高血压易感基因组的鉴定的制作方法
【专利摘要】本申请涉及高血压易感基因组的鉴定。本发明提供包含能够用于判定高血压发病的风险的SNP的遗传标记、能够作为用于检测该遗传标记的引物或探针使用的多核苷酸、使用该SNP的高血压发病风险判定方法、用于该SNP的分型的微阵列及用于该高血压发病风险判定方法的试剂盒。
【专利说明】高血压易感基因组的鉴定
[0001]本申请是申请日为2009年2月20日、申请号为200980114066.0、发明名称为“高
血压易感基因组的鉴定”的申请的分案申请。
【技术领域】
[0002]本发明涉及包含能够用于判定高血压发病风险的SNP的遗传标记、能够作为用于检测该遗传标记的引物或探针使用的高血压发病风险判定用多核苷酸、使用该SNP的高血压发病风险判定方法、用于该SNP的分型的高血压发病风险判定用微阵列、及用于该高血压发病风险判定方法的试剂盒等。
[0003]本申请要求2008年2月21日在日本申请的日本特愿2008-040208号的优先权，并将其内容援引于此。
【背景技术】
[0004]高血压是例如冠状动脉疾病、脑中风、慢性肾病等的主要发病原因，高血压的预防在社会和公共卫生上是很重要的。高血压是通过很多原因而诱发发病的多因素疾病，将这些诱发高血压的原因称作危险因素(风险因素，risk factor)。高血压的危险因素主要大致分为环境因素和遗传因素，认为它们的相互作用发挥着重要的作用。
[0005]危险因素中，作为环境因素，例如可列举出年龄的增长、肥胖、压力、过量摄取盐分等。另一方面，作为遗传因素，已知有各种高血压易感基因。这里，“高血压易感基因”是指，由于具有所述基因而引发高血压的危险率上升的基因。也就是说，可判断的是，具有高血压易感基因的人与不具有高血压易感基因的人相比，更容易罹患高血压。并且认为，在高血压那样的多因素疾病中，其易感基因很多是表现为单核苷酸多态性(SNP)等多态性的等位基因(等位基因)。
[0006]迄今为止，作为含有基因多态性的高血压易感基因，报告有血管紧张素原、α-内收蛋白、β 2肾上腺素受体、糖蛋白Ia (GPIa)、趋化因子受体2 (CCR2)、载脂蛋白C (ApoC-1II )、G-蛋白β3亚基(GP0 3)、肿瘤坏死因子a (TNF α )、胰岛素受体底物I(IRS-1)、糖蛋白 Iba (GPIba )、C-型利钠肽(CNP)、血红素氧合酶 I (ΗΜ0Χ-1 )、SCNNlA 等各种基因(例如参照专利文献I~4。)。此外，近年来，报告了 CYP17基因(rs6162)多态性、EX0SC3 基因(rs7158)多态性、ACCNl 基因(rs28933)多态性、KCNMB4 基因(rs710652)多态性、KCNIP2基因(rS755381)多态性、ATP2A3基因(rs887387 )多态性、RAC2基因(rs929023)多态性、CD3EAP 基因(rs967591)多态性、CALCR 基因(rsl042138)多态性、ATPlOD 基因(rsl058793)多态性、GNA14 基因(rsl801258)多态性、PTHRl 基因(rsl869872)多态性、ATP2B1 基因(rs2070759)多态性、HLA-DMB 基因(rs2071556)多态性、SLC13A1 基因(rs2140516)多态性、SLC2A11 基因(rs2236620)多态性、GNAI2 基因(rs2236943)多态性、CACNA2D2 基因(rs2236957)多态性、PRKffNKl 基因(rs2255390)多态性、SLC22A7 基因(rs2270860)多态性、KCNNl 基因(rs2278993)多态性、SLC21A6 基因(rs2291075)多态性、CACNA1E 基因(rs2293990)多态性、SLC26A8 基因(rs2295852)多态性、ERCCl 基因(rs2298881)多态性、DLGAP2 基因(rs2301963)多态性、C0L4A1 基因(rs2305080)多态性、⑶CAlC 基因(rs2715709)多态性、ATPlOC 基因(rs3736186)多态性、HCN4 基因(rs3743496)多态性、PTPRT基因(rs3746539)多态性、FGF2基因(rs3747676)多态性、CHGA基因(rs3759717)多态性、PPP1R1B 基因(rs3764352)多态性、ADORAl 基因(rs3766554)多态性、RGS19IP1基因(rs3815715)多态性、RGS20基因(rs3816772)多态性有望作为高血压易感基因多态性(例如参照专利文献5。)。
