专利名称：一种含有gb1蛋白融合标签的快速克隆及表达质粒载体的制作方法
技术领域：
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种克隆及蛋白表达质粒载体，即一种含有GBl蛋白融合标签的快速克隆及蛋白表达质粒载体。
背景技术：
传统的克隆方法是通过将质粒载体同目的基因片段分别用相同的双酶切消化后产生2-4个碱基的粘性末端，利用连接酶将互补的粘性末端进行连接，随后转化大肠杆菌细胞，表达纯化蛋白。由于粘性末端长度比较短，后续必须通过T4 DNA连接酶将载体和目的基因片段进行连接，并且在此过程中可能会有部分载体发生自连接。这种方法克隆基因 大约需要两到三天时间。为了实现不依赖于连接酶的克隆方法，就需要构建一种更加方便有效的克隆载体。而且，目前市场上的商品化载体能够利用的融合标签也非常有限，将载体上设计的将目的蛋白同标签分离的蛋白酶价格也都比较昂贵。基于上述几方面的考虑，有必要提供一种带有常用的融合蛋白标签的快速克隆及蛋白表达载体。
发明内容
本发明的目的在于提供一种克隆及蛋白表达质粒载体，即一种在N端含有GBl融合蛋白标签并且能够将目的蛋白的基因进行快速克隆及蛋白表达的载体，从而弥补现有技术的不足。本发明的所述的质粒载体，包含有一段含有TEV酶识别位点的，用于编码GBl蛋白的基因片段；两侧带有BsaI酶切位点的GFP基因片段。上述的GBl蛋白的核苷酸序列为SEQ ID NO: I。上述的两侧带有BsaI酶切位点的GFP基因片段，其核苷酸序列为SEQ ID NO:2。本发明的载体，还包括有转录启动子、转录终止子、卡那霉素编码序列和复制子片段。本发明的载体，其遗传图谱如图I所示,核苷酸序列为SEQ ID NO: 3。本发明构建的质粒载体用于在原核菌中表达重组蛋白。本发明构建的载体可以在不依赖于连接酶的情况下实现目的基因的快速高效克隆及蛋白表达。并且在载体中引入了 GBl融合蛋白标签和TEV酶切位点，GBl融合蛋白标签帮助增加难溶解蛋白的溶解度，利于蛋白的分离纯化；TEV酶识别序列位于GBl蛋白的基因序列的下游，通过TEV酶对纯化的蛋白质进行切割，可以将GBl蛋白标签切除，得到天然的目的蛋白。TEV酶是目前最经济适用的酶，从而极大地节约了实验成本。
图I :本发明的质粒载体PJM-GBI的遗传图谱；图2 :重组蛋白pJM-GBI的表达纯化蛋白图谱；
其中M、PageRuler PrestainedProtein Ladder ;1、诱导前 BL21/pJM_GBl 的总蛋白；2、诱导后经超声裂解并离心后的上清部分；3、诱导后经超声裂解并离心后的沉淀部分；4、亲和层析流穿液；5、20mM咪唑洗涤液；6、200mM咪唑洗脱液。
具体实施例方式本发明的载体以pET_24d为出发质粒，在构建过程中，分别加入了 GBl蛋白基因，TEV酶切位点以及GFP基因。在GFP基因两侧各引入了一个BsaI单酶切位点。一方面，通过BsaI单酶切，该载体被线性化并在线性化的片段两侧各产生5'端突出的4个碱基的粘性末端，通过T4 DNA Polymerase及dTTP处理后，粘性末端的碱基数各增加至10个和12个，利用该粘性末端，能够方便快速将的目的基因克隆到该载体上并进行蛋白的表达纯化。另一方面，为了更快，更方便的控制克隆质量，在克隆的酶切位点BsaI位点中间插入的GFP 基因，在后续筛选阳性克隆的过程中，能够通过观察是否产生绿色荧光，来判断克隆基因是否插入到载体当中。下面对本发明的载体构建过程及应用进行详细描述。一、表达质粒载体(pJM-GBl)的构建第一步，在pET_24d (购买自Novogen公司，编号69772-3)的多克隆位点的N端加上his-Tag-GBl标签及TEV酶切位点。首先全序列合成his-tag-GBl-TEV，合成时在his-tag-GBl-TEV核酸序列的两端分别加上XbaI和NcoI的酶切位点，再连接到克隆载体上(其中his-tag-GBI-Tag-TEV序列为SEQ ID NO: I)。制备的克隆质粒用XbaI和NcoI双酶切后得到包含有his-Tag-GBl标签的小片段，与pET-24d经过XbaI和NcoI双酶切处理得到的载体进行连接，通过筛选得到N端带有his-Tag-GBl标签及TEV酶切位点的质粒，暂时命名为 pET-24d-GBl。