专利名称：检测鸡igfbp-3基因第二号外显子的单核苷酸多态性的检测方法
技术领域：
本发明属于分子遗传学领域，涉及基因单核苷酸多态性(SNP)的检测，特别涉及一种检测鸡IGFBP-3基因第二号外显子的单核苷酸多态性的检测方法。
背景技术：
单核苷酸多态性(SNP)就是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。包括单碱基的转换、颠换、插入及缺失等形式，其中最少出现的I种等位基因频率不小于1%。碱基突变分为转换(嘌呤-嘌呤或嘧啶-嘧啶)和颠换(嘌呤-嘧啶)2种。在原则上，突变处的碱基可以为A、T、C、G，但事实上SNP多发生在C和T 2个碱基之间。SNP在单个基因或整个基因组的分布是不均匀的。SNP在非转录序列要多于转录序列，而且在转录区非同义突变(有氨基酸序列的改变)的频率，比其他方式突变的频率低得多。Halushka等(1999)通过对75个基因检测，推测人类基因组有百万个SNP位点，其中大约有50万个在非编码区，SNP的频率在基因的5'端非编码区、3'端非编码区、内含子、沉默位点及编码区有显著差异(P = 6.6X10,)，突变热点CpG的频率在这5种区域中也存在显著差异(P = 0.025)。在群体遗传研究中，SNP作为新一代的遗传标记，有以下特点:(1)数量多且分布广泛:据估计，基因组中大约平均每1000 bp就会出现I个SNP，这样它们在整个基因组的分布就会达到300万个，遗传距离为2 3 CM，密度比微卫星标记更高，可以在任何一个待研究基因的内部或附近提供一系列标记；(2)富有代表性:某些位于基因内部的SNP有可能直接影响蛋白质结构或表达水平，因此它们可能代表疾病遗传机理中的某些作用因素；
(3)遗传稳定性:SNP是基因组中分布最广泛且稳定的点突变，突变率低，与微卫星等重复序列多态标记相比，SNP具有更高的遗传稳定性，尤其是处于编码区SNP; (4)检测快速，易于实现自动化:SNP通常是I种双等位基因的遗传变异，在检测时无需像检测微卫星标记那样对片段的长度做出测量，只需一个“+ /- ”或“全或无”分析的方式，有利于自动化筛选或检测SNP; (5)碱基的转换大于颠换:因为基因组中大多数C是甲基化的，能够自发的脱氨基产生T。因此SNPs作为遗传标记在群体遗传和生物进化中有重要意义。目前已经确定有7种IGFBPs (IGFBPl-7) ,IGFBP-3,是其中重要的一种，它是血液中最丰富的IGmPs结合形式，血液中95%的IGF-1和IGF- II都与IGmP-Z结合,IGFBPS有延长IGF半衰期、调节IGF的生物学活性等作用，故IGFBPS对IGFs功能的发挥有很大影响，从而间接地影响畜禽的生长发育、繁殖性能及肉的品质等。目前，畜禽基因多态性研究主要集中在牛和羊上。鸡IGFBP-3基因遗传变异领域的研究匮乏，该基因位点的功能研究及其遗传变异与家禽经济性状(如:体重、开产日龄、开产蛋重、开产体重、产蛋数等性状)关联的研究仍是空白
发明内容
本发明的目的是:针对上述不足，提供一种检测鸡IGFBP-3基因第二号外显子的多态性的检测方法。同时设计其与生产性状进行关联分析，验证其是否可以作为鸡分子育种辅助选择中的分子标记。为实现上述目的，本发明采用的技术方案是:
检测鸡IGFBP-3基因第二号外显子的单核苷酸多态性的检测方法，包括如下步骤:
一、设计鸡IGFBP-3基因第二外显子区域PCR引物
以NCBI所公布的鸡NC_006089序列为参考，设计能够扩增包含鸡IGFBP-3基因第二外显子区域的引物P，其序列如下:
上游引物为:CATCTTGGGACCAGTGCTTT 20 ；
下游引物为:ATTTTTCAAGCCTGCTGTGG 20 ；
二、以引物P进行PCR扩增待测鸡的IGFBP-3基因片段
a、鸡样本的采集
