一种马铃薯病毒的快速灵敏检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种云南马铃薯主栽品种丽薯6号、云薯401、宣薯2号病株中马铃薯Y病毒、马铃薯X病毒、马铃薯A病毒和马铃薯卷叶病毒4种病毒的检测方法。本发明通过对云南马铃薯主栽品种丽薯6号、云薯401、宣薯2号病株中马铃薯Y病毒、马铃薯X病毒、马铃薯A病毒和马铃薯卷叶病毒4种特异性混合抗体诱捕病样中病毒，不必提取样品总RNA进行随机引物逆转录和特异性病毒引物复合PCR反应。本方法将快速、特异的免疫沉淀与灵敏的复合RT-PCR结合，同时设置健康马铃薯随机引物cDNA产物和相应病毒PCR特异片段阳性质粒作为阴、阳性对照，从而快速、准确、灵敏的应用于检测田间马铃薯植株样品、抗病毒材料及田间环境疑似侵染源等方面。
【专利说明】一种马铃薯病毒的快速灵敏检测方法
【技术领域】
[0001]本发明属于植物病毒学检测【技术领域】，具体涉及一种马铃薯病毒的快速灵敏检测方法。
【背景技术】
[0002]马铃薯病毒病田间表现症状复杂多样，常见的症状类型可归纳如下:(1)花叶型。叶面出现淡绿、黄绿和浓绿相间的斑驳花叶(有轻花叶、重花叶、皱缩花叶和黄斑花叶之分)，叶片基本不变小，或叶片变小、皱缩，植株矮化。(2)卷叶型。叶缘向上卷曲，甚至呈圆筒状，色淡，变硬革质化，有时叶背出现紫红色。(3)坏死型(或称条斑型)。叶脉、叶柄、茎枝出现褐色坏死斑或连合成条斑，甚至叶片萎垂、枯死或脱落。(4)丛枝及束顶型。分枝纤细而多，缩节丛生或束顶，叶小花少，明显矮缩。常见的马铃薯病毒病有3种类型。花叶型:叶面叶绿素分布不均，呈浓绿淡绿相间或黄绿相间斑驳花叶，严重时叶片皱缩，全株矮化，有时伴有叶脉透明；坏死型:叶、叶脉、叶柄及枝条、茎部都可出现褐色坏死斑，病斑发展连接成坏死条斑，严重时全叶枯死或萎蔫脱落；卷叶型:叶片沿主脉或自边缘向内翻转，变硬、革质化，严重时每张小叶呈筒状。此外还有复合侵染，引致马铃薯发生条斑坏死。轻花叶病:由X病毒引起，并常与其他病毒负荷侵染。病株生育正常，仅叶片表现出不同的斑驳或轻微花叶，气温过高、过低时症状都易隐蔽。病毒由汁液接触传染。重花叶病:病株上的叶脉、叶柄及茎均有黑褐色坏死条斑，并发脆易折。感病初期叶片呈现斑驳花叶或有枯斑，以后背面叶脉坏死， 甚至沿叶柄蔓延至主茎。主茎发病时产生褐色条斑，导致全叶萎蔫，但不脱落。重花叶病由Y病毒侵染引起。Y病毒既可以通过汁液机械传染，又可以通过蚜虫传染。Y病毒与X病毒混合侵染时呈现严重的皱缩花叶及矮化症。我国发生的马铃薯退化，主要由这两种病毒复合侵染所致。马铃薯卷叶病:病株叶片边缘以主脉为中心向上卷曲，革质化，叶色变淡，有的略呈紫红色。有的病株块茎切面呈网状坏死斑。病薯产生的重病株，植株短化，老叶卷成筒状。本病由马铃薯卷叶病毒引起，在自然条件下由蚜虫传染。病原为:马铃薯Y病毒、马铃薯S病毒、马铃薯A病毒和马铃薯卷叶病毒。
[0003]马铃薯X病毒(Potato virus J简称PVX)在马铃薯上引起轻花叶症，有时产生斑驳或环斑，病毒粒体线形，长480-580纳米，其寄主范围广，系统侵染的植物主要是茄科，病毒稀释限点100000-1000000倍，钝化温度68~75°C，体外存活期I年以上。