第二步，将两个BsaI酶切位点引入上述构建好的质粒pET-24d_GBl当中，取代其中的多克隆位点。设计引物引物合成时要求5’端经过磷酸化修饰上游引物5’ -GGTCTCACCGCGTCGGGTCACCACCACCACCAC-3 ’下游引物5’ -CGGTCTCATGGCGCCCTGAAAATAAAGATTCTC-3 ’以pET-24d-GBl_Tag为模板进行扩增，PCR产物回收纯化后利用T4连接酶连接，筛选得到带有BsaI酶切位点的质粒pET-24d-GBl-2BsaI。第三步，根据GFP蛋白(SEQ ID NO: 2)的基因序列，合成BsaI-GFP-BsaI的核酸序列到克隆载体上。制备的克隆载体用BsaI酶切处理后得到的包含GFP的片段，与pET-24d-GBl-2BsaI经过BsaI酶切处理后的载体进行连接，得到最终的质粒pJM_GBl。制备的质粒pJM-GBl的遗传图谱如图I所示，其核苷酸序列为SEQ ID NO:3。二、本发明质粒的应用效果检测本发明提供的质粒载体在其GFP基因外侧各包含一个BsaI的酶切位点(黑体表示)，该载体经BsaI单酶切去除GFP基因后，载体被线性化，并且在线性化的片段两侧各产生5’端突出的4个碱基的粘性末端。BsaI酶切后的载体经过T4 DNA polymerse和dTTP处理，利用T4 DNA polymerse的3' —5'外切酶活性，可以去除3'端碱基直到遇到T终止，由此质粒载体被线性化并且两端的粘性末端碱基数目增加至10个和12个。该粘性末端可以在不依赖于连接酶的情况下同互补链发生特异性的退火。
ATTTTCAGGGCGCCATGAGACCG.. .GFP. ■ .GGTCTCACCGCGTCGGGTCACCAC TAAAAGTCCCGCGGTACTCTGGC.. .GFP.. CCAGAGTGGCGCAGCCCAGTGGTG
h /I
V
ATTTTCAGGGCGCCCGCGTCGGGTCACCAC
TAAAAGTCCCGCGGTCAGCCCAGTGGTG
T4 DNA polymerse +dTTP
V
ATTTTCCGCGTCGGGTCACCAC
TAAAAGTCCCGCGGTTGGTG具体实验步骤I. BsaI消化质粒载体配置混合体系5 μ g质粒载体2. 5 μ I BsaI (lOunits/ μ I)5 μ I 10ΧΝΕΒ buffer 3无菌水补齐到50 μ I5(TC 酶切 Ih。O. 8%琼脂糖电泳检测酶切效果，胶回收质粒载体片段。2. T4 DNA polymerse 处理质粒载体配置混合体系600ng BsaI消化后载体O. 5μ I dTTP(IOOmM)I μ I DTT(IOOmM)O. 2μ I 100XBSAO.4 μ I T4 DNA polymerse(3units/μ I)2 μ I 10ΧΝΕΒ buffer 2无菌水补齐到20 μ I22°C孵育 3Omin。75°C孵育 2Omin,灭活 T4 DNA polymerse。制备目的基因片段2. 2. I设计目的基因的引物 上游引物CAGGGCGCCATG-目的基因下游引物GACCCGACGCGGTTA_目的基因上下游引物含有同质粒载体粘性末端互补的碱基序列，上游引物中含有ATG起始密码子，下游引物含有TAA终止密码子。2. 2. 2 利用 T4 DNA polymerse 处理 PCR 产物利用设计好的引物，以目的基因为模板进行PCR扩增，扩增出来的产物回收后，利用T4 DNA polymerse和dATP处理，利用T4 DNA polymerse的3' —5'外切酶活性，可以去除3'端碱基直到遇到A终止。
CAGGGCGCCATG...!丨的 ...TAACCGCGTCGGGTC GTCCCGCGGTAC.」11城W.. .ATTGGCGCAGCCCAG
^ 7 T4 DNA polymerse +dATP
CAGGGCGCCATG...目的基因...TAA
AC I 的 IM...ATTGGCGCAGCCCAG2. 3目的基因片段同载体进行快速连接
CAGGGCGCCATG... S 的基因...TAA
