专利名称：高血压相关基因的制作方法
技术领域：
本发明为一种新的大鼠和人的高血压相关基因(HRG-1)及用途，涉及生物医学高技术领域。
高血压相关基因有多种，目前已克隆出并公布的基因有血管紧张素原、血管紧张素转移酶、内皮素、一氧化氮合成酶等。高血压是一种多基因疾病，涉及到许多基因的变化，有些基因甚至更重要的基因尚待克隆。目前世界各国都在大力寻找和克隆新相关基因。克隆这些基因，不仅具有重要理论意义，而且对寻找新高血压药物，进行临床治疗亦具有重要价值。
本发明的目的在于寻找和克隆一种新的高血压和细胞增殖相关基因和编码蛋白质。
本发明的内容是应用分子克隆、聚合酶链式反应(PCR)、核苷酸测定技术及5′和3′核苷酸延伸等技术克隆大鼠高血压相关基因互补脱氧核糖核酸(cDNA)全长序列、大鼠高血压相关基因的蛋白质序列以及人高血压相关基因的cDNA和编码蛋白质序列。
该基因达到的技术指标为(1)大鼠HRG-1全长cDNA为4160bp，其阅读框架为1983bp，可编码661氨基酸，其全长cDNA和编码氨基酸见表1。
(2)人HRG-1编码cDNA长约1983bp，可编码661氨基酸，其cDNA和编码氨基酸序列见表2。和大鼠的HRG-1有96％的同源性见表3。
(3)人和大鼠HRG-1纯化蛋白质的分子量为66KDa，等电点为5.99，它含有蛋白激酶A(PKA)和蛋白激酶C(PKC)的结合位点，以及多个糖基化位点。PKA可使其磷酸化。
(4)人和大鼠HRG-1不仅存在于VSMC中，亦分布在心、肝、脑、肾、肺等组织中。它在正常细胞和组织中高表达，在高血压和增生的平滑肌细胞(VSMC)及一些肿瘤细胞中低表达。
本发明的优点及用途如下(1)将HRG-1导入增生平滑肌细胞(VSMC)和肿瘤细胞可以明显抑制细胞的增殖和DNA合成。
(2)丝裂素活化蛋白激酶(MAPK)是细胞内一个新的信息传递体，一些细胞因子和生物活性物质可以促进和调节其表达。HRG-1是PKA的底物，可抑制MAPK的活性，因而具有抑制细胞增殖和肿瘤细胞生长的作用，在心血管疾病和肿瘤发病中可能具有重要意义。
(3)本基因及其相关cDNA编码蛋白质，是一种细胞内新的信息传递体，是PKA磷酸化的底物，可以抑制MAPK的活性。
(4)本基因及其相关cDNA和编码蛋白质，可以抑制血管平滑肌细胞和肿瘤细胞的增殖和生长，在细胞增殖和分化中具有重要作用。可发展成为临床心血管病和肿瘤的新的诊断和检验指标。
(5)本基因及其相关cDNA的编码蛋白质在心血管疾病发病和肿瘤生长中具有重要作用。可用于包括动脉粥样硬化、高血压、再狭窄等以VSMC增生为主要病理基础的心血管病，和一些肿瘤的基因治疗、生物治疗和药物治疗。
(6)本基因及其相关cDNA和编码蛋白质是一种与细胞增殖、生长相关的重要的细胞内新的信息传递体。一些药物、内源性活性物质可以诱导或抑制其表达，可作为筛选治疗心血管病和肿瘤的一个指标，用于筛选新药物。
实施例(1)取培养自发性高血压大鼠(SHR)和正常血压大鼠(WKY)的血管平滑肌细胞，提取总RNA，进行差异筛选(RNA mapping)。
(2)选择SHR/WKY RNA mapping有差异的条带，进行克隆和核苷酸序列测定。
(3)将测序结果送国际基因数据库(GenBank)查询，选择无同源性序列，作为探针(Probe)，在大鼠主动脉的cDNA文库中，筛选阳性克隆，进行测序。最先获得1450个bp的部分cDNA。
(4)应用克隆到的部分cDNA为模板，采用5′和3′核苷酸延伸技术(RACESystem)逐级向3′和5′延伸，获得全长cDNA(rHRG-1)和编码氨基酸序列。
(5)以大鼠HRG-1部分序列，从人肾cDNA文库中，应用分子克隆方法提取和克隆人的HRG的cDNA，并获得编码序列。
(6)应用人和大鼠编码核苷酸序列，根据基因克隆方法，构建原核和真核表达载体，在大肠杆菌中表达出蛋白质，并经层析和纯化，获得人的HRG-1蛋白质，并免疫兔，制备出多克隆抗体。
(7)应用HRG-1真核表达载体及其纯化的蛋白质和抗体，转导血管平滑肌细胞、肿瘤细胞，研究其功能。
(8)应用获得的rHRG-1和hHRG-1的cDNA作为探针，进行Northern blot分析，研究该基因在体内的分布，及其在心血管系统、肿瘤组织中的表达，观察它在心血管病和肿瘤发病中的作用。
表1Complete Sequence of rHRG-1 cDNA
102030405060| | | | |1 CGCGAGGCCGGGAAGGTGAAGTTCAGACAGGTGGAGTCAACACCATCAGTAGCCAATCTG61 GACCTGAATCGGCACAGAGGAGACCTCAAGTTCTTTTCATCTTTTTGACTCCAGCCATGT121 CCATGATGCCCAACCTGTGAAGGTCCCTTACCAGCTAGAAACGAGATGTCCCTGCTCTTT181 TCTCGATGCAACTCCATCGTCACCGTCAAGAAGGATAAGCGACACATGGCTGAGGTGAAT241 GCTTCCCCTCTCAAGCACTTTGTCACTGCCAAGAAAAAGATCAATGGCATCTTTGAGCAG301 CTGGGGGCCTACATCCAAGAGAGTGCCGGCTTCCTTGAAGACACCCACAGGAATACAGAA361 CTGGACCCAGTTACTACAGAAGAGCAGGTCCTGGATGTCAAAGGGTACTGTCCAAGGTCA421 