专利名称：一种烟草花叶病毒壳蛋白模板结构修饰方法
技术领域：
本发明属于分子生物学与材料学研究领域，具体涉及到以分子生物学对烟草花叶病毒壳蛋白模板进行结构修饰的方法。
背景技术：
烟草花叶病毒(TMV)是烟草花叶病得病原体，对烟叶生长危害极大，近年来，有研究者开始将TMV在材料研究领域进行应用。单个TMV病毒体具有纳米管状结构，该结构长300nm,内径4nm,外径18nm,是一种典型的具有一维纳米结构的模板材 料。TMV外壳蛋白(CP)以其纳米管状的几何外形、高活性的内外表面被认为是一种理想的构筑低维材料的模板(R. Tsukamoto, M. Muraoka, M. Seki, H. Tabata, I. Yamashita.Chem. Mater. , 2007, 19: 2389 ;Ε· Du jardin, C. Peet, G. Stubbs, J. N. Culver, S. Mann. NanoLett. , 2003, 3:413 ；M. Knez, M. Sumser, A. M. Bittner, C. ffege, H. Jeske, T. P. Martin, K.Kern. Adv. Funct. Mater.，2004, 14:116.),目前以 TMV-CP 为模板，已经进行了多种纳米材料的生长，最终得到的复合材料被认为可在信息存储、光捕集以及传感器等领域有应用的潜力(R. J. Tseng, C. Tsai, L. Ma, J. Ouyang, C. S. Ozkan, Y. Yang. NatureNanotechnology, 2006, 1:72 ；R. A. Miller, A. D. Presley, Μ. B. Francis. J. Am. Chem.Soc. , 2007, 129 : 3104 ；T. L. Schlick, Z. Ding, E. ff. Kovacs, Μ. B. Francis. J. Am. Chem.Soc.，2005，127:3718)。一般来说，TMV-CP的组装体在分散介质中存在三种可能的状态(A. Klug. PhilosTrans R. Soc. London B, 1999，354:531) :1、蛋白A (可认为是单体、三聚体及五聚体之间的动态平衡);2、34个单体组成的盘状结构；3、一定长度的中空管状结构。调控体系pH值、离子强度以及温度等条件，可以使得TMV-CP处于某几种状态的动态平衡中，这就使得TMV-CP在具体应用中呈现出结构的不连续性，不利于发挥其作为模板材料的功能。
发明内容
本发明的目的在于提供一种烟草花叶病毒壳蛋白模板结构修饰方法，以改善TMV-CP的结构均一性。为了实现上述目的，本发明的技术方案采用了一种烟草花叶病毒壳蛋白模板结构修饰方法，主要通过对His-TMV-CP表达质粒的构建、蛋白的表达及纯化的方法进行结构的修饰，其壳蛋白模板结构修饰方法的具体步骤如下I) His-TMV-CP表达质粒的构建设计上游弓丨物TMVCP FI，和下游引物Hi s_TMV_CPRl，两条引物被用来PCR扩增TMV外壳蛋白，PCR产物随后经NdeI和NcoI双酶切，使用T4DNA连接酶连接进入pET28a载体，将连接产物电转化进入XLlBlue菌株，涂于LB琼脂平板上；然后挑取潜在的阳性克隆进行扩增，提取质粒DNA，并送测序，在其羧基端含有His标签的有确定DNA序列的His-TMV-CP质粒，随后被亚克隆进原核表达菌株Rosetta中进行蛋白表达；