AC...目的基因...ATTGGCGCAGCCCAG
+
ATTTTCCGCGTCGGGTCACCAC
TAAAAGTCCCGCGGTTGGTG
V7
ATTTTCAGGGCGCCATG... 11 的 .. .TAACCGCGTCGGGTCACCAC
TAAAAGTCCCGCGGTAC... i I ^ W.. .ATTGGCGCAGCCCAGTGGTG取I. 5ml离心管，按照下面方法操作取I μ I处理好的质粒载体(25_50ng)，同2 μ I处理好的目的基因片段(O. 02pmol)混匀后置于22°C孵育5min。加入I μ I EDTA(25mM)，混合后置于22°C继续孵育5min。利用本发明的质粒构建新的克隆，从PCR结束到连接的完成，仅仅需要Ih即可完成。而传统的方法需要通过对目的基因片段进行双酶切后再利用T4 DNA连接酶连接，一般需要Id时间。2. 4 转化将连接产物转化E. coli DH5a感受态细胞。2. 5鉴定阳性克隆通过菌落PCR方法鉴定阳性克隆，测序表明为目的阳性克隆。本发明所述的质粒载体转化的宿主细胞为大肠杆菌细胞，最佳的大肠杆菌细胞为BL2U BL21(DE3)等。表达质粒pJM-GBl转化入大肠杆菌BL21，用含有50 μ g/ml卡那霉素的LB培养基在37°C培养至0D600约为O. 6，加入终浓度为O. 3mM IPTG诱导，表达产物跑SDS-PAGE电泳。如图2所示，第二泳道为目的蛋白的可溶性表达量，第六泳道为纯化后的电泳结果；上述结果表明目的蛋白的可溶性表达量和纯度都满足实验的需要。利用本发明构建的质粒成功的表达出一种蛋白质连接酶(SortaseA)的缺失体蛋白SortaseA (61_621)，可溶性效果很好。首先设计目的基因的引物上游引物5’ -CAGGGCGCCAT GGCATATTTGT-3’ 下游引物 5’ -GACCCGACGCGGTTATT TGACTTCT-3’，以含有Sortase基因的质粒为模板进行PCR，PCR产物回收后利用BsaI进行酶切处理，与pJM_GBl载体连接，转化E. coli DH5a ，筛选得到阳性克隆。将测序正确的质粒转化E. coli BL21,IPTG诱导蛋白表达，利用镍柱亲和层析对该蛋白进行纯化，通过TEV酶对纯化的蛋白质进行切割，将GBl蛋白标签切除，得到天然的目的蛋白。TEV酶是目前最经济适用的酶，这也极大地节约了实验成本。
权利要求
1.一种克隆及蛋白表达质粒载体，其特征在于所述的质粒载体包含有 O一段含有TEV酶识别位点的，用于编码GBl蛋白的基因片段； 2)两侧带有BsaI酶切位点的GFP基因片段。
2.如权利要求I所述的载体，其特征更在于所述的编码GBl蛋白的基因的核苷酸序列为 SEQ ID NO:I。
3.如权利要求I所述的载体，其特征更在于所述的两侧带有BsaI酶切位点的GFP基因片段，其核苷酸序列为SEQ ID N0:2。
4.如权利要求I所述的载体，其特征更在于所述的质粒载体还包括有转录启动子、转录终止子、卡那霉素编码序列和复制子片段。
5.权利要求I所述的载体，其遗传图谱如图I所示。
6.权利要求I所述的载体，其核苷酸序列为SEQID N0:3。
7.权利要求I所述的载体用于在原核菌中高效表达重组蛋白。
全文摘要
本发明涉及一种克隆及蛋白表达质粒载体，包含有一段含有TEV酶识别位点的，用于编码GB1蛋白的基因序列和两侧带有BsaI酶切位点的GFP基因片段。本发明构建的载体可以在不依赖于连接酶的情况下实现目的基因的快速高效克隆及蛋白表达。并且在载体中引入了GB1融合蛋白标签和TEV酶切位点，GB1融合蛋白标签帮助增加难溶解蛋白的溶解度，利于蛋白的分离纯化；TEV酶识别序列位于GB1蛋白的基因序列的下游，通过TEV酶对纯化的蛋白质进行切割，可以将GB1蛋白标签切除，得到天然的目的蛋白。TEV酶是目前最经济适用的酶，从而极大地节约了实验成本。
文档编号C12N15/63GK102827858SQ201210336689
公开日2012年12月19日 申请日期2012年9月12日 优先权日2012年9月12日
发明者邹培建, 盖园明, 赵普亚, 秦刚 申请人:天津工业生物技术研究所