检测烟草轻型绿花叶病毒的rt-pcr引物及其方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种检测烟草轻型绿花叶病毒的RT-PCR引物及其方法，具体而言，涉 及一种特异性检测茄科植物中烟草轻型绿花叶病毒的RT-PCR引物及其检测方法。
【背景技术】
[0002] 烟草轻型绿花叶病毒(Tobacco mild green mosaic virus，TMGMV)是烟草花叶病 毒属(Tobamovirus)成员之一，是近年来在辣椒上发生和危害报道较多的病毒之一，主要侵 染辣椒外，番茄和茄子等重要茄科蔬菜都是TMGMV的自然寄主，该病毒传入和扩散风险较 尚。
[0003] 烟草轻型绿花叶病毒(TMGMV)烟草花叶病毒的成员之一，是一种单链RNA，单链RNA 基因组的病毒。目前，尚未有专门检测TMGMV的专利报导，譬如酶联免疫吸附法以及实时荧 光RT-PCR等分子生物学检测方法并未见报导。这对TMGMV的检测来说，是一个重大的缺失， 必然对辣椒感染TMGMV的诊断及及时防控带来负面的影响。而辣椒上TMGMV的发生一般伴随 着其他病毒（比如11^、01^、881￥、？￥￥等）的混合感染，而且11?^^侵染发生的某些症状和其 它病毒病的感染症状类似，因此很难简单地从症状上进行区别鉴定；同时，在实验室条件下 利用显微技术对病毒粒子进行形态观察并不能做到有效精准的判断。在这种形势下，建立 一种快速、准确的检测茄科植物如辣椒中TMGMV的PCR方法是非常有必要的，而在这个方法 中最关键的是找到针对TMGMV的特异性高的PCR引物。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的技术问题是，针对上述现有技术的不足，提供一种检测烟草轻 型绿花叶病毒的RT-PCR引物及其方法，利用本发明所述引物及方法能够更加快速、更加准 确地直接检测出茄科植物是否存在烟草轻型绿花叶病毒。
[0005] 为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种检测烟草轻型绿花叶病毒 的RT-PCR引物，其正向引物TMGMV-F序列为TACTTATCTTCCGCTTACGCAG，如SEQ ID No. 1 所示， 反向引物TMGMV-R序列为GCATCGTCTACCCTCTGAGT，如SEQIDNo.2所示。
[0006] 本发明同时提供一种检测烟草轻型绿花叶病毒的RT-PCR的方法，该方法是提取待 测样品总RNA，利用上述的引物进行RT-PCR扩增，然后对扩增产物进行电泳鉴定，如果扩增 产物大小为317bp，则判断该待测样品存在烟草轻型绿花叶病毒。
[0007] 所述待测样品为茄科植物。更具体地，所述待测样品是茄科植物组织。
[0008] 本发明设计的上述特异性引物是根据GenBank发布的TMGMV核苷酸序列的高保守 区所设计，特异性好;利用此引物采用RT-PCR方法，能准确判断茄科植物中是否存在烟草轻 型绿花叶病毒。本发明的检测方法适用于批量作物TMGMV的分子检测，在降低了检测成本、 减少了工作量的同时，保留了快速、准确、灵敏度高等优势。
【附图说明】
[0009] 图1是通过Primer-BLAST对本发明的正向引物TMGMV-F及反向引物TMGMV-R检测其 特异性的结果图。
[0010] 图2是本发明引物对扩增的序列片段的琼脂糖凝胶电泳图。
[0011]图中，各泳道从左到右依次为DNA marker、携带TMGMV的辣椒叶片、健康的辣椒叶 片。
[0012]图3是利用本发明特异性引物对茄科植物植株样品检测的琼脂糖凝胶电泳图。 [0013]图中，各泳道从左到右依次为DNA marker、感染TMGMV的辣椒、感染烟草花叶病毒 (Tobaccomosaic virus，TMV)的烟草、感染马铃薯Y病毒的（Potato virus Y，PVY)的烟草、 未感染TMGMV的辣椒。
【具体实施方式】
[0014] 下面通过【具体实施方式】的详细描述来进一步阐明本发明，但并不对本发明做任何 限制。
[0015] 实施例1
[0016] 1、引物设计
[0017] 利用病毒外壳蛋白（CP)基因核苷酸序列进化的保守性，从NCBI搜索并下载烟草轻 型绿花叶病毒及其相近病毒的CP基因核苷酸序列，运用MEGA5.0软件对这些序列进行比对， 从扩展名为mas的文件中找出烟草轻型绿花叶病毒CP基因所共有的，并区别于其他烟草花 叶病毒属病毒CP基因序列的核苷酸序列。通过Primere.O软件设计特异性引物（正向引物 TMGMV-F，反向引物TMGMV-R)，结合参见图1和下表1，扩增目的片段大小为317bp。目的片段 经克隆测序，经BLAST检索为TMGMV的特异片段。