[0007]高血压的治疗是为了防止由高血压诱发的冠状动脉疾病等的发病而以降低血压为目的。治疗方法主要大致分为通过改善饮食生活等生活习惯来减轻高血压的危险因素、和降压治疗剂的给药疗法。通常，判断各患者的风险，根据该判定结果和实际的血压，决定降压目标和治疗方法。例如，首先，将收缩期血压/舒张期血压为140~159/90~99mmHg分类为轻症高血压，将160~179/100~109mmHg分类为中症高血压，将兰180/ ^ IlOmmHg分类为重症高血压后，考虑除血压以外的危险因素而判断风险。例如，将为轻症高血压且不具有其他危险因素的患者判断为低风险组，将为轻症高血压且具有一些危险因素的患者判断为中等风险组，将为轻症闻血压但具有糖尿病等危险性闻的危险因素的患者判断为闻风险组。通常，为低风险组和中等风险组时，首先，进行一定时期的生活习惯的改正，其后在血压没有充分降低的情况下进行给药疗法，但对于高风险组的患者，与一定时期的生活习惯的改正同时进行给药疗法。即，即使血压为相同程度，也未必是相同的治疗方法，根据各患者的风险而适当选择治疗方法。因此，正确评价高血压发病的风险是非常重要的。
[0008]大部分的危险因素各自单独未必是高血压发病的诱因。特别是作为遗传因素的高血压易感基因的情况下，认为是所具有的多个高血压易感基因相互影响，结果诱发了高血压。因此，在高血压发病的风险评价中，所具有的高血压易感基因的数量越多，则判断为越高风险组。因此认为，通过调查尽可能多的高血压易感基因的有无，从而能够更准确地评价高血压发病的风险，但已报告有很多高血压易感基因，对它们全部进行检查从评价的迅速性及经济性的观点出发并不优选。另外，该基因存在与否和高血压发病的相关性因高血压易感基因的不同而不同，因此，以相关性比较低的高血压易感基因作为风险评价的判断资料时，无法得到可靠性高的评价。
[0009]专利文献1:日本特开2004-222503号公报
[0010]专利文献2:日本特开2004-113094号公报
[0011]专利文献3:日本特开2004-33051号公报
[0012]专利文献4:日本特开2004-24125号公报
[0013]专利文献5:日本特开2007-143504号公报
【发明内容】
[0014]发明要解决的问题
[0015]即，为了准确地评价高血压发病的风险，优选使用与高血压易感基因高血压发病的相关性高的有用的高血压易感基因作为遗传标记，更优选组合使用现实中临床上能够测定的范围内的数个有用的高血压易感基因作为遗传标记。然而，对于迄今为止报告的高血压易感基因，虽然观察到了存在与否和高血压发病具有相关性，但相关的程度不充分，另外，几乎不存在能够进一步·提高风险评价的可靠性的高血压易感基因的组合。[0016]本发明的目的在于提供:包含存在与否和高血压发病的相关性充分高且能够用于高血压发病的风险判定的SNP的遗传标记、能够作为用于检测该SNP的引物或探针使用的高血压发病风险判定用多核苷酸、使用该SNP的高血压发病风险判定方法、用于该SNP的分型的高血压发病风险判定用微阵列、及用于该SNP的分型的高血压发病风险判定用试剂盒
等ο
[0017]用于解决问题的方案
[0018]本发明人等为了解决上述问题而进行了深入研究，结果发现，以从8924人采集的基因组DNA为对象，调查病例(高血压)组和对照(正常血压)组中的SNP的频率差并进行病例对照相关分析，结果是，ATP2B1基因和CYP11B2基因的SNP、特别是ATP2B1基因的SNP(rslll05378)、SNP (rs2681472)、SNP (rsl401982)、SNP (rslll05364)、CYP11B2 基因的SNP (rsl799998)作为高血压的遗传标记是非常有用的，进而，通过将选自由这些SNP、及AGT基因的SNP (rs699)所组成的组中的2种以上SNP组合，与各种SNP单独相比，能够更准确地判断高血压发病风险，从而完成了本发明。