2 ) Hi s-TMV-CP 蛋白的表达将含有宿主质粒的Rosetta原核表达菌株，置于含有100 μ g/mL氨节抗生素和25 μ g/mL氯霉素的LB培养基中，持续震荡摇菌直至OD值达到O. 5-0. 6，此时细菌处于对数期，在诱导表达前，菌液在25°C条件下孵育4-6分钟，取ImL菌液，离心，收取细菌保留以备进一步分析；然后加入诱导剂IPTG至浓度达到10 μ M，而后以SDS-PAGE分离细菌裂解液的方法评估蛋白表达情况，待蛋白表达达到最大值，收取全部菌液，将其重悬于裂解缓冲液中，低温保存，以备进一步纯化蛋白；3) HiS-TMV-CP 蛋白的纯化将重悬细菌产物在常温下解冻后,立即加入I. 5ml Buster试剂、30 μ I Lysonase试剂、5ml RNA酶和5ml DNA酶，在ImM (毫摩尔/升)的苯甲基磺酰氟浓度下将上述混合物在30°C，250rpm下震荡20-40分钟，加入30mL预冷的平衡缓冲液，冰浴4_6分钟，以11000-13000g(转速应该没有此单位，请采用常用的单位来表示，如r/s)，4°C离心15-20分钟，取上清与3mL已经平衡缓冲液冲洗的镍树脂充分混合，4°C转动孵育过夜，随后上蛋白纯化柱进行纯化；上柱纯化时，首先使液体自然流出蛋白纯化柱，直至无液体流出，在随后的纯化阶段，按照恒定的O. 5mL/L的流速洗脱柱子，然后分别以预冷缓冲液、冲洗缓冲液冲洗柱子，最后使用洗脱缓冲液来洗脱目标蛋白，保存于_20°C。所述的步骤I)中两条引物分别是上游引物TMVCP Fl,GATTCGTTTTACATATGTCTTACAGTATVACTAC，和下游引物 Hi s-TMV-CP Rl, TAGTACCATGGTCATTAGTGATGGTGATGGTGATGAGTTTGCAGGACCAGAGGTCo所述的步骤I)中PCR产物扩增的反应条件是解链温度95°C，30秒，退火温度
550C，30秒，延伸温度68 °C，30秒，重复35个循环。所述的步骤3)中预冷缓冲液为50mM磷酸钾，300mM氯化钾，ImM PMSF, IOmM β -巯基乙醇，IOmM咪唑，10%乙醇，PH值8.0 ;冲洗缓冲液为50mM磷酸钾，300mM氯化钾，ImMPMSF, IOmM β -巯基乙醇，40mM咪唑，10%乙醇，PH值8. O ;洗脱缓冲液为50mM磷酸钾，300mM氯化钾，ImM PMSF，IOmM β -巯基乙醇，500mM咪唑，10%乙醇，PH值8. O。本发明以分子生物学的方法，将His标签引入到TMV-CP中，His标签之间以及His标签与TMV-CP之间的强相互作用，改善TMV-CP的结构均一性，进而提高其作为模板材料的适用性，使得TMV-CP在介质较大的pH值、温度以及离子强度范围内，保持结构的稳定以及连续性，进而提高其作为模板材料的适用性，这将有望拓宽TMV-CP在材料领域的应用。
图I为His-TMVCP的透射电镜照片；·图2为TMVCP的透射电镜照片。由图I、图2可见，His-TMVCP在电镜下为棒状结构；而TMVCP除了有棒状结构，还呈现出盘状结构。
具体实施例方式下面本发明结合具体的实施例作进一步的说明实施例I