[0004]马铃薯S病毒{Potato virus S简称PVS)，在马铃薯上引起轻度皱缩花叶或不显症，病毒粒体线形，长650纳米，其寄主范围较窄，系统侵染的植物仅限于茄科的少数植物，病汁液稀释限点1~10倍，钝化温度55飞(TC，体外存活期3~4天。
[0005]马铃薯A病毒{PotatoJ简称PVA)在马铃薯上引起轻花叶或不显症病毒粒体线形，长730纳米，其寄主范围较窄，仅侵染茄科少数植物，病汁液稀释限点10倍，钝化温度44~52°C，体外存活期12~18小时。
[0006]马铃薯Y病毒(potato virus Y简称PVY),在马铃薯上引起严重花叶或坏死斑和坏死条斑，病毒粒体线形，长730纳米，该病毒寄主范围较广，可侵染茄科多种植物，病汁液稀释限点100-1000倍，钝化温度52~62°C，体外存活期1~2天。
[0007]马铃薯卷叶病毒PoiaioFirw1S简称PLRV)病毒粒体球状，直径25纳米。该病毒寄主范围主要是茄科植物，在马铃薯上引起卷叶症，病毒稀释限点10000倍，钝化温度70°c，体外存活期12~24小时，ZC低温下存活4天。此外TMV也可侵染马铃薯。
[0008]在马铃薯生长中，马铃薯病毒病发生危害普遍且严重影响了马铃薯产质量，主要病原为马铃薯Y病毒、马铃薯S病毒、马铃薯A病毒和马铃薯卷叶病毒，但田间对这类病毒病病原难以通过症状区分，因此无法制定有效的病害预防措施；在研究病害侵染循环和病害发生早期，利用血清学检测方法检测时，其检测灵敏度不能较好地确定不同病毒的侵染情况，因此，需要建立一种可以大量、快速、准确、灵敏的检测方法对不同时期病样以及田间周边环境中病毒传播介体、中间寄主等进行检测。
【发明内容】
[0009]本发明的目的在于提供一种马铃薯病毒的快速灵敏检测方法。
[0010]本发明的目的是这样实现的，包括前处理、PCR反应、电泳检测步骤，具体包括:
A、前处理:待测样品与DEPC处理的PBST溶液混合后进行研磨，离心后取上清液备用；根据GenBank序列数据库中马铃薯病毒序列，选择单一病毒中较为保守的区域设计引物，不同病毒间试验优化不同引物对间的相互影响，筛选用于复合PCR的不同病毒检测引物对，在PCR管中加入用D EPC溶液稀释的病毒特异性抗体，混合抗体包被于无RNA酶及DNA酶的PCR管备用；取上清液50 μ I加入PCR管中，36~38°C放置0.5^1.5h以捕捉(或沉淀)对应的病毒粒子，吸出PCR管中液体，用经DEPC处理的PBST溶液洗涤PCR管内壁2~4次，吸出PCR管中液体，再用DEPC处理水洗涤f 2次PCR管内壁，吸出PCR管中液体，离心，吸净PCR管中液体，PCR管3飞。C放置待用；
B、PCR反应:在PCR管中以病毒RNA作为模板，利用9个单核苷酸碱基的随机弓丨物进行逆转录反应，合成cDNA链，应用马铃薯病毒引物对进行复合PCR反应；
C、电泳检测:取反应液进行琼脂糖凝胶电泳检测。
[0011]本发明基于病毒外壳蛋白抗原与抗体反应的酶联免疫吸附法和基于病毒核酸的PCR检测是目前应用最为广泛的检测病毒的方法。免疫捕捉(或沉淀)RT-PCR结合了上述两种方法的优点。免疫捕捉反转录聚合酶链式反应(IC-RT-PCR)主要由三个部分组成，第一部分的免疫反应类似于普通的酶联免疫吸附试验(ELISA)的包被及吸附过程，第二部分为cDNA链的合成，第三部分即通常的PCR检测。本发明的方法将快速、特异和高灵敏度的免疫捕捉(或沉淀)与复合RT-PCR结合，从而快速、特异的检测样品中的马铃薯Y病毒、马铃薯S病毒、马铃薯A病毒、马铃薯卷叶病毒。
