一种烟草花叶型病毒的快速灵敏检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种烟草花叶型病株中烟草花叶病毒、黄瓜花叶病毒、烟草脉带花叶病毒3种病毒的检测方法。通过烟草花叶病毒、黄瓜花叶病毒、烟草脉带花叶病毒特异性混合抗体诱捕病样中病毒，不必提取样品总RNA进行随机引物逆转录和特异性病毒引物复合PCR反应，专门针对烟草生产过程对烟草中上部叶片为害较为严重且不能从症状区分病原而建立的一种单管同时检测3种病毒中的1、2或3种不同病毒组合的方法，检测时间仅需5小时。本方法将快速、特异的免疫沉淀与灵敏的复合RT-PCR结合，同时设置健康烟草随机引物cDNA产物和相应病毒PCR特异片段阳性质粒作为阴、阳性对照，从而快速、准确、灵敏的检测田间烟草植株样品、抗病毒材料及田间环境疑似侵染源等。
【专利说明】一种烟草花叶型病毒的快速灵敏检测方法
【技术领域】
[0001]本发明属于植物病毒学检测【技术领域】，具体涉及一种烟草花叶型病毒的快速灵敏检测方法。
【背景技术】
[0002]烟草病毒病是一类在烟草上普遍发生且危害严重的侵染性病害，也是世界范围内的重要病害之一。20世纪50年代以来，烟草病毒病先后在世界各主产烟区相继暴发流行，并日趋严重，引起了世界各烟草种植国的广泛关注。尤其是自20世纪80年代以后，烟草作为一种重要的经济作物，其病原病毒得到了广泛而深入地研究。
[0003]云南作为我国最大烟草种植区，常年烟草植烟面积约为700万亩左右，是我省农业生产主要经济作物之一。近年来，由于栽培方式变化、烟草品种单一化以及环境中毒源的不断积累，烟草花叶病毒、黄瓜花叶病毒和马铃薯Y病毒属病毒成为云南烟区病毒病原，其为害范围和严重程度年度间波动加大，对不同烟区的烟草生产带来较大的影响，明确各种病原的侵染循环途经和重要中间寄主，才能有效降低病害对烟叶产质量的危害。
[0004]烟草花叶病毒是(Tobacco mosaic virus, TMV)是烟草花叶病毒属(Tobamovirus)的典型成员，病毒粒子为长杆状，长300~310 nm，直径18 nm，粒子中央有一个宽约2.3nm的心线，病毒粒子呈螺旋对称结构。病毒粒子非常稳定，体外存活期(LIV)约3000天(Andrew M.Q.King等，Virus Taxonomy, 2012)。该病毒病自苗期至大田期均可发生，主要症状表现为轻微花叶、重花叶、斑块状褪绿及黄化。苗期感染导致植株矮化，花叶在发病后期可产生褐色坏死斑点。烟草花叶病毒主要通过病汁液接触传播，有时也通过胚带毒的种子传播，但在烟草中未发现病毒可侵染胚，此外还可通过嫁接传毒(云南省烟草科学研究所，烟草微生物学，2008年)。
[0005]黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus, CMV)是雀麦花叶病毒科(Bromoviridae)黄瓜花叶病毒属(Cu`cumovirus)的典型成员。该病毒具有非常宽的寄主范围，可通过多种蚜虫以非持久方式传播侵染多种双子叶和单子叶植物。病毒粒子为等轴对称的二十面体，无包膜，三个组分的粒子大小一致，直径为28~30 nm。病毒含有4份基因组，即RNA1、RNA2、RNA3和RNA4，，通常还存在卫星RNA分子。烟叶粗汁液的钝化温度为55~70°C，10min，稀释限点(DEP)为1X10-3~I X 10-6，体外存活期(LIV) I~10天(Andrew M.Q.King等,Virus Taxonomy, 2012)。CMV可在烟草整个生育期侵染危害,通常引起烟草叶片出现深绿、浅绿相间的花叶，且常呈现多种畸形，病叶或变窄、变薄、扭曲、无光泽；或发脆，叶基变长，叶尖细长；有的病叶叶缘上卷，或出现黄绿色或深绿色的泡斑；有时叶片侧脉出现褐色坏死斑，或沿叶脉有深褐色的闪电状坏死；早期感染病毒的烟株矮缩、根系发育不良(云南省烟草科学研究所，烟草微生物学，2008年)。
