在断表达等情况并不能有一个直观的了解；同时在蛋白纯化时，对 目的蛋白的走向一无所知，只能从峰值判断是否有蛋白流过；整个过程在暗箱中完成，需要 花费大量的财力和物力去检验等等。因此现有技术的蛋白纯化体系中使用的标签尚无法实 时指示目标蛋白在表达、纯化中的情况，蛋白纯化实验周期长，可控性弱。
发明内容
本发明的目的是为解决目前蛋白表达纯化中遇到的问题，提供一种以重组蛋白为 标签的表达纯化系统。该表达纯化系统能够提高蛋白表达效率、实时跟踪蛋白表达纯化情 况。具体而言，本发明提供一种基于荧光蛋白的双标签“夹心法”蛋白表达纯化系统。本发明采用新型荧光蛋白和His短肽为标签构建了一个双标签“夹心法”蛋白表 达系统，其特征是将目的蛋白的两端接上标签，在N端连接一个新型蛋白sGFP标签，在C端 连接上一个组氨酸His短肽，并在荧光蛋白标签两端和目的蛋白片段两端加有多核苷酸酶 切位点，蛋白全长融合表达。本发明同时可以根据需要在目的蛋白与标签之间加入蛋白酶 切位点，His标签可以根据纯化需要缩短或延长。本发明中，将目的蛋白接上不同标签后进行融合表达表达，用亲和层析进行纯化， 其中荧光蛋白(superfold Green Fluorescence Protein, sGFP)为标签一,组氨酸His 接 头为标签二，构建成“夹心法”蛋白表达纯化系统。本发明中，在目的蛋白N端接上荧光蛋白sGFP，在目的蛋白C端接上His6的短肽 和一个终止密码子，重组蛋白进行全长融合表达，并用Ni柱亲和层析纯化。本发明中，在目的蛋白与sGFP间，在目的蛋白与His短肽间具有多核苷酸序列酶 切位点。
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本发明中，在目的蛋白与sGFP间，在目的蛋白与Hi s短肽间具有可插入的蛋白酶 切位点。本发明中，Hi s短肽接头具有不同的氨基酸个数。本发明所述的载体表达的融合蛋白N端是一个新型荧光蛋白sGFP，该荧光蛋白自 身性质稳定，溶解度高，且能够帮助其C端的融合蛋白进行正确的折叠和表达，提高目的蛋 白的可溶性，适合作为蛋白融合标签。同时，在可见光下sGFP激发绿光，因此在蛋白表达和 纯化时能够对全过程可视化监控，仅通过肉眼监视蛋白的表达效率、断裂程度及纯化流程。本发明中，提供了具有该双标签“夹心法”重组蛋白片段载体pT7Hi s，其中，重组蛋 白片段载体pT7His上有宿主体所识别的开放可读框orf，AMP抗性标记进行筛选，限制性内 切酶位点 BamHI，Ndel, Xhol, Ecol, SamI, Hindlll,以及一段 His 短肽基因。本发明中，采用限制性内切酶技术，其能够在特定的核苷酸序列处切开位点，帮助 加入或去除所需要的片段。在荧光蛋白片段的两侧设计了多核苷酸酶切位点，能够帮助对 荧光蛋白的替换。本发明将sGFP荧光蛋白的DNA序列加入到所述载体的左端，使其能够优 先表达具有发光性能的荧光蛋白，使得整个表达纯化系统在第一时间达到可视化的效果。本发明在目的片段两侧设计了多个核苷酸酶切位点，可以根据需要接入不同目的 蛋白的片段，且便于对目的蛋白片段的替换，在商业生产上能够进行大规模的批量操作。本发明中，所述的His标签放在了重组蛋白全长片段的末端，即C端，使得只有当 该重组蛋白全长表达时，才能够具有His标签；而那些断表达的蛋白则不具有His标签，于 是可以通过镍柱亲和层析得到分离，并在流出液中根据颜色判断重组蛋白断表达情况。