一种¹⁵N-L-组氨酸的分离纯化方法

专利名称：一种¹⁵N-L-组氨酸的分离纯化方法
技术领域：
本发明涉及氨基酸的分离提纯领域，特别涉及一种"N-L-组氨酸的分离纯 化方法。
背景技术：
"N-L-His为一种"N标记的左旋组氨酸，是一种较难分离纯化的氨基酸。 发酵生产中15N-L-His的含量不高，杂酸很多，给分离带来很大的困难。国外 报道中一般采用阳离子树脂直接吸附和强碱性树脂双串联的方法等，如United State Patent 3716453; United State Patent 3902966;国内有一些从蛋白水解液中 分离提取L-His的报道，如沈阳药科大学学报，22 (3) : 223 225 (2005); 氨基酸杂志，4: 23 24 (1994);化学工程，34 (2) : 1 3 (2006);化工 科技，13 (5) : 1 4 (2005)。这些方法难以解决了 "N-L-His上柱量低，交 叉洗脱严重，难于分离等问题。发明内容本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的不足之处而提供的一种 方法简练，收率较高，产品质量好的"N-L-组氨酸的分离纯化方法。本发明的目的可以通过以下技术方案来实现 一种"N-L-组氨酸的分离纯 化方法，其特征在于，该方法采用离子交换法分步提取得到"N稳定性同位素 标记L-组氨酸溶液，通过真空浓縮赶氨并采用乙醇低温结晶、真空干燥得到产1=1叩o所述的方法具体包括以下步骤 U)发酵液絮凝除菌体将"N-L-组氨酸晶体的发酵液调pH值为3 6，缓慢搅拌下加入100ppm 的高分子絮凝剂，然后加入助凝剂，缓慢搅拌30 60分钟，离心或过滤除去 固体，用2 3倍体积去离子水洗涤固体，收集滤液和洗涤液，合并待用；(2) 树脂的处理 强酸性树脂用常规方法处理后装柱待用；(3) 杂离子和部分杂氨基酸的除去将步骤(1)处理好的发酵液以1.0mL/min的流速上氢型强酸性树脂，通完 液后同流速下用1 2倍树脂床体积的去离子水洗柱至中性，用0.05 0.2mol/L 的氨水溶液洗脱，收集含"N-L-组氨酸的流分干燥后去离子水溶解，所得料液 待用；(4) "N-L-组氨酸晶体的分离将步骤(3)得到的料液以0.5 3.0mL/min的流速上氨型强酸性树脂，上 完后用1 2倍树脂床体积的去离子水洗柱，洗完后以0.5 3.0mL/min的流速 用pH为8 10的氨水洗脱，收集"N-L-组氨酸晶体的高流分干燥后去离子水 溶解，待用；(5) "N-L-组氨酸晶体的干燥洗脱液的真空浓縮由步骤(4)得到的"N-L-组氨酸晶体溶液在40。C 6(rC下真空浓縮至3W 5% (质量)，保温待用；(6) "N-L-组氨酸晶体的干燥液的脱色将步骤(5)得到的浓缩液调pH为3 6左右，按0.1% 1.0% (质量)的 比例加入活性炭，60。C 85t:下保温搅拌0.2h 1.0h，然后过滤至无活性炭； (7) "N-L-组氨酸晶体的干燥浓縮结晶将脱色液真空浓缩至5% 7% (质量)，加入无水乙醇，常温冷却，再放入or 5。c的冰箱冷却结晶；(8) "N-L-组氨酸晶体的干燥将步骤(7)处理得到的晶体在4(TC 65t:的真空干燥箱内干燥lh 6h， 冷却后即得组氨酸晶体。所述的高分子絮凝剂包括聚丙烯酰胺及其衍生物，聚苯乙烯类及其衍生 物，聚丙烯酸类及其衍生物，壳聚糖类及其衍生物，海藻酸钠，明胶或骨胶。所述的助凝剂包括硫酸锌，聚合铝盐或聚合铁盐，加入量为0.1% 1%(质与现有技术相比，本发明提出一种在较大的规模下在含各种杂酸的发酵液中，以一种氢型强酸性树脂和一种氨型强酸性树脂相串联，交换吸附15N-L-His 及各种杂质，采用弱碱洗脱，最终分离提取出符合标准的15N-L-His的方法， 具有方法简练，收率较高，产品质量好等特点。