常见恶性肿瘤易感基因检测芯片的制作方法
【专利摘要】本发明公开了常见恶性肿瘤易感基因检测芯片，包括步骤：1）提取受检者样本DNA；2）对样本DNA进行目的基因的PCR扩增、纯化、片段化及荧光素标记；3）荧光素标记的PCR产物进行基因芯片杂交，检测目的基因的SNP位点；4）根据步骤3）得到的基因分型结果，分析受检者对乳腺癌、肺癌、胃癌、前列腺癌、胰腺癌、膀胱癌、肝癌、白血病、食管癌、结直肠癌的易感性。通过相关基因分型，可以对受检者进行常见恶性肿瘤的易感性评估，从而制订最科学的个性化保健计划，以避免、延缓甚或避免恶性肿瘤的发生。
【专利说明】常见恶性肿瘤易感基因检测芯片
【技术领域】
[0001]本发明涉及一常 见恶性肿瘤易感基因检测芯片，特别是涉及一种恶性肿瘤易感性测评及套组方法。
【背景技术】
[0002]2008年，全球有1270万人患癌，死亡人数高达760万。世界范围内因恶性肿瘤死亡的人数，比艾滋病、疟疾和结核病加起来还要多。如果不采取有效措施，预计到2030年，每年将出现2600万新增恶性肿瘤病例，恶性肿瘤死亡人数将达到1700万，中低收入国家将成为恶性肿瘤肆虐的“重灾区”。
[0003]近几年肿瘤的发病率和死亡率居高不下，就我国而言，恶性肿瘤已成为居民的第二位死因，城市居民的首位死因。在全球范围内，我国的恶性肿瘤发病率与美国、英国、法国接近，高于多数亚洲国家。肺癌、肝癌、结直肠癌、乳腺癌、膀胱癌死亡率及其构成呈明显上升趋势，其中肺癌和乳腺癌上升幅度最大，肺癌已代替肝癌成为我国首位恶性肿瘤死亡原因(占全部恶性肿瘤死亡的22.7%)。
[0004]已经掌握了关于恶性肿瘤病因及预防和管理恶性肿瘤的干预措施的大量知识。通过实施以证据为基础的恶性肿瘤预防、早期发现和恶性肿瘤患者管理战略，可使恶性肿瘤得以减少和控制。
[0005]烟草使用、饮酒、不健康的饮食以及缺乏运动是全世界恶性肿瘤的主要危险因素。同时遗传因素也是恶性肿瘤一个重要危险因素。因外部环境我们可以掌控，而内部因素一遗传因素(易感基因)我们是无法掌控。因此要从根本上预防恶性肿瘤的发生、延缓恶性肿瘤的发展和制订合理的疾病治疗措施，就必须检测这些疾病的易感基因。基因检测的积极意义体现在癌症发生之前就可以发现潜在的风险，从而提起人们对自身健康与疾病的关注，进而通过“个性化健康管理”指导受检者采取有效的方法预防。
【发明内容】
[0006]本发明要解决的技术问题是提供常见恶性肿瘤易感基因检测芯片，通过对这些基因中的关键性基因遗传位点进行检测，判断具体基因型，能够评估个体患上恶性肿瘤的风险几率，从而对加强恶性肿瘤防治起到积极作用。
[0007]为解决上述技术问题，本发明的常见恶性肿瘤易感基因检测芯片，包括步骤:
[0008]1)提取受检者样本DNA ；
[0009]2)对样本DNA进行遗传变异的PCR扩增、纯化、片段化及荧光素标记，所述遗传变异包括:rs505922、rs2294008、rs2279744、rs738409、rs2274223、rs667282、rs6983267 和rs22311420
[0010]3)荧光素标记的PCR产物进行基因芯片杂交，检测遗传变异，所述遗传变异包括:rs505922、 rs2294008、 rs2279744、 rs738409、 rs2274223、 rs667282、 rs6983267 和rs22311420[0011]4)根据步骤3)得到的基因分型结果，分析受检者肿瘤个性化治疗的疗效。
[0012]所述步骤2)中的rs505922的引物是SEQ ID NO:1~2所示序列的引物、rs2294008的引物是SEQ ID N0:3~4所示序列的引物、rs2279744的引物是SEQ ID N0:5~6所示序列的引物、rs738409的引物是SEQ ID N0:7~8所示序列的引物、rs2274223的引物是SEQ ID N0:9~10所示序列的引物、rs667282的引物是SEQ ID NO: 11~12所示序列的引物、rs6983267的引物是SEQ ID NO: 13~14所示序列的引物、rs2231142的引物是SEQ IDNO: 15~16所示序列的引物。
[0013]所述步骤2)中的片段化是将纯化的PCR产物经测定浓度后，用DNase I进行片段化；所述荧光素标记是将片段化PCR产物利用脱氧核苷酸转移酶在3’末端进行荧光素标记。
[0014]所述步骤3)基因芯片的制备是将预先设计并合成好的探针通过接触式点样或喷墨式点样点载到玻片或硅片材质的固相载体片基上，其中，探针是SEQ ID N0:17~SEQ IDNO: 32所示序列的DNA探针。