本发明中，可以根据需要缩短或延长Hi s短肽的氨基酸个数，从而优化分离纯化 的效果。本发明中，在将目的蛋白组装进载体的同时在其C端设计了蛋白酶切位点，在表 达纯化后将荧光蛋白标签切除，最终获得无大分子量标签的蛋白产品，能满足商业生产目 的的完整、没有任何接头的蛋白产品。本发明在目的蛋白的基因片段N端接上新型荧光蛋白标签sGFP，在荧光蛋白标签 与目的蛋白间加入蛋白酶切位点。sGFP亮度高，理化性质稳定，使得操作者能够通过颜色判 断目的蛋白是否表达，其表达程度如何，在纯化过程中实时示综目的蛋白的走向，根据颜色 收集有目的蛋白的洗脱液，不用经过电泳步骤即可进行后续实验，降低实验操作难度和实 验经费。sGFP同时也能帮助其C端融合蛋白的折叠，对于低表达、易沉淀的蛋白能够提高其 折叠效率和溶解性。蛋白酶切位点能够将大分子荧光蛋白标签去除，获得没有标签的完整 目的蛋白，提高商业化的适用率。在目的蛋白片段C端接上His标签，用于镍柱的亲和层析 系统，便于重组蛋白的纯化。当含有目的蛋白的样品上柱时，断表达的蛋白由于不具有His 标签使得段表达蛋白不能上柱，在流出液中因有荧光蛋白标签故能指示指示蛋白的断裂表 达情况。本发明在该载体系统中设计了多个核苷酸酶切位点，方便不同的用户选用熟悉或 者偏好的酶进行重组加工，因此对大量不同目的蛋白的替换方便，适用于大规模研究和生 产。本发明的有益效果是1)荧光蛋白亮度高，而且稳定，有利于可视化。2)荧光蛋白性质稳定，助折叠，能够提高目的蛋白增溶性。
3)双标签“夹心法”设计指示蛋白的断裂表达情况。4)His接头长度根据纯化条件可任意调整。5)多核苷酸酶切位点设计便于目的蛋白替换，操作便捷。6)实时监控，节省时间和经费。7)蛋白酶切位点有助于商业化生产目的蛋白。8)表达纯化系统成熟，易于大规模推广。9)可规模化、产业化，成批操作，带来可观经济效益。下面是结合附图和实验例本对本实验新型进一步说明。
图1是本发明的载体构建示意图，显示了重组蛋白的全长DNA片段内容，其中，灰 色竖线表示限制性核苷酸酶切位点，白色表示荧光蛋白标签的DNA片段，左侧灰色方向表 示蛋白酶切位点的短肽，深灰色圆形表示目的蛋白的DNA片段，右侧灰色方形为His标签的 DNA片段。图2是具有该双标签“夹心法”重组蛋白片段载体pT7His的标准示意图，其中，重组蛋白片段载体pT7His上有宿主体所识别的开放可读框orf，AMP抗性标 记进行筛选，限制性内切酶位点BamHI, Ndel，Xhol，Ecol，SamI，Hindlll，以及一段His短
肽基因。图3是将构建完成的载体转入大肠杆菌中进行筛选，取正确克隆在自动诱导培养 基中进行表达实例。图4为带有荧光标签的蛋白在收菌、粗分离过程中能够全流程的进行示综，其中，从左至右为离心收菌、重悬菌体、离心沉淀和离心上清。图5和图6为层析柱分离纯化时标签目的蛋白实时走向的示意图，其中，图5中深灰色部分表示挂柱的目的蛋白，显示目的蛋白在流程中进行的环 节，蛋白断表达情况和蛋白的实际表达量；图6中左一为上样前；左二为不挂柱的流出液， 无亮色，可以判断该蛋白断表达情况较低；右二为NiC清洗的流出液，说明双标签重组蛋白 挂柱效果好；右一为NiB洗脱后的样品。图7是用DEAE离子交换柱梯度洗脱时的示综效果和洗脱结果。图8是使用该双标签“夹心法”系统的TEV酶的酶活测定结果。