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步说明。 实施例1组氨酸发酵液主要成分为组氨酸3.3克/升，谷氨酸0.4克/升，苏氨酸O.l 克/升，丝氨酸0.33克/升，赖氨酸1.4克/升，脯氨酸l.l克/升，甘氨酸0.84克 /升，精氨酸0.44克/升，缬氨酸0.33克/升，丙氨酸3.8克/升，苯丙氨酸0.6克 /升，葡萄糖，无机盐等。离子交换树脂的处理强酸性离子交换树脂732先用清水漂洗干净，装入O60X600毫米的玻璃 层析柱中，去离子水漂洗柱后待用。强酸性离子交换树脂732用清水漂洗干净，装入①60X600毫米的玻璃层 析柱中，去离子水漂洗柱至中性后用2mol/L的氨水洗至流出液呈碱性，转氨型， 再用去离子水漂洗至中性待用。发酵液用盐酸调pH值至5，加入100ppm聚丙烯酰胺，混匀后加入0.2% 的硫酸锌，缓慢搅拌30min后静置30 min ，过滤，并用水洗涤滤饼两次，合 并滤液和洗涤水。处理好的滤液调pH6上732氢型柱，流速1.0mL/min，上完液后用2倍床 体积的去离子水洗至中性，用0.15mol/L的氨水洗脱，收集含有15N-L-His的流 分，合并，减压旋转蒸发至干，赶除溶液中的氨水，再加去离子水溶解，调节 pH至5左右，上732氨型柱，上完液后用3倍床体积的蒸馏水洗柱，然后再用 0.01mol/L的氨水洗脱，点样，收集所有含"N-L-His斑点的高流分将"N-L-His高流分洗脱液6(TC真空浓縮至浓度5X，调pH = 5左右，并 按0.5%的量加入活性炭脱色，温度75'C，保温30分钟，过滤，滤液60"C真 空浓缩，加入7(TC无水乙醇，然后冷却至室温，放入2"C的冰箱过夜结晶，收 集晶体，将晶体在真空干燥箱内(50°C )干燥4h，即得15N-L-His成品，15N-L-His总收率为73%。 实施例2组氨酸发酵液主要成分为组氨酸3.0克/升，谷氨酸1.7克/升，赖氨酸3.8 克/升，脯氨酸0.8克/升，甘氨酸1.2克/升，精氨酸0.68克/升，丙氨酸2.4克/ 升，苯丙氨酸0.4克/升，葡萄糖，无机盐等.强酸性732型树脂处理同实施例1。发酵液用盐酸调pH值至3，加入100卯m聚丙烯酰胺，混匀后加入0.2% 的硫酸锌，缓慢搅拌60min后静置60 min ，过滤，并用水洗涤滤饼，合并滤 液和洗涤水。处理好的滤液调pH二3，上732氢型柱，上完后用2倍床体积的去离子水 洗至中性，用0.05mol/L的氨水洗脱，收集所有含"N-L-His的干燥流分，合并， 调pH-4，再上氨型732柱，上完液后用2倍床体积的蒸馏水洗柱，洗完后再 用pH-10的氨水洗脱，收集15N-L-His高流分"N-L-His高流分洗脱液40。C真空浓缩至浓度3X，调pH3左右，并按0.1 %的量加入活性炭，温度85'C保温20分钟，过滤，滤液再4(TC真空浓縮，加 入同温度的无水乙醇，然后冷却至室温，0"C冰箱结晶16小时，收集晶体，将 晶体在真空干燥箱内(40。C)干燥6h，即得"N-L-His成品，"N-L-His总收率 为71%。实施例3组氨酸发酵液主要成分为组氨酸3.4克/升，谷氨酸1.3克/升，苏氨酸0.3 克/升，丝氨酸0.29克/升，赖氨酸2.1克/升，甘氨酸0.71克/升，精氨酸0.56 克/升，缬氨酸0.13克/升，丙氨酸1.7克/升，苯丙氨酸0.86克/升，葡萄糖，无 机盐等.强酸性732型树脂处理同实施例1。发酵液用盐酸调pH值至6，加入100ppm聚丙烯酰胺，混匀后加入0.2% 的硫酸锌，缓慢搅拌60min后静置60 min ，过滤，并用水洗涤滤饼，合并滤 液和洗涤水。