采集多个地方的鸡种作为检测对象，以包含鸡IGFBP-3基因的待测鸡全基因组DNA为模板；
b、待测鸡全基因组DNA模板处理
对上述含鸡IGFBP-3基因的待测鸡全基因组DNA模板进行分离、提取、纯化；
c、PCR扩增鸡IGFBP-3基因片段
PCR反应体系采用混合加样法，加入到I个1.5ml离心管中，充分混匀后瞬时离心，再分装到每个96孔平板中，然后加入经过步骤b处理后的待测鸡全基因组DNA模板，再瞬时离心后进行PCR扩增，所述PCR反应体系总量为19一25 μ L，其包括10 X PCR Buffer 2.0—3.0μ L、浓度为 25mmol/L 的 Mg2+ 2.2—2.5 μ L，浓度为 2 mmol/L 的 dNTPs 0.8 —1.5 μ L，浓度为10 pmol/μ L的上、下游引物各I μ L，浓度为5 U/mL的TaqDNA聚合酶0.2 — 0.6 μ L，浓度为100 ng/yL的DNA模板1.0— 1.5 μ L，超纯水11.8—12.5 μ L，扩增程序为:控制温度为92— 96 V，对PCR反应体系进行预变性处理4一6 min,保持温度在92— 96 V，变性处理50— 70 S，然后降低温度至54— 58 °C，进行退火处理20— 40 S，退火处理完毕后，升高温度至70— 74 V，再进行延伸处理20— 40s，将上述的变性处理——退火处理——延伸处理三个步骤按上述的顺序和工艺要求重复30— 35个循环，操作完成后控制温度为70—74 V，延伸处理9一 10 min,再降低温度至9一 10 V，对PCR反应体系进行保存；
三、MspI酶切反应消化PCR扩增的IGFBP-3基因片段
MspI酶切反应消化体系包括4.6—5.2 μ L PCR产物，限制性内切酶MspI5U，IOXBuffer 0.8—1.1 μ L，双蒸水5—6 μ L，酶切消化条件为:65°C恒温水浴消化6—8h ；
四、MspI消化PCR产物后聚丙烯酰胺凝胶电泳分析
a、制作浓度为10%的聚丙烯酰胺凝胶，点样后采用180V电压电泳25—35min，电泳结束后EB染色；
b、待分子量不同的待测鸡全基因组DNA分离清晰时，在柯达凝胶成像系统成像；
C、根据聚丙烯酰胺凝胶电泳结果分析SNP多态性；
根据聚丙烯酰胺凝胶电泳结果鉴定鸡IGFBP-3基因第1087位的单核苷酸多态性为:CC型表现为95bp和66bp两条条带，CT基因型表现为161bp、95 bp和66 bp三条条带，TT基因型表现为161bp —条条带；d、不同基因型个体PCR产物测序的序列验证
对不同基因型个体PCR产物分别进行正反双向测序，同时，进行SNP位置分析；
五、进行鸡IGFBP-3基因SNP位点的频率统计分析；
六、进行鸡IGFBP-3基因SNP位点基因效应的关联分析
第1087位点的TT基因型可以作为一个提高鸡产蛋数的候选分子遗传标记。与现有技术相比，本发明公开的鸡IGFBP-3基因的第1087位的SNP多态性，是一个与鸡部分生产性状密切相关的单核苷酸多态位点，本发明对4个鸡品种的SNP基因型进行了检测和基因频率分析，对上述SNP位点与鸡部分经济重要性状(产蛋数)进行关联分析，结果表明该位点能够作为提高鸡产蛋数的分子标记；
本发明的优点是:本发明针对上述第1087位的SNP多态性，通过设计特定的引物PCR扩增特定的限制性内切酶酶切鉴定，能够快速、简单、低成本、高精确地检测其单核苷酸的多态性；能够从分子遗传学上快速的对种质资源进行分型，以便用于鸡产蛋性状的标记辅助选择(MAS )，快速建立遗传优良的鸡种群。
下面结合附图和具体实施方式
对本发明作进一步详细叙述。图1为鸡IGFBP-3基因PCR产物电泳；