[0019]即，本发明的第一方案提供一种高血压的遗传标记，其特征在于，由与包含ATP2B1基因的SNP (单核苷酸多态性)的ATP2B1基因的部分碱基序列或全部碱基序列相同或互补的序列构成，所述 SNP 为选自由 SNP (rslll05378)、SNP (rs2681472)、SNP (rsl401982)、及SNP (rslll05364)所组成的组中的I种以上。
[0020]另外，本发明的第二方案提供一种高血压发病风险判定用多核苷酸，其特征在于，其具有下述的(a)~(f)中任一碱基序列，且能够作为用于检测SNP (rslll05378)的引物或探针使用；(a)序列号5所示的碱基序列、或序列号5所示的碱基序列的包含SNP(rslll05378)的部分序列；(b)与所述(a)的碱基序列互补的碱基序列；(c)在所述(a)或(b)的碱基序列中除SNP (rslll05378)以外的I~数个碱基缺失、置换或添加而得到的碱基序列，且由该碱基序列构成的多核苷酸能够与由所述(a)或(b)的碱基序列构成的多核苷酸在严格的条件下杂交的碱基序列；(d)序列号6所示的碱基序列、或序列号6所示的碱基序列的包含SNP (rslll05378)的部分序列；(e)与所述(d)的碱基序列互补的碱基序列；Cf)在所述(d)或(e)的碱基序列中除SNP (rslll05378)以外的I~数个碱基缺失、置换或添加而得到的碱基序列，且由该碱基序列构成的多核苷酸能够与由所述(d)或(e)的碱基序列构成的多核苷酸在严格的条件下杂交的碱基序列。
[0021]另外，本发明的第三方案提供一种高血压发病风险判定用多核苷酸，其特征在于，其具有下述的(a)~(f)中的任一碱基序列，且能够作为用于检测SNP (rs2681472)的引物或探针使用；(a)序列号12所示的碱基序列、或序列号12所示的碱基序列的包含SNP(rs2681472)的部分序列；(b)与所述(a)的碱基序列互补的碱基序列；(c)在所述(a)或(b)的碱基序列中除SNP (rs2681472)以外的I~数个碱基缺失、置换或添加而得到的碱基序列，且由该碱基序列构成的多核苷酸能够与由所述(a)或(b)的碱基序列构成的多核苷酸在严格的条件下杂交的碱基序列；(d)序列号13所示的碱基序列、或序列号13所示的碱基序列的包含SNP (rs2681472)的部分序列；(e)与所述(d)的碱基序列互补的碱基序列；(f)在所述(d)或(e)的碱基序列中除SNP (rs2681472)以外的I~数个碱基缺失、置换或添加而得到的碱基序列，且由该碱基序列构成的多核苷酸能够与由所述(d)或(e)的碱基序列构成的多核苷酸在严格的条件下杂交的碱基序列。[0022]另外，本发明的第四方案提供一种高血压发病风险判定用多核苷酸，其特征在于，其具有下述的(a)~(f)中的任一碱基序列，且能够作为用于检测SNP (rsl401982)的引物或探针使用；(a)序列号19所示的碱基序列、或序列号19所示的碱基序列的包含SNP(rsl401982)的部分序列；(b)与所述(a)的碱基序列互补的碱基序列；(c)在所述(a)或(b)的碱基序列中除SNP (rsl401982)以外的I~数个碱基缺失、置换或添加而得到的碱基序列，且由该碱基序列构成的多核苷酸能够与由所述(a)或(b)的碱基序列构成的多核苷酸在严格的条件下杂交的碱基序列；(d)序列号20所示的碱基序列、或序列号20所示的碱基序列的包含SNP (rsl401982)的部分序列；(e)与所述(d)的碱基序列互补的碱基序列；(f)在所述(d)或(e)的碱基序列中除SNP (rsl401982)以外的I~数个碱基缺失、置换或添加而得到的碱基序列，且由该碱基序列构成的多核苷酸能够与由所述(d)或(e)的碱基序列构成的多核苷酸在严格的条件下杂交的碱基序列。
