李痘病毒主要株系杂交探针及基因芯片的制备方法及检测的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种用于李痘病毒主要株系杂交探针，本发明还涉及一种包括该探针 的基因芯片的制备方法，本发明还涉及一种采用上述基因芯片检测李痘病毒的方法，属于 生物技术领域。
【背景技术】
[0002] 李痘病毒Plum pox virus,PPV是我国2007年颁布的进境植物检疫性有害生物，是 核果类果树危险性最大的病毒之一，属于马铃薯Y病毒科Potyviridae中的马铃薯Y病毒属 Potyvirus，其自然寄主主要是李属的木本植物，侵染李、杏、桃、樱桃等核果类果树后，使叶 片和果实均受到严重危害，未成熟果实大量脱落，造成果实品质下降，产量降低。病毒远距 离扩散则主要靠感染病毒的植物繁殖材料的调运。根据病毒的来源和侵染植物的不同，该 病毒的目前主要株系有6个，它们分别为PPV-D，PPV-M，PPV-C，PPV-EA，PPV-W，PPV-Rec，其中 D株系和Μ株系是目前最主要的流行株系。
[0003] 广东地处我国的南方开放地区，地理环境优越，每年经过广东辖区口岸的进出境 种子、苗木等容易携带该病毒的材料数量众多，由于进出境批次多，数量庞大，急需研究出 即能保证检测速度快、灵敏度要高、而且检测通量高的方法，由于苗木带毒率低，只有加大 样品的抽样量才能避免漏检和保证检测率，而对于大量样品的检测，就必须有检测高通量 的仪器设备和方法，本课题就是针对这一病毒检测的要求，利用基因芯片技术来研究李痘 病毒主要不同株系的检测方法，以便最大限度的提高该病毒的检出率和防止漏检，对保证 我国农业生产可持续健康的发展具有非常重要的意义。
[0004] 目前无论国外国内，植物病毒的检测方法主要有如下4种：一是传统的生物学方 法，其特点是周期长，准确度低，检测病毒数量少，劳动强度大，；二是电子显微镜方法，但它 只能观察病毒粒体形态，不能鉴定病毒种类，而且操作复杂，价格十分昂贵;三是酶联免疫 吸附分析法，是目前应用最广的病毒检测方法，但其检测时间长，操作步骤多，而且需要专 用仪器和购买昂贵的特异性抗血清；四是PCR方法虽然灵敏度非常高且快速，但更需要专用 仪器和专业人员，而且检测通量非常有限。
[0005] 由于植物病毒的特殊性，即一般种子和苗木带毒率是非常低的，加上进出境量通 常非常之多，如果抽样量过少，则漏检的机率就一定非常之大，把关作用就会大大消弱；为 了最大限度的提高检测率，避免漏检，就必须加大抽样量，这样就会导致样品众多，不仅会 加大检测的工作量，而且会极大的影响检测速度，推迟通关速度，进而影响进出境贸易的正 常进行，因此急需具有高通量检测的仪器设备和方法，而基因芯片技术正好适合这一要求。
[0006] 基因芯片gene chip的最早是80年代中期提出的，其本质上仍然是核酸分子杂交 方法，具体系指将大量，通常每平方厘米点阵密度高于400,探针分子固定于支持物上后与 标记的样品分子进行杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度进而获取样品分子的数 量和序列信息。基因芯片技术由于同时将大量探针固定于支持物上，所以可以一次性对样 品大量序列进行检测和分析，从而解决了传统核酸印迹杂交Southern Blotting和 Northern Blotting等技术操作繁杂、自动化程度低、操作序列数量少、检测效率低等不足； 而且，通过设计不同的探针阵列、使用特定的分析方法可使该技术具有多种不同的应用价 值，如基因表达谱测定、实变检测、多态性分析、基因组文库作图及杂交测序等。
[0007] 目前基因芯片技术已经在许多方面得到了广泛的应用，但是在李痘病毒主要不同 株系检测鉴定方面还未见诸报道。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的是为了克服现有技术中的不足之处，提供一种用于检测李痘病毒主 要株系杂交探针；
[0009] 本发明还涉及一种包括上述探针的基因芯片的制备方法。
[0010] 为了达到上述目的，本发明采用以下方案：
[0011] -种李痘病毒主要株系杂交探针，其特征在于包括：
[0012] PPV-D:5 '-CAACAAAACCAGTTTCACAGGTGCCAGGACCTCAACTGCAA-3，
[0013] PPV-M:5 '-CGGTAAGACCAGTTCCTCCAATTTCAGGGACCAAACCGCGG-3，
[0014] PPV-EA:5 '-CCACTAGGACAGTGCCTCACACAACAACTACTACACCTCCT-3 '
[0015] PPV-Rec:5 '-CGATAAGACCAGTTTCTCCAATTTCAGGGGCCACACCGCAG-3 '