图2为鸡IGFBP-3基因包含第1087位的多态位点的161bp的PCR产物的Msp I酶切电泳结果；其中:1、泳道I (是TT型)，2、泳道2 (是TT型)，3、泳道3 (是CC型)，4、泳道4(是CC型)，5、泳道5是(CT型)，6、泳道6是(CT型)，M、Marker。图3为鸡IGFBP-3基因SNP的不同基因型测序图。(其中A为CC基因型个体第1087位的测序图，B为TT基因型个体第1087位的测序图，C为CT基因型个体第1087位的测序图)。
具体实施例方式本发明利用PCR-RFLP方法对鸡IGFBP-3基因第1087位密码子突变可能产生编码蛋白构象发生变化的单核苷酸多态性进行检测，并对该SNP与性状关联分析表明，该位点的多态性能够成为分子育种标记。以下实施例仅是用来说明本发明，而不是用来限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实现方法，通常按照常规条件。实施例1
如图1一3所示，本发明一种检测鸡IGFBP-3基因第二号外显子的单核苷酸多态性的检测方法，包括如下步骤:
一、设计鸡IGFBP-3基因第二外显子区域PCR引物
以NCBI所公布的鸡NC_006089序列为参考，利用Primer 5.0软件设计能够扩增包含鸡IGFBP-3基因第二外显子区域的引物P，引物P序列如下:
上游引物为:CATCTTGGGACCAGTGCTTT 20 ；
下游引物为:ATTTTTCAAGCCTGCTGTGG 20 ；
以上述引物对鸡基因组进行扩增， 能够扩增包含鸡IGFBP-3基因(NC_006089序列)第二外显子区域第1021bp 1181bp的161bp的基因片段，扩增后片段的电泳检测如图1所示。其中泳道I为检测片段，M为Marker ;对扩增的片段进行测序鉴定后，其中，第1061bp 1110bp的序列为如下所示:
agagacagta ggattgagtg cacccccggc gagtttgctg atggcactaa ；
经过分析，发现Msp I PCR-RFLP检测的SNP位置为1087bp (即IGFBP-3基因CDS区第183位)，当该位点由C突变为T时，导致第62位的密码子由CGG突变为TGG，从而形成错义密码子突变，即由Arg突变为Trp。当1087bp为C时，PCR扩增IGFBP-3基因产物的第1086bp 1089bp序列为CCGG，形成了 Msp I的酶切位点，当在1087位点有突变时，PCR扩增IGFBP-3基因产物的第1086bp 1089bp序列为CTGG，限制性内切酶Msp I不能识别；这样就可以对该位的SNP多态性进行检测。当用限制性内切酶Msp I对引物P对应扩增的基因片段酶切消化时，由于1086bp^l089bp的识别位点，因此能够被切成2段片段。二、以引物P进行PCR扩增待测鸡的IGFBP-3基因片段
a、鸡样本的采集
采集多个地方的鸡种作为检测对象，以包含鸡IGFBP-3基因的待测鸡全基因组DNA为模板；
本发明具体以3个中国地方鸡种和1个引进鸡种的种群作为检测对象，具体采集样本
见表1，其中:京海黄鸡(400)，AA鸡(30)，鹿苑鸡(46)，边鸡(50)；
表1鸡样本的采集
权利要求
1.检测鸡IGFBP-3基因第二号外显子的单核苷酸多态性的检测方法，其特征是包括如下步骤: 一、设计鸡IGFBP-3基因第二外显子区域PCR引物 以NCBI所公布的鸡NC_006089序列为参考，设计能够扩增包含鸡IGFBP-3基因第二外显子区域的引物P，其序列如下: 上游引物为:CATCTTGGGACCAGTGCTTT 20 ； 下游引物为:ATTTTTCAAGCCTGCTGTGG 20 ； 二、以引物P进行PCR扩增待测鸡的IGFBP-3基因片段 a、鸡样本的采集 采集多个地方的鸡种作为检测对象，以包含鸡IGFBP-3基因的待测鸡全基因组DNA为模板； b、待测鸡全基因组DNA模板处理 