鉴定烟草花叶病毒种属的方法及其专用条形码引物的制作方法
【专利摘要】本发明公开了鉴定烟草花叶病毒种属的方法及其专用条形码引物。本发明所提供的条形码引物组，由Tobamo?F6和Tobamo?R6组成。实验证明，使用本发明所提供的引物组，在表现症状的样品中可100％扩增到烟草花叶病毒属病毒，测序成功率为100％；能够有效对该属内的病毒进行物种鉴定。可在进境植物及其产品检疫中应用，防止病毒的传入；也可在国内的植保植检站、科研院所、农业生产企业及农户中大范围推广应用。
【专利说明】鉴定烟草花叶病毒种属的方法及其专用条形码引物
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，尤其涉及一种鉴定烟草花叶病毒种属的方法及其专用条形码引物。
【背景技术】
[0002]烟草花叶病毒属(Tobamovirus)为芜菁黄花叶病毒目(Tymovirales)帚状病毒科(Virgaviridae)成员；根据国际病毒分类委员会(International CommitteeonTaxonomy of Viruses，ICTV)于2012年发布的最新病毒分类第九次报告，该病毒属包含了曼陀罗轻斑驳病毒(Brugmansia mild mottle virus，BrMMV)、黄瓜果实斑驳花叶病毒(Cucumber fruit mottle mosaic virus，CFMMV)、黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber greenmottle mosaic virus，CGMMV)、鸡蛋花花叶病毒(Frangipani mosaic virus，FrMV)、木權潜伏皮尔斯堡病毒(Hibiscus latent Fort Pierce virus，HLFPV)、木權潜伏新加坡病毒(Hibiscus latent Singapore virus，HLSV)、Kyuri 绿斑驳花叶病毒(Kyuri greenmottle mosaic virus，KGMMV)、老布达辣椒病毒(Obuda pepper virus，ObPV)、齿兰环斑病毒(Odontoglossum ringspot virus，ORSV)、菜椒轻斑驳病毒(Paprika mild mottlevirus，PaMMV)、 辣椒轻斑驳病毒(Pepper mild mottle virus，PMMoV)、地黄花叶病毒(Rehmannia mosaic virus，RheMV)、长叶车前草花叶病毒(Ribgrass mosaic virus，RMV)、萨蒙氏仙人掌病毒(Sammons’s Opuntia virus，SOV)、堇兰花裂病毒(Streptocarpusflower break virus，SFBV)、菽麻花叶病毒(Sunn-hemp mosaic virus，SHMV)、烟草轻型绿花叶病毒(Tobacco mild green mosaic virus，TMGMV)、烟草花叶病毒(Tobaccomosaic virus, TMV)、番煎花叶病毒(Tomato mosaic virus, ToMV)、宪蕾脉明病毒(Turnip vein-clearing virus, TVCV)块根落葵轻型斑驳病毒(Ullucus mild mottlevirus，UMMV)、山葵斑驳病毒(Wasabi mottle virus，WMoV)、油菜花叶病毒(Youcai mosaicvirus，YMoV)、小西葫芦绿斑驳花叶(Zucchini green mottle mosaic virus, ZGMMV)等25个确定病毒种以及苘麻黄花叶病毒(Abutilon yellow mosaic virus，AbYMV)、甜椒斑驳病毒(Bell pepper mottle virus，BPMoV)、仙人掌轻斑驳病毒(Cactus mildmottle virus，CMMoV)、黄瓜斑驳病毒(Cucumber mottle virus，CuMoV)、鸡蛋果花叶病毒(Maracuja mosaic virus, MarMV)及 Tropical soda apple mosaic virus (TSAMV)等 6 个暂定种。