[0023]另外，本发明的第五方案提供一种高血压的遗传标记，其特征在于，其由与包含CYP11B2基因的SNP即SNP (rsl799998)的CYP11B2基因的部分碱基序列或全部碱基序列相同或互补的碱基序列构成。
[0024]另外，本发明的第六方案提供一种高血压发病风险判定用多核苷酸，其特征在于，其具有下述的(a)~(f)中的任一碱基序列，且能够作为用于检测SNP (rsl799998)的引物或探针使用；(a)序列号26所示的碱基序列、或序列号26所示的碱基序列的包含SNP(rs 1799998)的部分序列；(b)与所述(a)的碱基序列互补的碱基序列；(c)所述(a)或(b)的碱基序列中除SNP (rsl799998)以外的I~数个碱基缺失、置换或添加而得到的碱基序列，且由该碱基序列构成的多核苷酸能够与由所述(a)或(b)的碱基序列构成的多核苷酸在严格的条件下杂交的喊基序列 ；(d)序列号27所的喊基序列、或序列号27所的喊基序列的包含SNP (rsl799998)的部分序列；(e)与所述(d)的碱基序列互补的碱基序列；(f)在所述(d)或(e)的碱基序列中除SNP (rsl799998)以外的I~数个碱基缺失、置换或添加而得到的碱基序列，且由该碱基序列构成的多核苷酸能够与由所述(d)或(e)的碱基序列构成的多核苷酸在严格的条件下杂交的碱基序列。
[0025]另外，本发明的第七方案提供一种高血压发病风险判定方法，其特征在于，其是使用遗传标记来判断高血压发病风险的方法，其具有以下工序:(a)对由人个体采集的核酸的、选自由 SNP (rslll05378)、SNP (rs2681472)、SNP (rsl401982)、SNP (rslll05364)、及SNP (rsl799998)所组成的组中的I种以上进行分型的工序；(b)根据由所述工序(a)得到的分型结果来判断所述人个体的高血压发病风险的工序。
[0026]本发明的第七方案中，所述工序(a)进一步优选为对AGT基因的SNP即SNP(rs699)进行分型的工序。
[0027]另外，本发明的第八方案提供一种高血压发病风险判定用微阵列，其特征在于，在固相载体上固定有选自由本发明的第二、第三、第四、及第六方案的高血压发病风险判定用多核苷酸所组成的组中的I种以上。
[0028]本发明的第八方案中，优选进一步在所述固相载体上固定具有下述的(a)~(f)中的任一碱基序列、且能够作为用于检测SNP (rs699)的引物或探针使用的多核苷酸；(a)序列号33所示的碱基序列、或序列号33所示的碱基序列的包含SNP(rs699)的部分序列；(b)与所述(a)的碱基序列互补的碱基序列；(c)所述(a)或(b)的碱基序列中除SNP (rs699)以外的I~数个碱基缺失、置换或添加而得到的碱基序列，且由该碱基序列构成的多核苷酸能够与由所述(a)或(b)的碱基序列构成的多核苷酸在严格的条件下杂交的碱基序列；(d)序列号34所示的碱基序列、或序列号34所示的碱基序列的包含SNP (rs699)的部分序列；(e)与所述(d)的碱基序列互补的碱基序列；(f)所述(d)或(e)的碱基序列中除SNP(rs699)以外的I~数个碱基缺失、置换或添加而得到的碱基序列，且由该碱基序列构成的多核苷酸能够与由该所述(d)或(e)的碱基序列构成的多核苷酸在严格的条件下杂交的碱基序列。
[0029]另外，本发明的第九方案提供一种高血压发病风险判定用SNP分型试剂盒，其特征在于，其包含选自由本发明的第二方案的高血压发病风险判定用多核苷酸、本发明的第三方案的高血压发病风险判定用多核苷酸、本发明的第四方案的高血压发病风险判定用多核苷酸、本发明的第六方案的高血压发病风险判定用多核苷酸、及本发明的第八方案的高血压发病风险判定用微阵列所组成的组中的I种以上。