一种烟草花叶病毒壳蛋白模板结构修饰方法，其壳蛋白模板结构修饰方法的具体步骤如下I. His-TMV-CP表达质粒的构建两条引物被用来扩增TMV外壳蛋白(WT-TMV-CP)，上游引物TMVCP F1,GATTCGTTTTACATATGTCTTACAGTATVACTAC，和下游引物 Hi s-TMV-CP Rl, TAGTACCATGGTCATTAGTGATGGTGATGGTGATGAGTTTGCAGGACCAGAGGTC，反应条件如下解链温度 95°C，30 秒，退火温度 55°C，30秒，延伸温度68°C，30秒，重复35个循环；PCR产物随后经NdeI和NcoI双酶切，使用T4DNA连接酶连接进入pET28a载体，将连接产物电转化进入XLlBlue菌株，涂于含有100 μ g/mL氨苄的LB琼脂平板上，37°C倒置孵育过夜，随后，挑取3个潜在的阳性克隆进行扩增，提取质粒DNA，并送测序，在其羧基端含有His标签的有确定DNA序列的His-TMV-CP质粒随后被亚克隆进原核表达菌株Rosetta中进行蛋白表达；
2. Hi s-TMV-CP 蛋白的表达 含有宿主质粒的Rosetta原核表达菌株在含有100 μ g/mL氨节抗生素和25 μ g/mL氯霉素的LB培养基中，在30°C，200rpm条件下持续震荡摇菌；具体步骤如下从LB琼脂平板上挑取单个克隆，接种于5mL培养基中，持续摇菌15小时至达到要求密度(从冻存的甘油保种菌液中挑菌，划线于LB琼脂平板，30°C倒置培养24小时)取ImL上述菌液培养基，接种于25mL培养基中，随后在30°C条件下持续震荡培养，至OD值达到O. 5，随后，上述菌液全部接种于500mL培养基中，30°C条件下持续震荡培养至OD值达到O. 5，在诱导表达前，菌液在25°C条件下孵育4分钟，取ImL菌液，离心，收取细菌保留以备进一步分析；在菌液中加入IPTG，至浓度达到10 μ Μ，随后，菌液在25°C，200rpm下震荡培养过夜，在收取全部菌液前，取I毫升菌液，离心，收取细菌，裂解，检测表达情况；收取全部菌液，15°C条件下，18000g离心10分钟，收取沉淀(细菌总量为5克)，将全部菌体重悬于15mL裂解缓冲液中(50mM磷酸钾，300mM氯化钾，PH值8. 0)，保存于_80°C，以备进一步纯化蛋白。采用SDS-PAGE分离细菌裂解液的方法评估蛋白表达情况，取ImL含有细菌的培养基，离心，去除上清，重悬于50mMKP缓冲液(磷酸钾缓冲液)中，-20°C冻存，实验时，加入2*SDS-PAGE (样品缓冲液，在90°C加热4分钟，每一孔样品最终OD值为O. 2 ;3. His-TMV-CP 蛋白的纯化来源于500mL培养基中的全部重悬细菌产物在常温下解冻，随后立即加入I. 5mLBug Buster试剂，30 μ L Lysonase，苯甲基磺酰氟(PMSF)终浓度为 ImM，5 μ L RNA酶，和5 μ LDNA酶，混合物在30°C，200rpm下震荡25分钟，加入30mL预冷的平衡缓冲液，充分混合，置冰上冰浴5分钟，以llOOOg，4°C离心15分钟，取上清，与3mL已经平衡缓冲液冲洗的镍树脂充分混合，4°C转动孵育过夜，随后上蛋白纯化柱进行纯化；上柱纯化蛋白时，首先使液体自然流出蛋白纯化柱，直至无液体流出，在随后的纯化阶段，按照恒定的O. 5mL/L的流速洗脱柱子，首先以50mL预冷缓冲液冲洗柱子，再以冲洗缓冲液-40冲洗柱子，最后，使用洗脱缓冲液来洗脱目标蛋白，保存于-20 V。实施例2一种烟草花叶病毒壳蛋白模板结构修饰方法，其壳蛋白模板结构修饰方法的具体步骤如下I. His-TMV-CP表达质粒的构建
