NTPs luL，混合均匀，70°C水浴5min后立即置于冰上2min，3000rpm离心30秒 后加入5XcDNA第一链合成缓冲液4yL，0. lmol/L DTT lyL，RNase抑制剂lyL，M-MLV反转录 酶 lyL，40°C 水浴 60min;
[0101] B3、PCR 扩增
[0102] 在0 · 2mL PCR管中，加入10 X PCR扩增缓冲液2 · 5yL，dNTPslyL，Cy3标记的卩卩乂-〇111口-?1]^1]1〇1凡，〇73标记的？?￥-〇11丨卩-?2]^1]1〇1凡，反转录合成反应液2以1^，加水至2541^， Taq 聚合酶 0 · 5yL; 94°C3 分钟；94°C40s，55°C40s，72°C lmin，循环 35 次；72°C lOmin; 4°C 保存； 所述PPV-chip-Pl的序列：
[0103] 5'-CCCATTTTCACRCCAGCARC-3' Tm = 61.8;其中R表示碱基G或者A;
[0104] 所述PPV-chip-P2的序列为：
[0105] 5'-TCGCATGATCCAACAATGGC-3' Tm = 59.8。
[0106] C、芯片预处理：
[0107] 点样仪中干燥好芯片于65°C烘箱中固定lh，将芯片点有DNA的一面在60°C水浴锅 上水合10s，芯片距水面距离2-3cm，在空气中室温自然干燥后，再进行一次水合，之后将点 有探针的一面朝上，放在紫外交联仪中250mJ交联，后再将芯片放在42°C预热的0.5%SDS中 洗涤lOmin，再用42°C预热的蒸馏水清洗4min，最后用无水乙醇清洗2min，2000rpm离心5min 去除芯片表面的液体后，密封，室温保存备用；
[0108] D、芯片的杂交：
[0109] 制备好芯片放置在杂交盒中，将标记样品与杂交液的混合物混匀后，3000rpm，离 心30s，于95°C沸水中变性处理3min，冰浴骤冷lmin，然后用移液器将杂交混合液分别加注 到杂交芯片的盖片上的小孔中，使预杂交液覆盖于点样区，然后盖紧杂交盒的盖，放入42°C 的水浴中，杂交2h，使样品与探针充分混合；
[0110] E、芯片的清洗：
[0111] 杂交结束后，在暗室内取出芯片，杂交面朝上放于清洗盒中，放在水平摇床上用42 °〇预热洗液1清洗4min，以便洗去没有与探针特异性结合的样品;然后迅速地用镊子将芯片 转移到盛放有洗液2的清洗盒中，杂交面朝上，放在水平摇床上用42°C预热洗液1清洗4min， 清洗结束后，1500rpm，lmin离心干燥，除去玻璃表面上的液体；
[0112] F、芯片的扫描分析
[0113]步骤E清洗完毕4小时内进行扫描，利用基因芯片激光共聚焦扫描仪扫读芯片信 息；
[0114] G、数据处理与结果判定
[0115]扫描后图像将通过判读软件自动进行分析，通过比较分析信号中位值和信号平均 值的输出数据，以其中最能反应本试验芯片杂交图像信息的参数值进行结果分析，当芯片 上呈现绿色信号且HEX质控信号呈现绿色信号时即可判定阳性反应，对于反应强烈的可以 直接从扫描图片上荧光的反应判断检测结果。
[0116] 实施例3
[0117] -种基因芯片的制备方法，包括以下步骤：
[0118] A、制备基因芯片点样：
[0119] 取5ul纯化探针，加点样液5ul混匀，探针浓度为ΙΟμπι;加到点样仪，将寡核苷酸探 针点在醛基玻片上，并通过探针5 '末端的氨基基团进行共价固定；
[0120] 其中所述探针包括：
[0121] PPV-D:5 '-CAACAAAACCAGTTTCACAGGTGCCAGGACCTCAACTGCAA-3，
[0122] PPV-M:5 '-CGGTAAGACCAGTTCCTCCAATTTCAGGGACCAAACCGCGG-3，
[0123] PPV-EA:5 '-CCACTAGGACAGTGCCTCACACAACAACTACTACACCTCCT-3 '
[0124] PPV-Rec:5 '-CGATAAGACCAGTTTCTCCAATTTCAGGGGCCACACCGCAG-3 '
[0125] PPV-W:5 '-GCGTGAAGCCAACTACATCAGCAACAATTAACCCAACGTCT-3 '
[0126] PPV-C:5 '-ATGTGAGACCGATTGCACCAGTAGTGACAAGTCCATTCTCG-3 '；
[0127] 所述点样的具体做法:采用点样机按阵列排布的方式点样，点与点的中心距离为 740μπι，点的直径为500μπι，样品包括探针、定位基因阳性对照、DMS0阴性对照及三蒸水空白 对照，每个样品点20个重复点，每块玻片点两个重复阵列。