同时，该属内新的病毒种类还有增加的趋势；而且该属病毒的寄主范围相当广泛，给农业生产带来重大损失；因此，加强对该属病毒的检测鉴定具有重要意义。国内外研究人员釆用了多种方法如直接观测法、电镜法、生物学测定法、血清学检测和分子生物学检测法等对该属病毒的检测鉴定做了大量的研究。随着各地植物种质资源的引进交流和栽培条件的改变，对该属病毒的检测鉴定方法也提出了更高的要求。
[0003]生物条形码技术是近年来出现的一种新的生物物种检测鉴定技术，由加拿大Guelph大学的分类学家Paul Hebert在2003年首次提出，其在物种标准化鉴定方面的优势已备受关注。线粒体细胞色素C氧化酶亚基I (COI)基因作为动物的DNA条形码已广泛应用于物种鉴定中；在植物上已选定叶绿体rbcl和matK基因作为基本的DNA条形码；真菌学家正对真菌类群进行不同基因片段的筛选与评价，以ITS作为真菌的首选DNA条形码。条形码技术是分类学中辅助物种鉴定的新技术，它代表了生物分类学研究的一个新方向，为进出境检验检疫提供了一种简单而有效的方法。在植物病毒方面，尚未有开展生物条形码技术的研究。
【发明内容】
[0004]本发明的一个目的是提供鉴定烟草花叶病毒种属的条形码引物组。
[0005]本发明提供的鉴定烟草花叶病毒种属的条形码引物组，其由引物Tobamo F6和引物Tobamo R6组成；所述引物Tobamo F6的核苷酸序列为序列表中序列I,所述引物TobamoR6的核苷酸序列为序列表中序列2。
[0006]本发明的另一个目的是提供鉴定烟草花叶病毒种属的PCR试剂。
[0007]本发明提供的PCR试剂，由上述的条形码引物组、PCR扩增缓冲液和水组成，所述条形码引物组 中的引物Tobamo F6和引物Tobamo R6在所述PCR试剂中的终浓度均为
0.5 μ M。
[0008]本发明的第3个目的是提供鉴定烟草花叶病毒种属的PCR试剂盒。
[0009]本发明提供的试剂盒，包括上述的条形码引物组或上述的PCR试剂。
[0010]上述的引物组或PCR试剂或PCR试剂盒中，所述烟草花叶病毒属病毒为辣椒轻斑驳病毒、黄瓜绿斑驳花叶病毒、烟草花叶病毒或番爺花叶病毒。
[0011 ] 上述的引物组或PCR试剂或PCR试剂盒在鉴定待测烟草花叶病毒种属中的应用也是本发明保护的范围。
[0012]上述的引物组或PCR试剂或PCR试剂盒在制备鉴定待测烟草花叶病毒种属产品中的应用也是本发明保护的范围。
[0013]本发明第4个目的是提供鉴定或辅助鉴定待测烟草花叶病毒的种属的方法。
[0014]本发明提供的方法，包括如下步骤:
[0015]I)提取感染待测烟草花叶病毒属病毒的样本的总RNA，反转录得到cDNA作为模板，用上述的引物组进行PCR扩增，得到190-210bp PCR扩增产物；
[0016]2)将所述190_210bp PCR扩增产物测序，得到产物序列，将其与Genbank数据库记载的所有烟草花叶病毒属代表种的核苷酸序列构建系统进化树，不同种的序列聚为一簇，观察PCR产物对应的序列与该属哪些种的序列聚为一簇，则待测烟草花叶病毒属病毒为或候选为烟草花叶病毒属病毒的对应种。
[0017]上述方法中，所述PCR扩增的退火温度为50°C。
[0018]上述方法中，所述样本为植物，所述植物具体为西瓜、辣椒、南瓜、番茄、芸豆、烟草或黄瓜。
[0019]在上述应用或方法中，所述待测样品可为植物样品或微生物样品。在本发明的一个实施例中，所述待测样品具体为感染了辣椒轻斑驳病毒的辣椒和南瓜叶片、感染了烟草花叶病毒的烟草和黄瓜叶片、感染了番茄花叶病毒的番茄和芸豆叶片、感染了黄瓜绿斑驳花叶病毒的西瓜叶片。
[0020]在上述应用或方法中，所述烟草花叶病毒属病毒为辣椒轻斑驳病毒、黄瓜绿斑驳花叶病毒、烟草花叶病毒或番爺花叶病毒。