两条引物被用来扩增TMV外壳蛋白(WT-TMV-CP)，上游引物TMVCP F1,GATTCGTTTTACATATGTCTTACAGTATVACTAC，和下游引物 Hi s-TMV-CP Rl，TAGTACCATGGTCATTAGTGATGGTGATGGTGATGAGTTTGCAGGACCAGAGGTC,反应条件如下解链温度 95°C，30 秒，退火温度 55°C，30秒，延伸温度68°C，30秒，重复35个循环；PCR产物随后经NdeI和NcoI双酶切，使用T4DNA连接酶连接进入pET28a载体，将连接产物电转化进入XLlBlue菌株，涂于含有100 μ g/mL氨苄的LB琼脂平板上，37°C倒置孵育过夜，随后，挑取3个潜在的阳性克隆进行扩增，提取质粒DNA，并送测序，在其羧基端含有His标签的有确定DNA序列的His-TMV-CP质粒随后被亚克隆进原核表达菌株Rosetta中进行蛋白表达。2. Hi s-TMV-CP 蛋白的表达含有宿主质粒的Rosetta原核表达菌株在含有100 μ g/mL氨节抗生素和25 μ g/mL氯霉素的LB培养基中，在30°C，250rpm条件下持续震荡摇菌；具体步骤如下从LB琼脂平板上挑取单个克隆，接种于5mL培养基中，持续摇菌17小时至达到要求密度(从冻存的甘油保种菌液中挑菌，划线于LB琼脂平板，30°C倒置培养24小时)取ImL上述菌液培养基，接种·于25mL培养基中，随后在30°C条件下持续震荡培养，至OD值达到O. 6，随后，上述菌液全部接种于500mL培养基中，30°C条件下持续震荡培养至OD值达到O. 6，在诱导表达前，菌液在25°C条件下孵育5分钟，取ImL菌液，离心，收取细菌保留以备进一步分析；在菌液中加入IPTG，至浓度达到10 μ Μ，随后，菌液在25°C，300rpm下震荡培养过夜，在收取全部菌液前，取I毫升菌液，离心，收取细菌，裂解，检测表达情况。收取全部菌液，15°C条件下，15000g离心15分钟，收取沉淀(细菌总量为5克)，将全部菌体重悬于15mL裂解缓冲液中(50mM磷酸钾，300mM氯化钾，PH值8. 0)，保存于_80°C，以备进一步纯化蛋白；采用SDS-PAGE分离细菌裂解液的方法评估蛋白表达情况，取ImL含有细菌的培养基，离心，去除上清，重悬于50mMKP缓冲液中，_20°C冻存，实验时，加入2*SDS-PAGE (两倍的SDS-PAGE)样品缓冲液，在90°C加热5分钟，每一孔样品最终OD值为O. 2。3. His-TMV-CP 蛋白的纯化来源于500mL培养基中的全部重悬细菌产物在常温下解冻，随后立即加入I. 5mLBug Buster 试剂，30 μ L Lysonase, PMSF 终浓度为 ImM，5 μ L RNA 酶，和 5 μ L DNA 酶，混合物在30°C，250rpm下震荡20分钟，加入30mL预冷的平衡缓冲液，充分混合，置冰上冰浴5分钟，以llOOOg，4°C离心18分钟，取上清，与3mL已经平衡缓冲液冲洗的镍树脂充分混合，4°C转动孵育过夜，随后上蛋白纯化柱进行纯化；上柱纯化蛋白时，首先使液体自然流出蛋白纯化柱，直至无液体流出，在随后的纯化阶段，按照恒定的O. 5mL/L的流速洗脱柱子，首先以50mL预冷缓冲液冲洗柱子，再以冲洗缓冲液-40冲洗柱子，最后，使用洗脱缓冲液来洗脱目标蛋白，保存于_20 C。实施例3—种烟草花叶病毒壳蛋白模板结构修饰方法，其壳蛋白模板结构修饰方法的具体步骤如下I. His-TMV-CP表达质粒的构建两条引物被用来扩增TMV外壳蛋白(WT-TMV-CP)，上游引物TMVCP F1,GATTCGTTTTACATATGTCTTACAGTATVACTAC，和下游引物 Hi s-TMV-CP Rl，TAGTACCATGGTCATTAGTGATGGTGATGGTGATGAGTTTGCAGGACCAGAGGTC,反应条件如下解链温度 95°C，30 秒，退火温度 