[0016] PPV-W:5 '-GCGTGAAGCCAACTACATCAGCAACAATTAACCCAACGTCT-3 '
[0017] PPV-C:5 '-ATGTGAGACCGATTGCACCAGTAGTGACAAGTCCATTCTCG-3 '。
[0018] -种基因芯片的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
[0019] A、制备基因芯片点样：
[0020] 取5ul纯化探针，加点样液5ul混匀，探针浓度为?ομπι;加到点样仪，将寡核苷酸探 针点在醛基玻片上，并通过探针5 '末端的氨基基团进行共价固定；
[0021] 其中所述探针包括：
[0022] PPV-D:5 '-CAACAAAACCAGTTTCACAGGTGCCAGGACCTCAACTGCAA-3，
[0023] PPV-M:5 '-CGGTAAGACCAGTTCCTCCAATTTCAGGGACCAAACCGCGG-3，
[0024] PPV-EA:5 '-CCACTAGGACAGTGCCTCACACAACAACTACTACACCTCCT-3 '
[0025] PPV-Re c:5 '-CGATAAGACCAGTTTCTCCAATTTCAGGGGCCACACCGCAG-3 '
[0026] PPV-W:5 '-GCGTGAAGCCAACTACATCAGCAACAATTAACCCAACGTCT-3 '
[0027] PPV-C:5 '-ATGTGAGACCGATTGCACCAGTAGTGACAAGTCCATTCTCG-3 '；
[0028] B、PCR扩增与样品标记：
[0029] B1、感病植物总RNA提取；
[0030] 称取0. lg感病植物组织样品，然后按照Trizol试剂盒方法提取样品总RNA;
[0031] B2、反转录；
[0032] 在装有去离子水9.5yL的0.2mL PCR管中，加入B1中提取的样品总RNA 2yL，01igo (dT)15 0.5yL，dNTPs luL，混合均匀，70°C水浴5min后立即置于冰上2min，3000rpm离心30 秒后加入5XcDNA第一链合成缓冲液4yL，0. lmol/L DTT lyL，RNase抑制剂lyL，M-MLV反转 录酶 lyL，40°C 水浴 60min;
[0033] B3、PCR 扩增
[0034] 在0 · 2mL PCR管中，加入 10 X PCR扩增缓冲液2 · 5yL，dNTPslyL，Cy3标记的PPV- 〇111口-?1]^1]1〇1凡，〇73标记的？?￥-〇11丨卩-?2]^1]1〇1凡，反转录合成反应液2以1^，加水至2541^， Taq 聚合酶 Ο · 5yL; 94°C3 分钟；94°C40s，55°C40s，72°C lmin，循环 35 次；72°C lOmin; 4°C 保存；
[0035] C、芯片预处理：
[0036] 点样仪中干燥好芯片于65°C烘箱中固定lh，将芯片点有DNA的一面在60°C水浴锅 上水合10s，芯片距水面距离2-3cm，在空气中室温自然干燥后，再进行一次水合，之后将点 有探针的一面朝上，放在紫外交联仪中250mJ交联，后再将芯片放在42°C预热的0.5%SDS中 洗涤lOmin，再用42°C预热的蒸馏水清洗4min，最后用无水乙醇清洗2min，2000rpm离心5min 去除芯片表面的液体后，密封，室温保存备用；
[0037] D、芯片的杂交：
[0038]制备好芯片放置在杂交盒中，将标记样品与杂交液的混合物混匀后，3000rpm，离 心30s，于95°C沸水中变性处理3min，冰浴骤冷lmin，然后用移液器将杂交混合液分别加注 到杂交芯片的盖片上的小孔中，使预杂交液覆盖于点样区，然后盖紧杂交盒的盖，放入42°C 的水浴中，杂交2h，使样品与探针充分混合；
[0039] E、芯片的清洗：
[0040] 杂交结束后，在暗室内取出芯片，杂交面朝上放于清洗盒中，放在水平摇床上用42 °〇预热洗液1清洗4min，以便洗去没有与探针特异性结合的样品;然后迅速地用镊子将芯片 转移到盛放有洗液2的清洗盒中，杂交面朝上，放在水平摇床上用42°C预热洗液1清洗4min， 清洗结束后，1500rpm，lmin离心干燥，除去玻璃表面上的液体；
[0041] F、芯片的扫描分析
[0042] 步骤E清洗完毕4小时内进行扫描，利用基因芯片激光共聚焦扫描仪扫读芯片信 息；
[0043] G、数据处理与结果判定
[0044] 扫描后图像将通过判读软件自动进行分析，通过比较分析信号中位值和信号平均 值的输出数据，以其中最能反应本试验芯片杂交图像信息的参数值进行结果分析，当芯片 上呈现绿色信号且HEX质控信号呈现绿色信号时即可判定阳性反应