具体实施例方式实施例1在根据所要研究或生产的目的蛋白DNA序列应用PCR技术在目的蛋白序列两端加 上限制性酶切位点，并根据需要在N端加上蛋白酶切位点，用于去除接头。结合图2所示，将PCR后的目的蛋白片段插入到双标签“夹心法”载体系统中。将构建完成的载体转入大肠杆菌中进行筛选，取正确克隆在自动诱导培养基中进 行表达。图3所示，使用了该双标签“夹心法”系统后能对蛋白是否表达具有指示作用，其 中显示了带有荧光标签的蛋白表达，呈亮色，从颜色可以看出有明显的蛋白表达，而没有荧 光标签的表达系统，则不能推断蛋白表达情况如何。
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结合图4所示，本发明观察了带有荧光标签的蛋白在收菌、粗分离过程的全流程， 结果显示，离心后沉淀只有深色，已经没有亮色，说明破菌完全。本发明所述的标签在层析柱分离纯化时能够显示目的蛋白实时走向(图5和图 6)，操作者根据颜色变化，能判断出所挂柱的目的蛋白，了解目的蛋白在流程中进行的环 节，同时能够有效的检查蛋白断表达情况，还可以从最终产品的颜色粗略估计目的蛋白的 实际表达量。还可以根据不挂柱的无亮色的流出液，判断出蛋白断表达情况较低；根据NiC 清洗的流出液，判断出双标签重组蛋白挂柱效果好。用DEAE离子交换柱梯度洗脱时的示综效果和洗脱结果显示，在没有紫外监控设 备的实验条件下，可以根据每管中的颜色确定目的蛋白存在于哪几管中以及浓度如何，颜 色越深表明该管蛋白浓度越高，可以相应地方便的收集其中的目的蛋白。本发明对使用该 双标签“夹心法”系统的TEV酶的酶活进行了测定，与传统的MBP标签相比，实验结果显示 本发明对蛋白酶酶活没有影响。
权利要求
一种以重组蛋白为标签的表达纯化系统，其包括，将目的蛋白接上不同标签后进行融合表达表达，用亲和层析进行纯化，其特征是所述目的蛋白的两端接有标签，其N端连接荧光蛋白(sGFP)标签，C端连接组氨酸His短肽标签，构建成“夹心法”蛋白表达纯化系统。
2.根据权利要求1所述的表达纯化系统，其特征是所述目的蛋白C端接有His6的短 肽和一个终止密码子，重组蛋白进行全长融合表达，并用Ni柱亲和层析纯化。
3.根据权利要求1所述的表达纯化系统，其特征是在所述的目的蛋白与荧光蛋白 (sGFP)间，在所述的目的蛋白与His短肽间具有多核苷酸序列酶切位点。
4.根据权利要求1所述的表达纯化系统，其特征是在所述的目的蛋白与荧光蛋白 (sGFP)间，在所述的目的蛋白与His短肽间具有可插入的蛋白酶切位点。
5.根据权利要求1所述的表达纯化系统，其特征是所述的His短肽接头具有不同氨 基酸个数。
全文摘要
本发明属生物技术领域，涉及一种蛋白表达纯化系统，尤其是一种以重组蛋白为标签的表达纯化系统。本发明的蛋白表达纯化系统，是将目的蛋白的两端，在N端连接一个新型荧光蛋白sGFP标签，在C端连接上一个组氨酸His短肽，并加有多核苷酸酶切位点，蛋白全长融合表达。同时可以根据需要在目的蛋白与标签之间加入蛋白酶切位点。该系统的目的蛋白表达效率能够得到改进，提高目的蛋白产率，全长蛋白在可见光下为绿色，可以实施监测蛋白表达效果、纯化过程；仅通过肉眼监视蛋白的表达效率、断裂程度及纯化流程。
文档编号C12P21/02GK101921819SQ200910052999
公开日2010年12月22日 申请日期2009年6月12日 优先权日2009年6月12日
发明者丁澦, 刘瑞, 吴一峰, 吴旭冬, 吴迪, 周杨彬, 岳志亮, 陆致晟, 陈闻涛 申请人:复旦大学