[0021 ] 本发明的实验证明，使用本发明所提供的引物组Tobamo F6和Tobamo R6,在表现症状的样品中可100%扩增到烟早花叶病毒属病毒,测序成功率为100% ;能够有效对该属内的病毒进行物种鉴定。可在进境植物及其产品检疫中应用，防止病毒的传入；也可在国内的植保植检站、科研院所、农业生产企业及农户中大范围推广应用。
【专利附图】
【附图说明】
[0022]图1为烟草花叶病毒属条形码引物组扩增产物电泳结果
[0023]图2为烟草花叶病毒属条形码序列构建的系统进化树
[0024]图3为烟草花叶病毒属条形码引物组扩增灵敏度电泳结果
【具体实施方式】
[0025]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0026]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0027]实施例1、用于鉴定烟草花叶病毒属中病毒种的条形码引物组的合成
[0028]以Genba nk中烟草花叶病毒属22种病毒的代表种作为病毒的凭证标本，分析其序列保守区域，根据条形码引物设计的条件即扩增片段长度、扩增片段种内的保守性和种间的变异性设计并人工合成引物组Tobamo F6和Tobamo R6,用于鉴定烟草花叶病毒属病毒种属，条形码引物组扩增产物长度为200bp。
[0029]Tobamo F6的核苷酸序列为序列表中的序列I，Tobamo R6的核苷酸序列为序列表中国的序列2。
[0030]实施例2、条形码引物组鉴定烟草花叶病毒属的病毒种[0031 ] 一、条形码引物组鉴定烟草花叶病毒属的病毒种
[0032]为了验证实施例1制备的用于鉴定烟草花叶病毒属病毒的条形码引物组的通用性，本实施例选择来自花叶症状明显的西瓜、辣椒、南瓜、番茄、芸豆、烟草及黄瓜样品中的4种烟草花叶病毒属病毒(辣椒轻斑驳病毒、黄瓜绿斑驳花叶病毒、烟草花叶病毒和番爺花叶病毒)进行评价。
[0033]辣椒轻斑驳病毒(Pepper mild mottle virus):记载在“辣椒种子中辣椒轻斑驳病毒的检测.安徽农业科学，2007，35 (14):4228-4229.”一文上，公众可从中国检验检疫科
学研究院获得。
[0034]黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumbergreen mottle mosaic virus):记载在“Occurrence of Cucumber green mottle mosaic virus on Cucurbitaceous Plants inChina.Plant disease, 2009,93(2):200.” 一文上，公众可从中国检验检疫科学研究院获得。
[0035]烟草花叶病毒(Tobaccomosaic virus):记载在“Oligonucleotide microarraywith a minimal number of probes for the detection and identification of thirteengenera of plant viruses.Journal of Virological Methods.2010, 167:53-60.，，一文上，公众可从中国检验检疫科学研究院获得。
[0036]番爺花叶病毒(Tomato mosaic virus):记载在“进境番爺种子中番爺花叶病毒的检测与鉴定.植物保护，2011,37(5):124-128.” 一文上，公众可从中国检验检疫科学研究
院获得。
[0037]1、RT-PCR 扩增