[0030]另外，本发明的第十方案提供一种高血压发病风险判定用SNP分型试剂盒，其特征在于，其包含选自由本发明的第二方案的高血压发病风险判定用多核苷酸、本发明的第三方案的高血压发病风险判定用多核苷酸、本发明的第四方案的高血压发病风险判定用多核苷酸、本发明的第六方案的高血压发病风险判定用多核苷酸、本发明的第八方案的高血压发病风险判定用微阵列、及具有下述的(a)~(f)中的任一碱基序列且能够作为用于检测SNP (rs699)的引物及探针使用的多核苷酸所组成的组中的I种以上；(a)序列号33所示的碱基序列、或序列号33所示的碱基序列的包含SNP (rs699)的部分序列；(b)与所述Ca)的碱基序列互补的碱基序列；(c)所述(a)或(b)的碱基序列中除SNP (rs699)以外的I~数个碱基缺失、置换或添加而得到的碱基序列，且由该碱基序列构成的多核苷酸能够与由所述(a)或(b)的碱基序列构成的多核苷酸在严格的条件下杂交的碱基序列；(d)序列号34所示的碱基序列、或序列号34所示的碱基序列的包含SNP (rs699)的部分序列；(e)与所述(d)的碱基序列互补的碱基序列；(f)所述(d)或(e)的碱基序列中除SNP (rs699)以外的I~数个碱基缺失、置换或添加而得到的碱基序列，且由该碱基序列构成的多核苷酸能够与由所述(d)或(e)的碱基序列构成的多核苷酸在严格的条件下杂交的碱基序列。
[0031]另外，本发明的第十一方案提供一种ATP2B1基因局部缺失小动物制作用1xP重组载体，其特征在于，其包含用1xP序列夹持ATP2B1基因的碱基序列的全部或一部分而成的碱基序列。
[0032]另外，本发明的第十二方案提供一种ATP2B1基因局部缺失小动物制作用1xP重组小动物，其特征在于，使用本发明的第十一方案的载体制作得到。
[0033]另外，本发明的第十三方案提供一种ATP2B1基因局部缺失小动物，其特征在于，其通过使选择性Cre表达转基因小动物与作为本发明的第十二方案的ATP2B1基因局部缺失小动物制作用1xP重组小动物交配而制得，所述选择性Cre表达转基因小动物以选自由下述启动子所组成的组中的一种启动子作为Cre重组酶(Cre Recombinase)的表达启动子:Tie-2启动子、Tie-1启动子、Flk-1启动子、SM22启动子、SM-MHC启动子、Wtl启动子、PO启动子、Pax3启动子、a MHC启动子、Nkx2.5启动子、Tbxl启动子、四环素诱导(tetracyclin·e-1nducible)启动子、及CMV增强子-鸡β -肌动蛋白(CMVenhancer-chicken β -actin)启动子。[0034]另外，本发明的第十四方案提供一种ATP2B1基因的局部缺失小动物的使用方法，其特征在于，使用作为本发明的第十三方案的ATP2B1基因局部缺失小动物作为用于筛选钙拮抗药的试验动物。[0035]发明的效果
[0036]作为本发明的第一方案和/或第五方案的高血压的遗传标记是包含存在与否和高血压发病的相关性充分高的SNP的遗传标记。因此，通过利用使用了本发明的高血压的遗传标记的本发明的第七方案即高血压发病风险判定方法，能够得到可靠性更高的判定结果O
[0037]另外，通过利用作为本发明的第二~第四方案及第六方案的高血压发病风险判定用多核苷酸、固定有该高血压发病风险判定用多核苷酸的作为本发明的第八方案的高血压发病风险判定用微阵列、具有该高血压发病风险判定用多核苷酸或该高血压发病风险判定用微阵列的作为本发明的第九方案和/或第十方案的高血压发病风险判定用SNP分型试剂盒中的任一者，从而能够准确且简便地检测作为本发明的高血压的遗传标记的SNP，能够高精度且有效地判定高血压发病风险。
【具体实施方式】
[0038]本发明中，“高血压”是指，全身的动脉压一过性或持续地高达可能诱发心血管系统障碍等障碍的水平的状态。高血压的具体的定义没有特别限定，例如根据日本高血压学会制定的《高血压治疗准则2004》(JSH2004)是指收缩期血压/舒张期血压为140/90mmHg以上的状态。除了在没有服用降压药等的状态下收缩期血压为HOmmHg以上、舒张期血压为90mmHg以上的情况以外,还包括收缩期血压不到140mmHg、但舒张期血压为90mmHg以上的情况，以及舒张期血压不到90mmHg、但收缩期血压为140mmHg以上的情况。另外，高血压主要大致分为原发性高血压和继发性高血压,90%以上被分类为原发性高血压，本发明中，优选原发性高血压。