【专利附图】
【附图说明】
[0012]图1为本发明工作流程不意图。
【具体实施方式】
[0013]下面结合附图对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。[0014]本发明所述的马铃薯病毒的快速灵敏检测方法，包括前处理、PCR反应、电泳检测步骤，具体包括:
A、前处理:待测样品与DEPC处理的PBST溶液混合后进行研磨，离心后取上清液备用；根据GenBank序列数据库中马铃薯病毒序列，选择单一病毒中较为保守的区域设计引物，不同病毒间试验优化不同引物对间的相互影响，筛选用于复合PCR的不同病毒检测引物对，在PCR管中加入用DEPC溶液稀释的病毒特异性抗体，混合抗体包被于无RNA酶及DNA酶的PCR管备用；取上清液50 μ I加入PCR管中，36~38°C放置0.5^1.5h以捕捉或沉淀对应的病毒粒子，吸出PCR管中液体，用经DEPC处理的PBST溶液洗涤PCR管内壁2~4次，吸出PCR管中液体，再用DEPC处理水洗涤f 2次PCR管内壁，吸出PCR管中液体，离心，吸净PCR管中液体，PCR管3飞。C放置待用；
B、PCR反应:在PCR管中以病毒RNA作为模板，利用9个单核苷酸碱基的随机引物进行逆转录反应，合成cDNA链，应用马铃薯病毒引物对进行复合PCR反应；
C、电泳检测:取反应液进行琼脂糖凝胶电泳检测。
[0015]所述的“9个单核苷酸碱基的随机引物”为购自由上海英俊生物技术有限公司、生工生物工程(上海)有限公司、宝生物工程(大连)合成。
[0016]所述的马铃薯病毒为马铃薯Y病毒、马铃薯S病毒、马铃薯A病毒和马铃薯卷叶病毒。
[0017]A步骤中所述的混合抗体包被为在PCR管中加入终浓度分别为1:5000、1:5000、I: 5000和1:5000的马铃薯Y病毒、马铃薯S病毒、马铃薯A病毒、马铃薯卷叶病毒多抗稀释液100μ 1，3~5°C包被过夜或36~38°C包被0.5~1.5h后，吸出PCR管中液体，用经DEPC处理的PBST溶液洗涤PCR内壁2飞次，吸进管中液体，PCR管待用。
[0018]所述的DEPC处理的PBST溶液为含有0.01%吐温20的0.lmol/L,pH7.0的磷酸盐缓冲液中加入0.2%DEPC充分混匀后放置过夜，高压灭菌30min得到。
[0019]A步骤中所述的待测样品与DEPC处理的PBST溶液的重量比为1:5~10。
[0020]A步骤中所述的DEPC处理水为超纯水中加入0.2%DEPC充分混匀后放置过夜，121 °C高温高压灭菌30min得到。
[0021]A步骤中所述的离心转速为5000~10000r/min,离心5~lOmin。
[0022]B步骤所述的RNA模板为高温变性法、沉淀法或抗体捕获法获得。 [0023]B步骤所述的马铃薯病毒引物对为:(见表1)
表1用于复合PCR检测的马铃薯Y病毒、马铃薯Y病毒、马铃薯Y病毒、马铃薯Y病毒
引物
【权利要求】