[0128] B、PCR扩增与样品标记：
[0129] B1、感病植物总RNA提取；
[0130] 称取0. lg感病植物组织样品，然后按照Trizol试剂盒方法提取样品总RNA;
[0131] B2、反转录；
[0132] 在装有去离子水9.5yL的0.2mL PCR管中，加入B1中提取的样品总RNA 2yL，01igo (dT)15 0.5yL，dNTPs luL，混合均匀，70°C水浴5min后立即置于冰上2min，3000rpm离心30 秒后加入5XcDNA第一链合成缓冲液4yL，0. lmol/L DTT lyL，RNase抑制剂lyL，M-MLV反转 录酶 lyL，40°C 水浴 60min;
[0133] B3、PCR 扩增
[0134] 在0 · 2mL PCR管中，加入10 X PCR扩增缓冲液2 · 5yL，dNTPslyL，Cy3标记的卩卩乂-〇111口-?1]^1]1〇1凡，〇73标记的？?￥-〇11丨卩-?2]^1]1〇1凡，反转录合成反应液2以1^，加水至2541^， Taq 聚合酶 0 · 5yL; 94°C3 分钟；94°C40s，55°C40s，72°C lmin，循环 35 次；72°C lOmin; 4°C 保存； 所述PPV-chip-Pl的序列：
[0135] 5'-CCCATTTTCACRCCAGCARC-3' Tm = 61.8;其中R表示碱基G或者A;
[0136] 所述PPV-chip_P2的序列为：
[0137] 5'-TCGCATGATCCAACAATGGC-3' Tm = 59.8。
[0138] C、芯片预处理：
[0139] 点样仪中干燥好芯片于65°C烘箱中固定lh，将芯片点有DNA的一面在60°C水浴锅 上水合10s，芯片距水面距离2-3cm，在空气中室温自然干燥后，再进行一次水合，之后将点 有探针的一面朝上，放在紫外交联仪中250mJ交联，后再将芯片放在42°C预热的0.5%SDS中 洗涤lOmin，再用42°C预热的蒸馏水清洗4min，最后用无水乙醇清洗2min，2000rpm离心5min 去除芯片表面的液体后，密封，室温保存备用；
[0140] D、芯片的杂交：
[0141] 制备好芯片放置在杂交盒中，将标记样品与杂交液的混合物混匀后，3000rpm，离 心30s，于95°C沸水中变性处理3min，冰浴骤冷lmin，然后用移液器将杂交混合液分别加注 到杂交芯片的盖片上的小孔中，使预杂交液覆盖于点样区，然后盖紧杂交盒的盖，放入42°C 的水浴中，杂交2h，使样品与探针充分混合；其中配制10uL杂交液包括100 %甲酰胺5uL， 10%SDS 0.2uL，20X SSC 1.5uL，PCR样品标记物3.3uL。
[0142] E、芯片的清洗：
[0143] 杂交结束后，在暗室内取出芯片，杂交面朝上放于清洗盒中，放在水平摇床上用42 °〇预热洗液1清洗4min，以便洗去没有与探针特异性结合的样品;然后迅速地用镊子将芯片 转移到盛放有洗液2的清洗盒中，杂交面朝上，放在水平摇床上用42°C预热洗液1清洗4min， 清洗结束后，1500rpm，lmin离心干燥，除去玻璃表面上的液体；
[0144] F、芯片的扫描分析
[0145] 步骤E清洗完毕4小时内进行扫描，利用基因芯片激光共聚焦扫描仪扫读芯片信 息;具体做法:先打开扫描软件，然后开仓，将芯片插入机器内，关仓，使用绿色荧光通道，先 使用4伪彩进行预扫一次，以便选择扫描区域，再进行精扫，扫描参数为扫描分辩率为ΙΟμπι， 激发光源波长532nm，接收的荧光信号中心波长570nm，检测灵敏度小于一个荧光分子/um2， 激光功率值Laser Power 100%，光电倍增管效率值PMT Gain 600〇
[0146] G、数据处理与结果判定
[0147] 扫描后图像将通过判读软件自动进行分析，通过比较分析信号中位值和信号平均 值的输出数据，以其中最能反应本试验芯片杂交图像信息的参数值进行结果分析，当芯片 上呈现绿色信号且HEX质控信号呈现绿色信号时即可判定阳性反应，对于反应强烈的可以 直接从扫描图片上荧光的反应判断检测结果。
[0148] 实施例4
[0149] -种基因芯片的制备方法，包括以下步骤：
[0150] A、制备基因芯片点样：
[0151] 取5ul纯化探针，加点样液5ul混匀，探针浓度为ΙΟμπι;加到点样仪，将寡核苷酸探 针点在醛基玻片上，并通过探针5 '末端的氨基基团进行共价固定；
[0152] 其中所述探针包括：
[0153] PPV-D:5 '-CAAC