[0018] 上述引物由上海生工生物技术有限公司合成。
[0019] 表1 RT-PCR检测烟草轻型绿花叶病毒的引物及片段大小
[0020]
[0021] 2、RNA 的提取
[0022] 取经人工接种TMGMV的辣椒植株叶片，经液氮研磨后，采用RNA试剂盒(购于北京全 式金生物技术有限公司）提取总RNA，电泳和紫外分光光度计检测RNA的质量和浓度。
[0023] 3、用本发明特异性引物对提取的总RNA进行RT-PCR扩增。
[0024]第一步反转录
[0025] RNA变性:取RNA 2.5μ1于65°C温浴8分钟，冰上冷却；
[0026] 配置反转录反应液（7·5μ1):5Χ反应缓冲液2yl、100mM DTT 1μ1、10πιΜ dNTPs 1μ 1、RNA酶抑制剂0.125μ1、反转录酶0.5μ1、10μΜ随机引物0.5μ1，超纯水补至7.5μ1。
[0027] 将7.5μ1反应液加入到变性的2.5μ1 RNA中，混匀，42°C延伸1小时，95°C变性2分 钟。
[0028] 第二步 PCR
[0029] PCR反应体系（50yl):10XPCR BUFFER 5yl、dNTPs 5yl、PCR Taq 2μ1、模板（cDNA) 2.5μ1、分别加入表1中的正向引物和反向引物各2μ1、超纯水补至所需体积。
[0030] PCR 程序:94°C2min 预变性后;40 个循环参数为，94°C30s，54°C30s，72°C lmin;最后 72°C10min〇
[0031] 4、凝胶电泳
[0032] 10μ1 PCR产物用1.0%的琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统照相。结果见图2。结果表 明，本发明特异性引物能够检测出检测烟草轻型绿花叶病毒。
[0033]实施例2本发明特异性引物检测茄科植物植株样品
[0034]利用本发明特异性引物检测茄科植物植株样品中是否感染TMGMV，检测植株样品 为感染TMGMV的辣椒、感染烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus，TMV)的烟草、感染马铃薯 Y病毒的（Potato virus Y，PVY)的烟草和未感染TMGMV的辣椒。结合参见图3，结果表明，除 感染了 TMGMV的辣椒扩增出预期的317bp大小的目的条带外，而感染了烟草花叶病毒 (Tobacco mosaic virus，TMV)的烟草、感染了马铃薯Y病毒的（Potato virus Y，PVY)的烟 草及未感染TMGMV的辣椒均没有扩增出目的条带，表现为阴性。
[0035]由上可知，本发明的该对特异性引物对检测烟草轻型绿花叶病毒(TMGMV)具有特 异性，采用该引物针对茄科植物是否存在烟草轻型绿花叶病毒做出RT-PCR检测，能得到准 确可靠的检测结果。
【主权项】
1. 一种检测烟草轻型绿花叶病毒的RT-PCR引物，其特征在于：其正向引物的核苷酸序 列如SEQIDNo.1所示，反向引物的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示。2. -种检测烟草轻型绿花叶病毒的RT-PCR的方法，其特征在于:该方法是提取待测样 品总RNA，利用权利要求1所述的引物进行RT-PCR扩增，然后对扩增产物进行电泳鉴定。3. 如权利要求2所述的检测烟草轻型绿花叶病毒的RT-PCR的方法，其特征在于:所述扩 增产物大小为317bp。4. 如权利要求2或3所述的方法，其特征在于:所述待测样品为茄科植物。
【专利摘要】一种检测烟草轻型绿花叶病毒(Tobacco？mild？green？mosaic？virus,TMGMV)的RT-PCR引物及其方法，本发明根据GenBank发布的TMGMV核苷酸序列的高保守区所设计引物，该引物对烟草轻型绿花叶病毒是特异的，除了特异性好之外，还具有对不同的TMGMV分离物覆盖率最高的特点，能有效检测到不同的TMGMV分离物，检测结果更加准确，而且检测时不需加辅助引物，更加方便。本发明的检测方法可适用于批量茄科作物TMGMV的分子检测，在降低了检测成本，减少了工作量的同时，保留了快速、准确、灵敏度高等优势。
【IPC分类】C12R1/94, C12Q1/68, C12Q1/70, C12N15/11
【公开号】CN105441594
【申请号】CN201610047577
【发明人】唐前君, 刘嘉裕, 周志成, 阳蓉, 彭曙光, 曾维爱, 蔡海林, 杨红武
【申请人】湖南农业大学, 中国烟草中南农业试验站, 湖南省烟草公司长沙市公司
【公开日】2016年3月30日
【申请日】2016年1月25日