[0015]本发明中的基因和SNP位点的理论依据:
[0016]rs505922与人体的ABO血型相关，而人体ABO血型与胰腺癌相关。
[0017]rs2294008是PTSA基因上的多态性位点，PTSA是前列腺癌标志性基因。今年来的研究发现这个基因也与其它多种肿瘤的发生相关。
[0018]rs2279744是MDM2基因上的一个多态性位点。MDM2是P53抑癌基因调控网络中一员，其功能异常几乎与所有癌症发生发展相关。
[0019]rs738409是PNPLA3基因上的一个多态性位点。PNPLA3功能异常与肝硬化和肝癌相关。
[0020]rs2274223是PLCEl基因上的一个多态位点。PLCEl可以调节细胞生长，分化，凋亡和血管发生，其功能异常与多种肿瘤相关。
[0021]rs667282与吸烟成瘾相关，而吸烟是肺癌最主要的危险因素。
[0022]rs6983267位于MYC增强子中，影响其表达。MYC是癌基因，与很多肿瘤的发生发
展相关。
[0023]rs2231142是ABCG2基因上的一个多态位点。ABCG2与癌症耐药相关，但近年来研究发现，该基因也参与肿瘤形成。
[0024]本发明的有益效果:
[0025]通过相关基因分型，可以对受检者乳腺癌、肺癌、胃癌、前列腺癌、胰腺癌、膀胱癌、肝癌、白血病、食管癌、结直肠癌等常见恶性肿瘤的易感性进行预估，从而制订最科学个体化保健养生方案，以避免、延缓甚或避免恶性肿瘤的发生。
【专利附图】
【附图说明】
[0026]下面结合附图与【具体实施方式】对本发明作进一步详细的说明:
[0027]图1是多重PCR扩增后的电泳检测结果图；
[0028]图2是PCR产物片段化后的电泳检测结果图；
[0029]图3是检测芯片杂交结果图；【具体实施方式】
[0030] 实施例1:样本DNA的提取
[0031]【具体实施方式】
[0032]实施例1:样本DNA的提取
[0033]采用FlexiGene DNA Kit (QIAGEN，Cat.N0.51206)试剂盒抽提人外周血中基因组 DNA。
[0034]具体方法为:向300 μ I血液样本中加入750 μ I Buffer FG1，上下颠倒5次使其混匀。接着在12，000 rpm转速下离心I min。离心后倒掉上层清液,再加入150 μ IBuffer FG2&1.5 μ I蛋白酶溶液，立即振荡，直至沉淀完全溶解。接下来离心:3-5 S，然后65°C水浴5 min。当溶液从红色变为橄榄绿色后，加入150 μ I 100%异丙醇，上下充分颠倒离心管，使其混合，直至DNA析出，呈肉眼可见的线状或块状。然后在12，000 rpm转速下离心3 min。离心后倒掉上层清液，再加入150 μ I 70%乙醇，并振荡5 S。接着重新在12,000 rpm转速下离心3 min，离心后倒掉上层清液，自然风干沉淀，直至所有的液体都蒸发掉。最后向离心管中加入200 μ I Buffer FG3，振荡5 s，然后65°C水浴10 min，使DNA溶解。
[0035]使用ND-1000核酸浓度分析仪对所抽提的DNA定量。DNA工作液浓度校正至10ng/ μ 1，置于-20°c冰箱保存。
[0036]实施例2:芯片杂交检测SNP位点
[0037]1.基因芯片的制备
[0038](I)探针溶解
[0039]将SEQ ID NO: 16~SEQ ID NO: 32所示序列探针的每条探针用TE溶液稀释，终浓度为10 mM。将浓度为10 mM的探针与浓度为200 mM的PBS溶液于384孔板中等体积混合，以粘胶片封好384孔板，室温下振荡2分钟，离心，_20°C保存，以备点样使用。
[0040](2)点样
[0041]将预先设计并合成好的探针通过接触式点样或喷墨式点样点载到玻片、硅片等材质的固相载体片基上。片基米用Cell Associates CSS-100醒基片基，GeneMachine公司的Ominigrid 100型号的点样仪，在湿度:65-75%(以FullMoon片基为准)，温度为25°C的条件下点样，点样完毕后，放置半小时后，将芯片取出，室温干燥保存。
[0042]2.待测样品的处理和标记
[0043](1)目的基因的扩增