[0038]按照总RNA提取试剂盒(原平皓生物公司产品，货号:HF103-01)步骤分别提取番茄3号(感染番茄花叶病毒)、番茄11号(感染番茄花叶病毒)、番茄12号(感染番茄花叶病毒)，芸豆3号(感染番茄花叶病毒)，南瓜I号(感染辣椒轻斑驳病毒)，南瓜2号(感染辣椒轻斑驳病毒)，辣椒I号(感染辣椒轻斑驳病毒)，辣椒3号(感染辣椒轻斑驳病毒)，烟草3号(感染烟草花叶病毒)，黄瓜I号(感染烟草花叶病毒)，黄瓜2号(感染烟草花叶病毒)，西瓜I号(感染黄瓜绿斑驳花叶病毒)叶片的总RNA。测定浓度后，以总RNA为模板，按照Transcriptor cDNA Synth.试剂盒(罗氏公司产品，货号:4896866001)说明进行第一链cDNA合成。以合成的cDNA为模板,分别使用实施例1的Tobamo F6和TobamoR6引物，根据PCR master mix试剂盒(MBI公司产品，货号:K0171)说明进行PCR扩增。
[0039]上述每20 μ L 的 PCR 扩增体系由 Tobamo F6>Tobamo R6 引物、PCR master mix 和水组成，其中，Tobamo F6在PCR扩增体系中的终浓度为0.5 μ M，Tobamo R6在PCR扩增体系中的终浓度为0.5 μ Μ。
[0040]反应条件为94°C 5min ；94°C 30s, 50°C 30s, 72°C lmin, 35 循环；72°C lOmin。扩增产物经I %琼脂糖电泳检测后进行测序。
[0041]结果 如图1所示，其中，M为DL2000 ;泳道1-12分别为:番茄3号，番茄11号，番爺12号，芸豆3号，南瓜I号，南瓜2号，辣椒I号，辣椒3号，烟草3号，黄瓜I号，黄瓜2号，西瓜I号，可以看出，条形码引物组可在所有测试样品中均扩增出一条清晰的200bp左右的条带，扩增效率为100%。
[0042]将所有条带均进行测序，均可获得有效的序列(序列3-序列14)，测序成功率为100%:
[0043]感染番茄花叶病毒的番茄3号扩增得到PCR产物的核苷酸序列为序列表中序列10 ；
[0044]感染番茄花叶病毒的番茄11号扩增得到PCR产物的核苷酸序列为序列表中序列11;
[0045]感染番茄花叶病毒的番茄12号扩增得到PCR产物的核苷酸序列为序列表中序列12 ；
[0046]感染番茄花叶病毒的芸豆3号扩增得到PCR产物的核苷酸序列为序列表中序列13 ；
[0047]感染辣椒轻斑驳病毒的南瓜I号扩增得到PCR产物的核苷酸序列为序列表中序列
3；
[0048]感染辣椒轻斑驳病毒的南瓜2号扩增得到PCR产物的核苷酸序列为序列表中序列
4；
[0049]感染辣椒轻斑驳病毒的辣椒I号扩增得到PCR产物的核苷酸序列为序列表中序列
5；
[0050]感染辣椒轻斑驳病毒的辣椒3号扩增得到PCR产物的核苷酸序列为序列表中序列
6；[0051]感染烟草花叶病毒的烟草3号扩增得到PCR产物的核苷酸序列为序列表中序列
7；
[0052]感染烟草花叶病毒的黄瓜I号扩增得到PCR产物的核苷酸序列为序列表中序列
8；
[0053]感染烟草花叶病毒的黄瓜2号扩增得到PCR产物的核苷酸序列为序列表中序列9 ；
[0054]感染黄瓜绿斑驳花叶病毒的西瓜I号扩增得到PCR产物的核苷酸序列为序列表中序列14。
[0055]2、序列分析
[0056]米用Kimura-2-parameter distance (K2P)模型计算序列3-14的种内和种间遗传距离，评价其物种分 辨率。
[0057]用DNAMAN(version4.0)软件将Genbank数据库中的烟草花叶病毒属22个病毒代表种的基因序列(2014.4.11的Genbank数据库)与序列3_14构建系统进化树，不同种的
序列聚为一簇。