对上述含鸡IGFBP-3基因的待测鸡全基因组DNA模板进行分离、提取、纯化； c、PCR扩增鸡IGFBP-3基因片段 PCR反应体系采用混合加样法，加入到I个1.5ml离心管中，充分混匀后瞬时离心，再分装到每个96孔平板中，然后加入经过步骤b处理后的待测鸡全基因组DNA模板，再瞬时离心后进行PCR扩增，所述PCR反应体系总量为19一25 μ L，其包括10XPCR Buffer 2.0—3.0μ L、浓度为 25mmol/L 的 Mg2+ 2.2—2.5 μ L，浓度为 2 mmol/L 的 dNTPs 0.8 —1.5 μ L，浓度为10 pmol/μ L的上、下游引物各I μ L，浓度为5 U/mL的TaqDNA聚合酶0.2 — 0.6 μ L，浓度为100 ng/yL的DNA模板1.0— 1.5 μ L，超纯水11.8—12.5 μ L，扩增程序为:控制温度为92— 96 V，对PCR反应体系进行预变性处理4一6 min,保持温度在92— 96 V，变性处理50— 70 S，然后降低温度至54— 58 °C，进行退火处理20— 40 S，退火处理完毕后，升高温度至70— 74 V，再进行延伸处理20— 40s，将上述的变性处理——退火处理——延伸处理三个步骤按上述的顺序和工艺要求重复30— 35个循环，操作完成后控制温度为70—74 V，延伸处理9一 10 min,再降低温度至9一 10 V，对PCR反应体系进行保存； 三、MspI酶切反应消化PCR扩增的IGFBP-3基因片段 MspI酶切反应消化体系包括4.6 — 5.2 μ L PCR产物，限制性内切酶MspI5U，IOXBuffer 0.8—1.1 μ L，双蒸水5—6 μ L，酶切消化条件为:65°C恒温水浴消化6—8h ； 四、MspI消化PCR产物后聚丙烯酰胺凝胶电泳分析 a、制作浓度为10%的聚丙烯酰胺凝胶，点样后采用180V电压电泳25—35min，电泳结束后EB染色； b、待分子量不同的待测鸡全基因组DNA分离清晰时，在柯达凝胶成像系统成像； C、根据聚丙烯酰胺凝胶电泳结果分析SNP多态性； 根据聚丙烯酰胺凝胶电泳结果鉴定鸡IGFBP-3基因第1087位的单核苷酸多态性为:CC型表现为95bp和66bp两 条条带，CT基因型表现为161bp、95 bp和66 bp三条条带，TT基因型表现为161bp —条条带； d、不同基因型个体PCR产物测序的序列验证 对不同基因型个体PCR产物分别进行正反双向测序，同时，进行SNP位置分析； 五、进行鸡IGFBP-3基因SNP位点的频率统计分析；六、进行鸡IGFBP-3基因SNP位点基因效应的关联分析第1087位点的TT基因型可以作为一个提高鸡产蛋数的候选分子遗传标记。
全文摘要
本发明公开了检测鸡IGFBP-3基因第二号外显子的单核苷酸多态性的检测方法，其特征是包括如下步骤设计鸡IGFBP-3基因第二外显子区域PCR引物；以引物P进行PCR扩增待测鸡的IGFBP-3基因片段；MspI酶切反应消化PCR扩增的IGFBP-3基因片段；MspI消化PCR产物后聚丙烯酰胺凝胶电泳分析；进行鸡IGFBP-3基因SNP位点的频率统计分析；进行鸡IGFBP-3基因SNP位点基因效应的关联分析。本发明的优点是通过设计特定的引物PCR扩增特定的限制性内切酶酶切鉴定，能够快速、简单、低成本、高精确地检测其单核苷酸的多态性；能够从分子遗传学上快速的对种质资源进行分型，以便用于鸡产蛋性状的标记辅助选择(MAS)，快速建立遗传优良的鸡种群。
文档编号C12Q1/68GK103103252SQ20121033664
公开日2013年5月15日 申请日期2012年9月13日 优先权日2012年9月13日
发明者俞亚波, 王金玉, 顾云飞, 顾玉萍, 金崇富, 邱聪, 施会强, 张跟喜 申请人:江苏京海禽业集团有限公司, 扬州大学