[0044]用rs505922 的引物(SEQ ID NO:1 ~2)、rs2294008 的引物(SEQ ID N0:3 ~4、rs2279744 的引物(SEQ ID NO:5 ~6)、rs738409 的引物(SEQ ID NO:7 ~8)、rs2274223 的引物(SEQ ID N0:9 ~10)、rs667282 的引物(SEQ ID NO: 11 ~12)、rs6983267 的引物(SEQID N0:13 ~14)、rs2231142 的引物(SEQ ID NO: 15 ~16)对样本 DNA 进行 PCR 扩增。PCR扩增用30 μ I反应体系进行，反应体系是0.3 mM dNTPUO mM Tris-HCl,50 mM KCl,2 mMMgCl2,20% Q solution (Qiagen)、上游和下游引物的浓度 0.16 μ M、基因组 DNA 10 ng,Taq 酶 0.6 U(Takara)。应用 Touch-down PCR 反应程序:94°C变性 5 min ;94°C变性 40 s,64°C退火I min，每个循环降低0.5°C，72°C延伸50 S，共10个循环；然后94°C变性40 s,59°C退火40 s，72°C延伸50 S，共30个循环；最后72°C延伸5 min。PCR结束后用1.5%琼脂糖凝胶检测扩增结果。
[0045]当进行多重PCR反应时，将SEQ ID NO:1~SEQ ID NO: 16所示序列的引物放入一个反应体系中进行扩增，体系为50 μ I。多重PCR的反应体系为:每种dNTP 0.3 μ mol/L,Tricine-KOH (PH=8.7) 40 mmol/L,KCl 16 mmol/L,MgCl2 3.5 mmol/L,BSA 3.75 μ g/ml,每条引物 2 μ mol/L, DNA 80 ng 和 2.2XTitanium Taq DNA 聚合酶(Clontech, USA)。多重PCR反应条件:95°C变性3 min ;95°C变性30s，66°C退火2 min，68°C延伸4 min，共40个循环；最后68°C延长10 min。PCR扩增后，取3 μ I PCR反应产物做琼脂糖凝胶电泳，这些PCR产物经处理后可用于下面的杂交步骤。
[0046](2) PCR产物纯化和片段化
[0047]每个样品的所有PCR 产物混合,用 QIA quick PCR Purification Kit (Qiagen,Cat.N0.28106)纯化。纯化的PCR产物经测定浓度后，用DNase I (脱氧核糖核酸酶I)进行片段化。片段化的反应体系包括:30 μ I纯化PCR产物(10 μ g)，4 μ I的10Χ DNaseI缓冲液，0.12 μ I的DNase 1,5.88 μ I的ddH20。反应条件为37°C温浴5 min，然后95°C15 min。片段化后的产物跑4%琼脂糖凝胶，保证绝大多数的片段处于30-200个碱基对。
[0048](3)荧光素标记
[0049]利用脱氧核苷酸转移酶在3’末端进行荧光素标记，标记的40 μ I反应体系包括:25 μ I片段化PCR产物，8 μ I的5 X脱氧核苷酸转移酶缓冲液，I μ I的CY3-N6-ddCTP(I mM),3 μ I的脱氧核苷酸转移酶(20 U/μ 1),3 μ I的ddH20。反应条件为37°C温浴120min,然后 95°C加热 15 min。
[0050]3.杂交、洗涤和结果检测
[0051]荧光标记的PCR产物95°C变性10 min，立即置于冰上，用于杂交，杂交反应20 μ I体系包括:荧光素标记的 PCR 产物 15 μ 1,20X SSPE 1.2 μ 1,1% Triton 0.2 μ 1,10XDenhandts 0.9 μ 1，甲酰胺 0.5 μ l,ddH20 2.2 μ I。反应条件为 48°C温浴 120 min，然后相继用IX洗涤缓冲液I (5X SSC,0.1% SDS)、1X洗涤缓冲液II (2X SSC,0.1% SDS)和IX洗涤缓冲液III (IX SSC)在42°C各洗涤10 min，最后用ddH20洗涤0.5 min。
[0052]洗涤后的芯片，经甩干后，用GenePix 4000B共聚焦激光扫描仪进行扫描(也可以用其他的激光扫描仪)。扫描杂交后的芯片得到杂交结果，再用GenePix Pro处理图像得到数据文件，然后对数据文件进行分析就可以得到受检者对抗肿瘤药物疗效和毒副作用的预测结果。
[0053]实施例4:疗效预估
[0054]样本:受检者(男性，41岁)
[0055]按照实施例1-3的检测操作流程进行检测，其中，该受检者目的基因多重PCR扩增后的电泳检测结果见图1，PCR产物片段化后的电泳检测结果见图2，检测芯片杂交结果见图3。将基因芯片检查结果导入分析软件获得受检者常见恶性肿瘤的易感性评估。该受检者对肺癌和肝癌的易感性较高，需严控吸烟和饮酒。
[0056]序列表
[0057]<110>泰州医药城博奥邦科生物科技有限公司
[0058]<120>常见恶性肿瘤易感基因检测芯片