[0006]烟草脉带花叶病毒(Tobaccovein banding mosaic virus, TVBMV)属于马铃薯Y病毒科(Potyviridae)马铃薯Y病毒属(Potyvirus)成员。病毒粒子呈弯曲线状，无包膜，长约600~750nm，直径11~13nm，螺旋对称结构，可在感病寄主体内形成风轮状内含体。烟叶粗汁液的钝化温度为50~62°C，10min，稀释限点(DEP)为1X10-2~1X10-6，体外存活期(LIV)7 ~50 天(Andrew M.Q.King 等，Virus Taxonomy, 2012)。病毒引起的主要症状表现为发病初期叶片中脉出现明脉及斑驳症状，不久叶脉两侧的组织呈深绿色带状斑(通称脉带)。常可延伸到小叶脉，最终叶脉及邻近叶组织变成褐色到黑色坏死斑，可引起全株死亡。自然条件下，TVBMV主要靠多种蚜虫以非持久方式传毒。带毒蚜虫、田间带病毒茄科作物及杂草是大田传播的主要毒源。在人工接种时，可通过机械摩擦传播(云南省烟草科学研究所，烟草微生物学，2008年)。
[0007]2012-2013年在云南各植烟区田间调查发现，在烟草生长中后期，烟草花叶型病毒病发生危害普遍且严重影响了烟叶产质量，经系统检测鉴定，这一时期主要病原为烟草花叶病毒、黄瓜花叶病毒和烟草脉带花叶病毒，但田间对这类花叶型病毒病病原难以通过症状区分，因此无法制定有效的病害预防措施；在研究病害侵染循环和病害发生早期，利用血清学检测方法检测时，其检测灵敏度不能较好地确定不同病毒的侵染情况，因此，需要建立一种可以大量、快速、准确、灵敏的检测方法对不同时期病样以及田间周边环境中病毒传播介体、中间寄主等进行检测。
【发明内容】
[0008]本发明的目的在于提供一种烟草花叶型病毒的快速灵敏检测方法。
[0009]本发明的目的是这样实现的，包括前处理、PCR反应、电泳检测步骤，具体包括:
A、前处理:待测样品与DEPC处理的PBST溶液混合后进行研磨，离心后取上清液备用；根据GenBank序列数据库中烟草花叶病毒序列，选择单一病毒中较为保守的区域设计引物，不同病毒间试验优化不同引物对间的影响筛选用于复合PCR的不同病毒检测引物对，在PCR管中加入用DEPC溶液稀释的病毒特异性抗体，混合抗体包被于无RNA酶及DNA酶的PCR管备用；取上清液50 μ I加入PCR管中，36~38°C放置0.5^1.5h以捕捉或沉淀对应的病毒粒子，吸出PCR管中液体，用经DEPC处理的PBST溶液洗涤PCR管内壁2~4次，吸出PCR管中液体，再用DEPC处理水洗涤f 2次PCR管内壁，吸出PCR管中液体，离心，吸净PCR管中液体，PCR管3飞。C放置待用；
B、PCR反应:在PCR管中以病毒RNA作为模板，利用9个单核苷酸碱基的随机引物进行逆转录反应，合成cDNA链，应用烟草花叶病毒引物对进行复合PCR反应；
C、电泳检测:取反应液进行琼脂糖凝胶电泳检测。
[0010]本发明将病毒特异性抗体与病毒结合的免疫沉淀技术与多引物复合反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)结合，第一部分的免疫反应类似于普通的酶联免疫吸附试验(ELISA)的包被和吸附过程，第二部分为随机引物逆转录合成不同种类病毒的cDNA第一链，第三部分应用不同种病毒经筛选获得的不同片段大小的特异性引物进行PCR检测。本发明整个方法通过病毒混合抗体富集病毒粒子、随机引物合成不同种类病毒cDNA第一链、3种病毒特异引物复合PCR检测，省略了繁琐的RNA提取、单一病毒引物逆转录合成cDNA第一链和病毒核苷酸序列测定与分析等步骤，利用抗体的高效价及特异性以及PCR的快速和灵敏性获得目的片段，为大量、快速、准确、灵敏检测田间烟草花叶型病毒病样品建立了一种科学的方法。本发明的方法应用不同病毒特异抗体的特异和高灵敏度的免疫捕捉(或沉淀)，设计独特的多重PCR引物，在单管中完成病毒的RT-PCR检测，从而快速、特异、灵敏的检测样品中的烟草花叶病毒、黄瓜花叶病毒、烟草脉带花叶病毒。