[0039]本发明中，“高血压的遗传标记”是指成为高血压的遗传因素的标记的基因。本发明的闻血压的遗传标记包含SNP,作为其等位基因(等位基因)，包含闻血压易感基因。
[0040]本发明中，“高血压发病风险”是指高血压的易罹患性(容易患高血压的程度)。即，本发明中，某些人个体为高风险组是指推测该人个体诱发高血压的危险率高，为低风险组是指推测该人个体诱发高血压的危险率低。
[0041]本发明中，SNP优选注册于公共数据库的SNP，能够从其参考号(referencenumber)确定的 SNP。例如有通过 NCBI (National center for BiotechnologyInformation)的SNP数据库(dbSNP BHLD124)的参考号即rs号确定的SNP、通过东京大学医科学研究所整理的日本人的SNP的数据库JSNP (注册商标)(http://snp.1ms.u-toky0.ac.jp/index_ja.html)的参考号即 IMS-JST 号确定的 SNP 等。
[0042]作为本发明的第一方案的高血压的遗传标记包含SNP，作为等位基因，包含ATP2BI (ATPase，Ca2+运输，质膜I)基因。具体而言，其特征在于，作为ATP2B基因的SNP，由与包含选自由 SNP (rslll05378)、SNP (rs2681472)、SNP (rsl401982)、SNP (rslll05364)所组成的组中的I种以上的ATP2B1基因的部分碱基序列或全部碱基序列相同或互补的序列构成。该遗传标记所包含的ATP2B基因的SNP可以为I种，也可以为2种以上。例如，可以仅为 SNP (rslll05378)，可以仅为 SNP (rs2681472)，可以仅为 SNP (rsl401982)，也可以仅为 SNP (rslll05364)。另外，可以为 SNP (rslll05378)与 SNP (rs2681472)的组合，可以为 SNP (rslll05378)与 SNP (rsl401982)的组合，可以为 SNP (rs2681472)与 SNP(rsl401982)的组合，也可以为 SNP (rslll05378)、SNP (rs2681472)、SNP (rsl401982)与SNP (rsl 1105364)的组合。
[0043]ATP2B1是在正常血压组和高血压组中表达量显著增大的酶，ATP2B1基因是公知的高血压易感基因。据报道，人的ATP2B1基因(NCBI登录号:NC_000012)中，例如，启动子区域存在的SNP (rs2070759)在各多态性的高血压发病风险中存在显著差异(例如，参照专利文献5。)等，但该结果的显著性并不足以用于诊断。另一方面，据报道，在原发性高血压患者44名(病例组)和正常血压者40名(对照组)中，对于ATP2B1基因的所有22个外显子进行了 SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism,单链构象多态性)分析和HTX (Heteroduplex，异质性双链构象多态性)分析，结果尽管灵敏度为100%，但在病例组和对照组中并没有观察到显著差异(例如，参照G.R.Monteith et al.^Biochemical andbiophysical research communications、1997 年、第 230 卷第 2 号、第 344 ~346 页。)。即，本发明人等首次发现如下见解:ATP2B1基因为公知的高血压易感基因，认为ATP2B1的表达量的多少对于高血压发病风险很重要，高血压发病风险根据启动子区域以外的SNP等基因多态性的不同而不同。
[0044]这里，SNP (rslll05378)为T/C多态性，由后述实施例3的结果可知，与正常血压组相比较的情况下，高血压组中，C等位基因的频率显著高于T等位基因，作为高血压的遗传标记是有用的。