[0059]〈130〉 NP-10-11245[0060]〈160〉 58
[0061]〈213〉物种:人
[0062]<400> 序列:
[0063]ttgactgggt caagatgtat cc22
[0064]〈212〉类型:DNA
[0065]〈211〉长度:22
[0066]序列编号:I
[0067]〈213〉物种:人
[0068]<400> 序列: [0069]cacgggaaaa caggtttgg21
[0070]〈212〉类型:DNA
[0071]〈211〉长度:19
[0072]序列编号:2
[0073]〈213〉物种:人
[0074]<400> 序列:
[0075]atatggccct gggtaggctc t21
[0076]〈212〉类型:DNA
[0077]〈211〉长度:21
[0078]序列编号:3
[0079]〈213〉物种:人
[0080]<400> 序列:
[0081]ATCMCAGGG CMGCAGCAC21
[0082]〈212〉类型:DNA
[0083]〈211〉长度:20
[0084]序列编号:4
[0085]〈213〉物种:人
[0086]<400> 序列:
[0087]cgggagttca gggtaaaggt22
[0088]〈212〉类型:DNA
[0089]〈211〉长度:20
[0090]序列编号:5
[0091]〈213〉物种:人
[0092]<400> 序列:
[0093]cagctggaga caagtcagga20
[0094]〈212〉类型:DNA
[0095]〈211〉长度:20
[0096]序列编号:6
[0097]〈213〉物种:人
[0098]<400> 序列:
【权利要求】
1.常见恶性肿瘤易感基因检测芯片，包括步骤: 1)提取受:检者样本DNA； 2)对样本DNA进行遗传变异的PCR扩增、纯化、片段化及荧光素标记，所述遗传变异包括:rs505922、rs2294008、rs2279744、rs738409、rs2274223、rs667282、rs6983267 和rs2231142 ； 3)荧光素标记的PCR产物进行基因芯片杂交，检测目的基因的SNP位点； 4)根据步骤3)得到的基因分型结果，分析受检者对抗肿瘤药物的疗效和毒副作用。
2.如权利要求1所述的常见恶性肿瘤易感基因检测芯片，其特征在于:所述步骤2)中的rs505922的引物是SEQ ID N0:1~2所示序列的引物、rs2294008的引物是SEQID N0:3~4所示序列的引物、rs2279744的引物是SEQ ID NO:5~6所示序列的引物、rs738409的引物是SEQ ID NO: 7~8所示序列的引物、rs2274223的引物是SEQ ID NO: 9~10所示序列的引物、rs667282的引物是SEQ ID NO: 11~12所示序列的引物、rs6983267的引物是SEQ ID NO:13~14所示序列的引物、rs2231142 的引物是SEQ ID NO: 15~16所示序列的引物。
3.如权利要求1所述的常见恶性肿瘤易感基因检测芯片，其特征在于:所述步骤2)中的片段化是将纯化的PCR产物经测定浓度后，用DNase I进行片段化； 所述荧光素标记是将片段化PCR产物利用脱氧核苷酸转移酶在3’末端进行荧光素标记。
4.如权利要求1所述的常见恶性肿瘤易感基因检测芯片，其特征在于:所述步骤3)基因芯片的制备是将预先设计并合成好的探针通过接触式点样或喷墨式点样点载到玻片或硅片材质的固相载体片基上，其中，探针是SEQ ID NO: 17~SEQ ID NO:32所示序列的DNA探针。
5.如权利要求1或4所述的检测芯片，其特征在于，所述探针为DNA、RNA、DNA-RNA嵌合体、PNA或其衍生物。
6.如权利要求2所述的引物，其特征在于，所述引物含有SEQID NO:1~SEQ ID NO: 16所示序列的核苷酸链或其互补链。
7.如权利要求1所述的常见恶性肿瘤易感基因检测芯片，其特征在于:所述步骤4)中的基因分型结果根导入分析软件对受检者常见恶性肿瘤的易感性进行评估。
8.如权利要求1或7所述的常见恶性肿瘤易感基因检测芯片，其特征在于:所述常见恶性肿瘤包括乳腺癌、肺癌、胃癌、前列腺癌、胰腺癌、膀胱癌、肝癌、白血病、食管癌和结直肠癌。
【文档编号】C12Q1/68GK103898197SQ201210570393
【公开日】2014年7月2日 申请日期:2012年12月25日 优先权日:2012年12月25日
【发明者】郜恒骏, 张可浩, 张新, 盛海辉 申请人:泰州医药城博奥邦科生物科技有限公司