【专利附图】
【附图说明】
[0011]图1为本发明工作流程示意图；
图2为2013年云南昆明、曲靖、玉溪、大理、红河、保山田间烟草样品中烟草花叶病毒、黄瓜花叶病毒、烟草脉带花叶病毒三种病毒不同组合的检测结果；
图中:M为DL2000分子量Maker ； 1-4分别代表待测病毒阴性、TMV阳性、CMV阳性、TVBMV阳性；5-50分别代表不同待测样品。
【具体实施方式】
[0012]下面结合附图对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。
[0013]本发明所述的烟草花叶型病毒的快速灵敏检测方法，包括前处理、PCR反应、电泳检测步骤，具体包括:
A、前处理:待测样品与DEPC(焦炭酸二乙酯)处理的PBST溶液混合后进行研磨，离心后取上清液备用；根据GenBank序列数据库中烟草花叶病毒序列，选择单一病毒中较为保守的区域设计引物，不同病毒间试验优化不同引物对间的影响筛选用于复合PCR的不同病毒检测引物对，在PCR管中加入用DEPC (焦炭酸二乙酯)溶液稀释的病毒特异性抗体，混合抗体包被于无RNA酶及DNA酶的PCR管备用；取上清液50 μ I加入PCR管中，36~38°C放置
0.5^1.5h以捕捉或沉淀对应的病毒粒子，吸出PCR管中液体，用经DEPC (焦炭酸二乙酯)处理的PBST溶液洗涤PCR管内壁2~4次，吸出PCR管中液体，再用DEPC (焦炭酸二乙酯)处理水洗涤广2次PCR管内壁，吸出PCR管中液体，离心，吸净PCR管中液体，PCR管3飞。C放置待用；
B、PCR反应:在PCR管中以病毒RNA作为模板，利用9个单核苷酸碱基的随机引物进行逆转录反应，合成cDNA链，应用烟草花叶病毒引物对进行复合PCR反应；
C、电泳检测:取反应液进行琼脂糖凝胶电泳检测。
[0014]所述的“9个单核苷酸碱基的随机引物”为购自由上海英俊生物技术有限公司、生工生物工程(上海)有限公司、宝生物工程(大连)合成。
[0015]所述的烟草花叶型病毒为烟草花叶病毒、黄瓜花叶病毒和/或烟草脉带花叶病毒。
[0016]A步骤中所述的混合抗体包被为在PCR管中加入终浓度分别为1:10000、1:5000和1:5000的烟草花叶病毒、黄瓜花叶病毒、烟草脉带花叶病毒多抗稀释液100 μ 1，3-5。C包被过夜或36~38°C包被0.5~1.5h后，吸出PCR管中液体，用经DEPC处理的PBST溶液洗涤PCR内壁1-3次，吸进管中液体，PCR管待用。
[0017]所述的DEPC处理的PBST溶液为含有0.01%吐温20的0.lmol/L,pH7.0的磷酸盐缓冲液中加入0.2%DEPC充分混匀后放置过夜，高压灭菌30min得到。
[0018]A步骤中所述的待测样品与DEPC处理的PBST溶液的重量比为1:5~10。
[0019]A步骤中所述的D EPC处理水为超纯水中加入0.2%DEPC充分混匀后放置过夜，121 °C高温高压灭菌30min得到。[0020]A步骤中所述的离心转速为5000~10000r/min,离心5~IOmin0
[0021]B步骤所述的RNA模板为高温变性法、沉淀法、抗体捕获法获得。
[0022]B步骤所述的烟草花叶病毒引物对为:(见表1)
表1用于复合PCR检测的烟草花叶病毒、黄瓜花叶病毒、烟草脉带花叶病毒引物
【权利要求】