55°C，30秒，延伸温度68°C，30秒，重复35个循环；PCR产物随后经NdeI和NcoI双酶切，使用T4DNA连接酶连接进入pET28a载体，将连接产物电转化进入XLlBlue菌株，涂于含有100 μ g/mL氨苄的LB琼脂平板上，37°C倒置孵育过夜，随后，挑取3个潜在的阳性克隆进行扩增，提取质粒DNA，并送测序，在其羧基端含有His标签的有确定DNA序列的His-TMV-CP质粒随后被亚克隆进原核表达菌株Rosetta中进行蛋白表达；2. Hi s-TMV-CP 蛋白的表达含有宿主质粒的Rosetta原核表达菌株在含有100 μ g/mL氨节抗生素和 25 μ g/mL氯霉素的LB培养基中，在30°C，300rpm条件下持续震荡摇菌；具体步骤如下从LB琼脂平板上挑取单个克隆，接种于5mL培养基中，持续摇菌18小时至达到要求密度(从冻存的甘油保种菌液中挑菌，划线于LB琼脂平板，30°C倒置培养24小时)取ImL上述菌液培养基，接种于25mL培养基中，随后在30°C条件下持续震荡培养，至OD值达到O. 5，随后，上述菌液全部接种于500mL培养基中，30°C条件下持续震荡培养至OD值达到O. 6，在诱导表达前，菌液在25°C条件下孵育6分钟，取ImL菌液，离心，收取细菌保留以备进一步分析；在菌液中加入IPTG，至浓度达到10 μ Μ，随后，菌液在25°C，300rpm下震荡培养过夜，在收取全部菌液前，取I毫升菌液，离心，收取细菌，裂解，检测表达情况；收取全部菌液，15°C条件下，16000g离心12分钟，收取沉淀(细菌总量为5克)，将全部菌体重悬于15mL裂解缓冲液中(50mM磷酸钾，300mM氯化钾，PH值8. 0)，保存于_80°C，以备进一步纯化蛋白。采用SDS-PAGE分离细菌裂解液的方法评估蛋白表达情况，取ImL含有细菌的培养基，离心，去除上清，重悬于50mMKP缓冲液中，_20°C冻存，实验时，加入2*SDS-PAGE样品缓冲液，在90°C加热6分钟，每一孔样品最终OD值为0.2。3. His-TMV-CP 蛋白的纯化来源于500mL培养基中的全部重悬细菌产物在常温下解冻，随后立即加入I. 5mLBug Buster 试剂，30 μ L Lysonase, PMSF 终浓度为 ImM，5 μ L RNA 酶，和 5 μ L DNA 酶，混合物在30°C，300rpm下震荡40分钟，加入30mL预冷的平衡缓冲液，充分混合，置冰上冰浴6分钟，以12000g，4°C离心17分钟，取上清，与3mL已经平衡缓冲液冲洗的镍树脂充分混合，4°C转动孵育过夜，随后上蛋白纯化柱进行纯化；上柱纯化蛋白时，首先使液体自然流出蛋白纯化柱，直至无液体流出，在随后的纯化阶段，按照恒定的O. 5mL/L的流速洗脱柱子，首先以50mL预冷缓冲液冲洗柱子，再以冲洗缓冲液-40冲洗柱子，最后，使用洗脱缓冲液来洗脱目标蛋白，保存于_20 C。实施例4一种烟草花叶病毒壳蛋白模板结构修饰方法，其壳蛋白模板结构修饰方法的具体步骤如下I. His-TMV-CP表达质粒的构建两条引物被用来扩增TMV外壳蛋白(WT-TMV-CP)，上游引物TMVCP Fl, GATTCGTTTTACATATGTCTTACAGTATVACTAC，和下游引物 Hi s-TMV-CP Rl，TAGTACCATGGTCATTAGTGATGGTGATGGTGATGAGTTTGCAGGACCAGAGGTC,反应条件如下解链温度 95°C，30 秒，退火温度 55°C，30秒，延伸温度68°C，30秒，重复35个循环；CR产物随后经NdeI和NcoI双酶切，使用T4DNA连接酶连接进入pET28a载体，将连接产物电转化进入XLlBlue菌株，涂于含有100 μ g/mL氨苄的LB琼脂平板上，37°C倒置孵育过夜，随后，挑取3个潜在的阳性克隆进行扩增，提取质粒DNA，并送测序，在其羧基端含有His标签的含有确定DNA序列的His-TMV_CP-2质粒随后被亚克隆进原核表达菌株Rosetta中进行蛋白表达。