1.一种马铃薯病毒快速灵敏检测方法，其特征在于包括前处理、PCR反应、电泳检测步骤，具体包括: A、前处理:待测样品与DEPC处理的PBST溶液混合后进行研磨，离心取上清液备用；根据GenBank序列数据库中马铃薯病毒序列，选择单一病毒中较为保守的区域设计引物，不同病毒间试验优化不同引物对的相互影响，筛选用于复合PCR的不同病毒检测引物对，在PCR管中加入用DEPC溶液稀释的病毒特异性抗体，混合抗体包被于无RNA酶及DNA酶的PCR管备用；取上清液50 μ I加入PCR管中，36~38°C放置0.5^1.5h以捕捉(或沉淀)对应的病毒粒子，吸出PCR管中液体，用经DEPC处理的PBST溶液洗涤PCR管内壁2~4次，吸出PCR管中液体，再用DEPC处理水洗涤f 2次PCR管内壁，吸出PCR管中液体，离心，吸净PCR管中液体，PCR管3飞。C放置待用； B、PCR反应:在PCR管中以病毒RNA作为模板，利用9个单核苷酸碱基的随机弓丨物进行逆转录反应，合成cDNA链，应用马铃薯病毒引物对进行复合PCR反应； C、电泳检测:取PCR反应液5μ I进行琼脂糖凝胶电泳检测。
2.根据权利要求1所述的马铃薯病毒快速灵敏检测方法，其特征在于所述的马铃薯病毒为马铃薯Y病毒、马铃薯S病毒、马铃薯A病毒和马铃薯卷叶病毒。
3.根据权利要求1所述的马铃薯病毒快速灵敏检测方法，其特征在于A步骤中所述的混合抗体包被为在PCR管中加入终浓度分别为1:5000、1:5000、1:5000和1:5000的马铃薯Y病毒、马铃薯S病毒、马铃薯A病毒、马铃薯卷叶病毒多抗稀释液100 μ 1，3飞。C包被过夜或36~38°C包被0.5~1.5h后，吸出PCR管中液体，用经DEPC处理的PBST溶液洗涤PCR内壁2飞次，吸进管中液 体，PCR管待用。
4.根据权利要求1所述的马铃薯病毒快速灵敏检测方法，其特征在于所述的DEPC处理的PBST溶液制备方法为:在含有0.01%吐温20的0.lmol/L pH7.0的磷酸盐缓冲液中加入0.2%DEPC充分混匀后，放置过夜，高压灭菌30min。
5.根据权利要求1所述的马铃薯病毒快速灵敏检测方法，其特征在于A步骤中所述的待测样品与DEPC处理的PBST溶液的重量比为1:5~10。
6.根据权利要求1所述的马铃薯病毒快速灵敏检测方法，其特征在于A步骤中所述的DEPC处理水为超纯水中加入0.2%DEPC充分混匀后放置过夜，121 °C高温高压灭菌30min得到。
7.根据权利要求1所述的马铃薯病毒快速灵敏检测方法，其特征在于A步骤中所述的离心转速为5000~10000r/min,离心5~lOmin。
8.根据权利要求1所述的马铃薯病毒快速灵敏检测方法，其特征在于B步骤所述的RNA模板为高温变性法、沉淀法或抗体捕获法获得。
9.根据权利要求1所述的马铃薯病毒快速灵敏检测方法，其特征在于B步骤所述的马铃薯病毒引物对为:
10.根据权利要求1所述的马铃薯病毒快速灵敏检测方法，其特征在于所述的PCR反应体系为50 μ L体系，其中10倍Taq酶缓冲液5 μ L、10 mmol/L浓度的6种引物各I μ L、.2.5 mmol/L dNTPs 3 μ L、Taq酶I μ L、灭菌超纯水15 μ L ;反应条件为94°C预变性4min ;94°C变性lmin, 58°C退火30s，72。。延伸lmin,30个循环；最后72°C延伸10 min。
【文档编号】C12Q1/70GK103757138SQ201410034605
【公开日】2014年4月30日 申请日期:2014年1月25日 优先权日:2014年1月25日
【发明者】丁铭, 卢训, 张仲凯 申请人:云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所