GGGGAATCAGCGAGGTGCTGGCCAGGCGGCACATGAAGGTGGCTTTTTTTGGCCGGACGA481 GCAATGGGAAGAGCACCGTGATCAATGCCATGCTTTGGGACAAAGTTCTGCCATCTGGGA541 TTGGCCACACCACCAATTGCTTCCTGCGGGTTGGGGGCACGGATGGCCACGAGGCCTTCC601 TCCTCACGGAGGGCTCAGAAGAGAAGAAGAGTGTCAAGACCGTGAACCAGCTAGCCCATG661 CCCTCCATCAGGATGAGCAGCTGCATGCAGGCAGCCTGGTGAGTGTGATGTGGCCCAACT721 CCAAGTGTCCACTTCTGAAGGATGACCTCGTGCTGATGGACAGCCCTGGGATCGATGTCA781 CCACGGAGCTGGACAGCTGGATTGATAAGTTTTGCCTGGATGCTGATGTGTTTGTACTGG841 TGGCCAACTCAGAGTCCACGCTGATGCAGACGGAGAAGCAGTTCTTCCACAAAGTGAGTG901 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FCTGGGCCCCAAGAACAGCCGTCGGGCCTTGATGGGCTACAATGACCAGGTCCAGCGTCCCL G P K N S R R A L M G Y N D Q V Q R PATCCCTCTGACGCCAGCCAACCCCAGCATGCCCCCACTGCCACAGGGCTCGCTCACCCAGI P L T P A N P S M P P L P Q G S L T QGAGGAGTTCATGGTTTCCATGGTTACCGGCCTGGCCTCCTTGACATCCAGGACCTCCATGE E F M V S M V T G L A S L T S R T S MGGCATTCTTGTTGTTGGAGGAGTGGTGTGGAAGGCAGTGGGCTGGCGGCTCATTGCCCTCG I L V V G G V V W K A V G W R L I A LTCCTTTGGGCTCTATGGCCTCCTCTACGTCTATGAGCGTCTGACCTGGACCACCAAGGCCS F G L Y G L L Y V Y E R L T W T T K AAAGGAGAGGGCCTTCAAGCGCCAGTTTGTGGAGCATGCCAGCGAGAAGCTGCAGCTTGTCK E R A F K R Q F V E H A S E K L Q L VATCAGCTACACTGGCTCCAACTGCAGCCACCAAGTCCAGCAGGAACTGTCTGGGACCTTTI S Y T G S N C S H Q V Q Q E L S G T FGCTCATCTGTGCCACCAAGTCGTCATCACGCGGGACAATCTGGACCAGGAAATTGCTGCCA H L C H Q V V I T R D N L D Q E I A AATGAACAAGAAAGTAGACGCACTCGATTCACTACATAGCAAAGCGAAATTCCTCAGCAATM N K K V D A L D S L H S K A K F L S NAAAGCTGCGTGGTTCGACAGCGAACTCAACACGTTCATACAGCAGTACCTGCAGCCCAGCK A A W F D S E L N T F I Q Q Y L Q P SAGATAG 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1.本发明涉及一种高血压相关基因，其特征在于大鼠高血压相关基因(HRG-1)互补脱氧核糖核酸(cDNA)全长为4160bp，其阅读框架为1983bp，可编码661个氨基酸组成蛋白质。人HRG-1 cDNA阅读框架为1983bp，可编码661个氨基酸组成蛋白质。人和大鼠HRG-1有高度同源性。
2.根据权利要求1所述之高血压相关基因，其特征在于人和大鼠HRG-1纯化蛋白质的分子量为66KDa，等电点为5.7-6.2。
3.根据权利要求1、2所述之高血压相关基因，其特征在于含有蛋白激酶A(PKA)和蛋白激酶C(PKC)的结合位点，以及多个糖基化位点。
4.根据权利要求1、2、3所述之高血压相关基因，其特征在于该基因可抑制血管平滑肌细胞(VSMC)和肿瘤细胞的增殖和生长，可用于包括动脉粥样硬化、高血压、再狭窄等以VSMC增生为主要病理基础的心血管病以及肿瘤的基因治疗、生物治疗和药物治疗。也可用于筛选新的药物。可用于心血管及肿瘤的诊断及检验指标。
全文摘要
本发明涉及一种新的大鼠和人的高血压相关基因(HRG－1),包括大鼠高血压相关基因互补脱氧核糖核酸(cDNA)的序列和编码蛋白质的氨基酸序列。该基因编码的蛋白质是蛋白激酶A(PKA)的底物,可以通过抑制丝裂素活化蛋白激酶(MAPK)的活性,而抑制血管平滑肌细胞和肿瘤细胞的增殖与生长,可用于肿瘤和心血管病的治疗,也可用于筛选治疗心血管病和肿瘤的新药物,并可作为一种临床诊断的指标。
文档编号A61K38/17GK1181420SQ9712165
公开日1998年5月13日 申请日期1997年11月21日 优先权日1997年11月21日
发明者汤健, 陈光慧 申请人:北京医科大学