2. Hi s-TMV-CP 蛋白的表达含有宿主质粒的Rosetta原核表达菌株在含有100 μ g/mL氨节抗生素和25 μ g/mL氯霉素的LB培养基中，在30°C，250rpm条件下持续震荡摇菌；具体步骤如下从LB琼脂平板上挑取单个克隆，接种于5mL培养基中，持续摇菌16小时至达到要求密度(从冻存的甘油保种菌液中挑菌，划线于LB琼脂平板，30°C倒置培养24小时)取ImL上述菌液培养基，接种于25mL培养基中，随后在30°C条件下持续震荡培养，至OD值达到O. 5，随后，上述菌液全部接种于500mL培养基中，30°C条件下持续震荡培养至OD值达到O. 6，在诱导表达前，菌液在25°C条件下孵育5分钟，取ImL菌液，离心，收取细菌保留以备进一步分析。在菌液中加入IPTG，至浓度达到10 μ Μ，随后，菌液在25°C，250rpm下震荡培养过夜，在收取全部菌液前，取I毫升菌液，离心，收取细菌，裂解，检测表达情况；收取全部菌液，15°C条件下，17000g离心14分钟，收取沉淀(细菌总量为5克)，将全部菌体重悬于15mL裂解缓冲液中(50mM磷酸钾，300mM氯化钾，PH值8. 0)，保存于_80°C，以备进一步纯化蛋白；采用SDS-PAGE分离细菌 裂解液的方法评估蛋白表达情况，取ImL含有细菌的培养基，离心，去除上清，重悬于50mMKP缓冲液中，_20°C冻存，实验时，加入2*SDS-PAGE样品缓冲液，煮样5分钟，每一孔样品最终OD值为O. 2。3. His-TMV-CP 蛋白的纯化来源于500mL培养基中的全部重悬细菌产物在常温下解冻，随后立即加入I. 5mLBugBuster 试剂，30 μ L Lysonase 试剂，PMSF 终浓度为 ImM，5uL RNA 酶，和 5 μ L DNA 酶，混合物在30°C，250rpm下震荡30分钟，加入30mL预冷的平衡缓冲液，充分混合，置冰上冰浴5分钟，以13000g，4°C离心20分钟，取上清，与3mL已经平衡缓冲液冲洗的镍树脂充分混合，4°C转动孵育过夜，随后上蛋白纯化柱进行纯化；上柱纯化蛋白时，首先使液体自然流出蛋白纯化柱，直至无液体流出，在随后的纯化阶段，按照恒定的O. 5mL/L的流速洗脱柱子，首先以50mL预冷缓冲液冲洗柱子随后，再以冲洗缓冲液-40冲洗柱子，最后，使用洗脱缓冲液来洗脱目标蛋白，保存于-20 V。
权利要求
1.一种烟草花叶病毒壳蛋白模板结构修饰方法，其特征在于主要通过对HiS-TMV-CP表达质粒的构建、蛋白的表达及纯化的方法进行结构的修饰。
2.根据权利要求I所述的烟草花叶病毒模板结构修饰方法，其特征在于所述的壳蛋白模板结构修饰方法的具体步骤如下 DHis-TMV-CP表达质粒的构建 设计上游弓I物TMVCP FI，和下游引物Hi s-TMV-CP Rl，两条引物被用来PCR扩增TMV外壳蛋白，PCR产物随后经NdeI和NcoI双酶切，使用T4DNA连接酶连接进入pET28a载体，将连接产物电转化进入XLlBlue菌株，涂于LB琼脂平板上；然后挑取潜在的阳性克隆进行扩增，提取质粒DNA，并送测序，在其羧基端含有His标签的有确定DNA序列的His-TMV-CP质粒，随后被亚克隆进原核表达菌株Rosetta中进行蛋白表达； 2) Hi s-TMV-CP蛋白的表达 将含有宿主质粒的Rosetta原核表达菌株,置于含有100ug/mL氨节抗生素和25ug/mL氯霉素的LB培养基中，持续震荡摇菌直至OD值达到O. 