处理好的滤液调pH二6，上732氢型柱，上完后用2倍床体积的去离子水 洗至中性，用0.2mol/L的氨水洗脱，收集所有含"N-L-His的干燥流分，合并，调pH-6，再上氨型732柱，上完液后用2倍床体积的蒸馏水洗柱，洗完后再 用pH=8的氨水洗脱，收集15N-L-His高流分"N-L-His高流分洗脱液60。C真空浓缩至浓度5X，调pH6左右，并按1.0 %的量加入活性炭，温度6(TC保温60分钟，过滤，滤液再6(TC真空浓縮，加 入同温度的无水乙醇，然后冷却至室温，5X:冰箱结晶16小时，收集晶体，将 晶体在真空干燥箱内(65。C)干燥lh，即得"N-L-His成品，"N-L-His总收率 为71%。
权利要求
1. 一种15N-L-组氨酸的分离纯化方法，其特征在于，该方法采用离子交换法分步提取得到15N稳定性同位素标记L-组氨酸溶液，通过真空浓缩赶氨并采用乙醇低温结晶、真空干燥得到产品。
2. 根据权利要求1所述的一种"N-L-组氨酸的分离纯化方法，其特征在于， 所述的方法具体包括以下步骤(1) 发酵液絮凝除菌体将"N-L-组氨酸晶体的发酵液调pH值为3 6，缓慢搅拌下加入100ppm 的高分子絮凝剂，然后加入助凝剂，缓慢搅拌30 60分钟，离心或过滤除去 固体，用2 3倍体积去离子水洗涤固体，收集滤液和洗漆液，合并待用；(2) 树脂的处理 强酸性树脂用常规方法处理后装柱待用；(3) 杂离子和部分杂氨基酸的除去将步骤(1)处理好的发酵液以1.0mL/min的流速上氢型强酸性树脂，通完 液后同流速下用1 2倍树脂床体积的去离子水洗柱至中性，用0.05 0.2mol/L 的氨水溶液洗脱，收集含"N-L-组氨酸的流分干燥后去离子水溶解，所得料液 待用；(4) "N-L-组氨酸晶体的分离将步骤(3)得到的料液以0.5 3.0mL/min的流速上氨型强酸性树脂，上 完后用1 2倍树脂床体积的去离子水洗柱，洗完后以0.5 3.0mL/min的流速 用pH为8 10的氨水洗脱，收集"N-L-组氨酸晶体的高流分干燥后去离子水 溶解，待用；(5) "N-L-组氨酸晶体的干燥洗脱液的真空浓縮由步骤(4)得到的"N-L-组氨酸晶体溶液在4(rC 6(TC下真空浓縮至3n/0 5% (质量)，保温待用；(6) "N-L-组氨酸晶体的干燥液的脱色将步骤(5)得到的浓縮液调pH为3 6左右，按0.1% 1.0% (质量)的 比例加入活性炭，6(TC 85t:下保温搅拌0.2h 1.0h，然后过滤至无活性炭；(7) "N-L-组氨酸晶体的干燥浓縮结晶将脱色液真空浓縮至5% 7% (质量)，加入无水乙醇，常温冷却，再放入0 °C 5 °C的冰箱冷却结晶；(8) "N-L-组氨酸晶体的干燥将步骤(7)处理得到的晶体在4(TC 65'C的真空干燥箱内干燥lh 6h， 冷却后即得组氨酸晶体。
3. 根据权利要求2所述的一种"N-L-组氨酸的分离纯化方法，其特征在于， 所述的高分子絮凝剂包括聚丙烯酰胺及其衍生物，聚苯乙烯类及其衍生物，聚 丙烯酸类及其衍生物，壳聚糖类及其衍生物，海藻酸钠，明胶或骨胶。
4. 根据权利要求2所述的一种"N-L-组氨酸的分离纯化方法，其特征在于， 所述的助凝剂包括硫酸锌，聚合铝盐或聚合铁盐，加入量为0.1% 1%(质量)。
全文摘要
本发明涉及一种¹⁵N-L-组氨酸的分离纯化方法，该方法采用离子交换法分步提取得到¹⁵N稳定性同位素标记L-组氨酸溶液，通过真空浓缩赶氨并采用乙醇低温结晶、真空干燥得到产品。与现有技术相比，本发明具有方法简练，收率较高，产品质量好等特点。
文档编号C07D233/64GK101274912SQ20071003885
公开日2008年10月1日 申请日期2007年3月30日 优先权日2007年3月30日
发明者喻静兰, 徐大刚, 李良君, 杜晓宁, 梅丛笑 申请人:上海化工研究院