1.一种烟草花叶型病毒的快速灵敏检测方法，其特征在于包括前处理、PCR反应、电泳检测步骤，具体包括: A、前处理:待测样品与DEPC处理的PBST溶液混合后进行研磨，离心后取上清液备用；根据GenBank序列数据库中烟草花叶病毒序列，选择单一病毒中较为保守的区域设计引物，不同病毒间试验优化不同引物对间的影响筛选用于复合PCR的不同病毒检测引物对，在PCR管中加入用DEPC溶液稀释的病毒特异性抗体，混合抗体包被于无RNA酶及DNA酶的PCR管备用；取上清液50 μ I加入PCR管中，36~38°C放置0.5^1.5h以捕捉或沉淀对应的病毒粒子，吸出PCR管中液体，用经DEPC处理的PBST溶液洗涤PCR管内壁2~4次，吸出PCR管中液体，再用DEPC处理水洗涤f 2次PCR管内壁，吸出PCR管中液体，离心，吸净PCR管中液体，PCR管3飞。C放置待用； B、PCR反应:在PCR管中以病毒RNA作为模板，利用9个单核苷酸碱基的随机引物进行逆转录反应，合成cDNA链， 应用烟草花叶病毒引物对进行复合PCR反应； C、电泳检测:取反应液进行琼脂糖凝胶电泳检测。
2.根据权利要求1所述的烟草花叶型病毒的快速灵敏检测方法，其特征在于所述的烟草花叶型病毒为烟草花叶病毒、黄瓜花叶病毒和/或烟草脉带花叶病毒。
3.根据权利要求1所述的烟草花叶型病毒的快速灵敏检测方法，其特征在于A步骤中所述的混合抗体包被为在PCR管中加入终浓度分别为1:10000、1:5000和1:5000的烟草花叶病毒、黄瓜花叶病毒、烟草脉带花叶病毒多抗稀释液100 μ 1，3飞。C包被过夜或36~38°C包被0.5^1.5h后，吸出PCR管中液体，用经DEPC处理的PBST溶液洗涤PCR内壁f 3次，吸进管中液体，PCR管待用。
4.根据权利要求1或3所述的烟草花叶型病毒的快速灵敏检测方法，其特征在于所述的DEPC处理的PBST溶液为含有0.01%吐温20的0.lmol/L、pH7.0的磷酸盐缓冲液中加入0.2%DEPC充分混匀后放置过夜，高压灭菌30min得到。
5.根据权利要求1所述的烟草花叶型病毒的快速灵敏检测方法，其特征在于A步骤中所述的待测样品与DEPC处理的PBST溶液的重量比为1:5~10。
6.根据权利要求1所述的烟草花叶型病毒的快速灵敏检测方法，其特征在于A步骤中所述的DEPC处理水为超纯水中加入0.2%DEPC充分混匀后放置过夜，121°C高温高压灭菌30min得到。
7.根据权利要求1所述的烟草花叶型病毒的快速灵敏检测方法，其特征在于A步骤中所述的离心转速为5000~10000r/min,离心5~lOmin。
8.根据权利要求1所述的烟草花叶型病毒的快速灵敏检测方法，其特征在于B步骤所述的RNA模板为高温变性法、沉淀法、抗体捕获法获得。
9.根据权利要求1所述烟草花叶型病毒的快速灵敏检测方法，其特征在于B步骤所述的烟草花叶病毒引物对为:
10.根据权利要求1所述烟草花叶型病毒的快速灵敏检测方法，其特征在于所述的PCR反应的体系为50 μ L，其中10倍Taq酶缓冲液5 μ LUO mmol/L浓度的6种引物各Iμ L,2.5 mmol/L dNTPs 3 yL、Taq酶I μ L、灭菌超纯水15 μ L ;反应条件为94°C预变性4min ;94°C变性 lmin, 58°C退火 30s，72°C延伸 lmin，30 个循环；最后 72°C延伸 10 min。
【文档编号】C12Q1/70GK103740865SQ201410034604
【公开日】2014年4月23日 申请日期:2014年1月25日 优先权日:2014年1月25日
【发明者】秦西云, 丁铭, 卢训, 张仲凯, 方敦煌, 李婷婷, 方琦 申请人:云南省烟草农业科学研究院, 云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所