[0058]结果如图2所示，可以看出，条形码引物组在辣椒和南瓜样品中扩增到的4个辣椒轻斑驳病毒分尚物(PMMoV-SDI (序列3) -SD3 (序列4) -SD8 (序列5) -SD9 (序列6))与代表分离物-S(Genbank号为NC_003630)聚为PMMoV簇，为辣椒轻斑驳病毒；在西瓜中扩增到的黄瓜绿斑驳花叶病毒分离物(CGMMV-SD，序列14)与其代表分离物-SH(Genbank号为NC_001801)聚为CGMMV簇，为黄瓜绿斑驳花叶病毒；在烟草和黄瓜上检测到的三个烟草花叶病毒分离物01^-503(序列7)，-504(序列8)，-505(序列9))与其代表分离物-1 (Genbank号为NC_001367)聚为TMV簇，为烟草花叶病毒；而番茄和芸豆上的4个番茄花叶病毒分离物(ToMV-SDl (序列10)，-SD2 (序列11)，-SD3 (序列12)，-SD4 (序列13))与其代表分离物-QLD (Genbank号为NC_002692)聚为ToMV簇，为番茄花叶病毒；同时这四个簇与其它病毒种都明显区分开。
[0059]上述结果表明，Tobamo6引物组可以通过聚类鉴定待测烟草花叶病毒属病毒是否为同一个病毒种；说明该对条码引物在烟草花叶病毒属中具有良好的物种分辨率。
[0060]二、用于鉴定烟草花叶病毒属病毒的条形码引物组的灵敏度评价
[0061]本实施例对实施例1制备的用于鉴定烟草花叶病毒属病毒的条形码引物组的灵敏度进行了分析。具体如下:将总RNA进行10倍比稀释，分别以IO1~IO6共六个稀释度的总RNA为模板，按照实施例2的步骤进行RT-PCR扩增，扩增产物进行电泳。
[0062]结果如图3所示，M:Marker DL2000 ;1~6:分别为IO1~IO6稀释。可以看出，IO1~IO4稀释模板均得到200bp的产物，表明该引物组可检测到待检对象IO4稀释倍数；表明实施例1制备的用于鉴定烟草花叶病毒属病毒的条形码引物组具有良好的灵敏度。
【权利要求】
1.鉴定烟草花叶病毒种属的条形码引物组，其由引物TobamoF6和引物Tobamo R6组成；所述引物Tobamo F6的核苷酸序列为序列表中序列1，所述引物Tobamo R6的核苷酸序列为序列表中序列2。
2.鉴定烟草花叶病毒种属的PCR试剂，由权利要求1所述的条形码引物组、PCR扩增缓冲液和水组成，所述条形码引物组中的引物Tobamo F6和引物Tobamo R6在所述PCR试剂中的终浓度均为0.5 μ M。
3.鉴定烟草花叶病毒种属的PCR试剂盒，包括权利要求1所述的条形码引物组或权利要求2所述的PCR试剂。
4.根据权利要求1-3中任一所述的引物组或PCR试剂或PCR试剂盒，其特征在于:所述烟草花叶病毒属病毒为辣椒轻斑驳病毒、黄瓜绿斑驳花叶病毒、烟草花叶病毒或番爺花叶病毒。
5.权利要求1-3中任一所述的引物组或PCR试剂或PCR试剂盒在鉴定待测烟草花叶病毒种属中的应用。
6.权利要求1-3中任一所述的引物组或PCR试剂或PCR试剂盒在制备鉴定待测烟草花叶病毒种属产品中的应用。
7.鉴定或辅助鉴定待测烟草花叶病毒的种属的方法，包括如下步骤: 1)提取感染待测烟草花叶病毒的样本的总RNA，反 转录得到cDNA作为模板，用权利要求1-3中任一所述的引物组进行RT-PCR扩增，得到190-210bp PCR扩增产物； 2)将所述190-210bpPCR扩增产物测序，得到产物序列，将其与Genbank数据库记载的所有烟草花叶病毒属代表种的核苷酸序列构建系统进化树，不同种的序列聚为一簇，观察PCR产物对应的序列与该属哪些种的序列聚为一簇，则待测烟草花叶病毒属病毒为或候选为烟草花叶病毒属病毒的对应种。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于:所述RT-PCR扩增的退火温度为50°C。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于:所述样本为植物，所述植物具体为西瓜、辣椒、南瓜、番茄、芸豆、烟草或黄瓜。
10.根据权利要求7-9中任一所述的方法，其特征在于: 所述烟草花叶病毒属病毒为辣椒轻斑驳病毒、黄瓜绿斑驳花叶病毒、烟草花叶病毒或番爺花叶病毒。
【文档编号】C12R1/94GK103966361SQ201410193595
【公开日】2014年8月6日 申请日期:2014年5月8日 优先权日:2014年5月8日
【发明者】张永江, 马荣群, 辛言言, 马洁 申请人:中国检验检疫科学研究院