[0045]另外，SNP (rs2681472)为G/A多态性，由后述实施例9的结果可知，与正常血压组相比较的情况下，高血压组中，A等位基因的频率显著高于G等位基因，作为高血压的遗传标记是有用的。
[0046]另外，SNP (rsl401982)为A/G多态性，由后述实施例15的结果可知，与正常血压组相比较的情况下，高血压组中，G等位基因的频率显著高于A等位基因，作为高血压的遗传标记是有用的。
[0047]进而，SNP (rslll05364)为G/T多态性，由后述实施例21的结果可知，与正常血压组相比较的情况下，高血压组中，T等位基因的频率显著高于G等位基因，作为高血压的遗传标记是有用的。
[0048]作为本发明的第五方案的高血压的遗传标记包含SNP，作为等位基因，包含CYP11B2 (细胞色素P450，亚家族XIB2)基因。具体而言，其特征在于，由与包含CYP11B2基因的SNP即SNP (rsl799998)的CYP11B2基因的部分碱基序列或全部碱基序列相同或互补的碱基序列构成。SNP (rsl799998)为C/T多态性，由后述实施例28的结果可知，与正常血压组相比较的情况下，高血压组中，T等位基因的频率显著高于C等位基因，作为高血压的遗传标记是有用的。另外，未有报道指出CYP11B2基因特别地显示出与高血压相关的见解，CYP11B2基因为高血压易感基因是本发明人等首次发现的见解。
[0049]作为本发明的第七方案的高血压发病风险判定方法是利用作为本发明的第一方案和/或第五方案的高血压的遗传标记(以下有时也称为“本发明的高血压的遗传标记”。)来判定高血压发病的风险的方法。具体而言，其特征在于，其包括以下工序:(a)对由人个体采集的核酸的、选自由 SNP (rslll05378)、SNP (rs2681472)、SNP (rsl401982)、SNP(rslll05364)、及SNP (rsl799998)所组成的组中的I种以上进行分型的工序;和6)根据通过所述工序(a)获得的分型结果来判定所述人个体的高血压发病风险的工序。SNP(rslll05378)、SNP (rs2681472)、SNP (rsl401982)、SNP (rslll05364)、SNP (rsl799998)中的任意一种的多态性之间，在高血压的易发病性方面统计学上都显著不同，因此能够由所鉴定的SNP的基因型判定高血压发病风险。
[0050]首先，作为工序(a)，对由人个体采集的核酸的、选自由SNP (rslll05378)、SNP(rs2681472)、SNP (rsl401982)、SNP (rslll05364)、及 SNP (rsl799998)所组成的组中的I种以上进行分型。
[0051]本发明中，“对SNP进行分型”意味着，测定核酸的碱基序列，检测SNP，从而鉴定多态性。例如，鉴定作为判定对象的核酸的SNP (rslll05378)为TT型、TC型、CC型中的哪一者。
[0052]供于SNP分型的核酸只要是从人个体采集的，则没有特别限定，可以是血液、体液等生物试样(待测物)中所含有的核酸、或者从这些生物试样等提取的核酸，也可以是以这些核酸为模板扩增得到的核酸。另外，也可以是利用逆转录酶由生物试样中所含有的RNA合成的cDNA。
[0053]SNP的分型方法只要是通常用于SNP的检测的方法，则没有特别限定。例如，可列举出 InvadeK商标、Third Wave Technologies公司)法、TaqMan(商标、Applied Biosystems公司)法、MALD1-T0F质谱法、微阵列法、测序法、利用PCR (聚合酶链反应)等碱基序列扩增法的检测法等。特别是优选像TaqMan法、PCR法、微阵列法等那样的使用与各多态性特异性杂交的引物或探针来检测SNP的方法。例如，在PCR法中，以仅与野生型等位基因完全互补的多核苷酸作为野生型引物，以仅与突变型等位基因完全互补的多核苷酸作为突变型引物的情况下，以包含SNP的核酸作为模板利用各引物进行PCR，通过是否能够得到PCR产物，能够鉴定SNP的基因型。同样地，以仅与野生型等位基因完全互补的多核苷酸作为野生型探针，以仅与突变型等位基因完全互补的多核苷酸作为突变型探针的情况下，通过使用固定有包含SNP的核酸的微阵列并利用各探针时能否杂交，能够鉴定SNP的基因型。这些使用对各SNP特异性的探针或引物的方法与测序法等不同，由于可直接识别SNP，因此可靠性更高，另外，SNP分型所需要的时间短，且简便。