5-0. 6，在诱导表达前，菌液在25°C条件下孵育4-6分钟，取ImL菌液，离心，收取细菌保留以备进一步分析；然后加入诱导剂IPTG至浓度达到10 μ Μ,而后以SDS-PAGE分离细菌裂解液的方法评估蛋白表达情况，待蛋白表达达到最大值，收取全部菌液，将其重悬于裂解缓冲液中，低温保存，以备进一步纯化蛋白； 3) Hi s-TMV-CP蛋白的纯化 将重悬细菌产物在常温下解冻后，立即加入I. 5ml Buster试剂、30ul Lysonase试剂、5ml RNA酶和5ml DNA酶，在ImM的苯甲基磺酰氟浓度下将上述混合物在30°C，250rpm下震荡20-40分钟，加入30mL预冷的平衡缓冲液，冰浴4_6分钟，以11000_13000g，4°C离心15-20分钟，取上清与3mL已经平衡缓冲液冲洗的镍树脂充分混合，4°C转动孵育过夜，随后上蛋白纯化柱进行纯化；上柱纯化时，首先使液体自然流出蛋白纯化柱，直至无液体流出，在随后的纯化阶段，按照恒定的O. 5mL/L的流速洗脱柱子，然后分别以预冷缓冲液、冲洗缓冲液冲洗柱子，最后使用洗脱缓冲液来洗脱目标蛋白，保存于_20°C。
3.根据权利要求I或2的修饰方法，其特征在于所述的步骤I)中两条引物分别是上游引物 TMVCP Fl, GATTCGTTTTACATATGTCTTACAGTATVACTAC，和下游引物 His-TMV-CP Rl,TAGTACCATGGTCATTAGTGATGGTGATGGTGATGAGTTTGCAGGACCAGAGGTCo
4.根据权利要求I或2的修饰方法，其特征在于所述的步骤I)中PCR产物扩增的反应条件是解链温度95°C，30秒，退火温度55°C，30秒，延伸温度68°C，30秒，重复35个循环。
5.根据权利要求I或2的修饰方法，其特征在于所述的步骤3)中预冷缓冲液为50mM磷酸钾，300mM氯化钾，ImM PMSF, IOmM β -巯基乙醇，IOmM咪唑，10%乙醇，PH值8. O ;冲洗缓冲液为50mM磷酸钾，300mM氯化钾，ImM PMSF, IOmM β -巯基乙醇，40mM咪唑，10%乙醇，PH值8.O ;洗脱缓冲液为50mM磷酸钾，300mM氯化钾，ImM PMSF，IOmM β -巯基乙醇，500mM咪唑，10% 乙醇，PH 值 8. O。
全文摘要
本发明涉及了一种烟草花叶病毒壳蛋白模板结构修饰方法，其主要通过对His-TMV-CP表达质粒的构建、蛋白的表达及纯化的方法进行结构的修饰。烟草花叶病毒是一种典型的具有一维纳米结构的模板材料，本发明用分子生物学的方法，将His标签引入到TMV-CP中，His标签之间以及His标签与TMV-CP之间的强相互作用，改善TMV-CP的结构均一性，使得TMV-CP在介质较大的pH值、温度以及离子强度范围内，保持结构的稳定以及连续性，进而改善TMV-CP作为模板材料的适用性。
文档编号C12N15/70GK102899346SQ20121033622
公开日2013年1月30日 申请日期2012年9月12日 优先权日2012年9月12日
发明者刘楠, 张洪非, 侯宏卫, 李中皓, 唐纲岭, 陈再根, 姜兴益, 李雪, 陈欢, 胡清源 申请人:国家烟草质量监督检验中心