[0054]另外， 使用对各SNP特异性的引物进行PCR时获得的PCR产物的检测可通过通常用于检测和定量PCR产物时的任意方法来进行。例如，可通过电泳来检测，可以通过使用SYBR Green等荧光嵌入剂的实时PCR来检测，也可以通过单分子荧光分析法(singlemolecule fluorescence analysis)来检测。
[0055]能够作为用于检测SNP的引物或探针使用的高血压发病风险判定用多核苷酸，只要是能够与包含该SNP的基因的包含该SNP在内的部分区域或其互补链杂交的多核苷酸，则没有特别限定。另外，高血压发病风险判定用多核苷酸的碱基长度、Tm值等可考虑分型方法、反应条件等适当决定，但作为高血压发病风险判定用多核苷酸的碱基长度，优选为10~60个碱基长度，更优选为15~50个碱基长度。
[0056]这种高血压发病风险判定用多核苷酸的设计可采用该【技术领域】中众所周知的方法中的任一者来进行。例如，利用公知的基因组序列数据和通用的引物设计工具，能够简便地设计。作为该引物设计工具，例如有网络上能够利用的Primerf等。另外，公知的基因组序列数据通常能够在作为国际性的碱基序列数据库的NCB1、或DDBJ (DNA Data Bank ofJapan)等中获得。
[0057]这样设计的高血压发病风险判定用多核苷酸可采用该【技术领域】中众所周知的方法中的任一者来合成。例如，可依赖于合成公司来合成，也可以使用市售的合成机独自合成。
[0058]作为用于检测ATP2B1基因上的SNP (rslll05378)的引物或探针，特别优选使用具有下述的(a)~(f)中任一碱基序列的、作为本发明的第二方案的高血压发病风险判定用多核苷酸(以下称为“SNP (rslll05378)检测用多核苷酸”。)。
[0059](a)序列号5所示的碱基序列、或序列号5所示的碱基序列的包含SNP(rslll05378)的部分序列。
[0060](b)与所述(a)的碱基序列互补的碱基序列。
[0061](C)所述(a)或(b)的碱基序列中除SNP (rslll05378)以外的I~数个碱基缺失、置换或添加而得到的碱基序列，且由该碱基序列构成的多核苷酸能够与由所述(a)或(b)的碱基序列构成的多核苷酸在严格的条件下杂交的碱基序列。
[0062](d)序列号6所示的碱基序列、或序列号6所示的碱基序列的包含SNP(rslll05378)的部分序列。
[0063](e)与所述(d)的碱基序列互补的碱基序列。
[0064](f)所述(d)或(e)的碱基序列中除SNP (rslll05378)以外的I~数个碱基缺失、置换或添加而得到的碱基序列，且由该碱基序列构成的多核苷酸能够与由所述(d)或(e)的碱基序列构成的多核苷酸在严格的条件下杂交的碱基序列。
`[0065]另外，具有上述(a)~(C)中的任一碱基序列的SNP (rslll05378)检测用多核苷酸是能够检测SNP (rslll05378)的C等位基因(C allele)的多核苷酸，具有上述(d)~(f)中的任一碱基序列的SNP (rslll05378)检测用多核苷酸是能够检测SNP (rslll05378)的T等位基因(T allele)的多核苷酸。
[0066]作为用于检测ATP2B1基因上的SNP (rs2681472)的引物或探针，特别优选使用具有下述的(a)~(f)中的任一碱基序列的、作为本发明的第三方案的高血压发病风险判定用多核苷酸(以下称为“SNP (rs2681472)检测用多核苷酸”。)。
[0067](a)序列号12所示的碱基序列、或序列号12所示的碱基序列的包含SNP(rs2681472)的部分序列。
[0068](b)与所述(a)的碱基序列互补的碱基序列。
[0069](C)所述(a)或(b)的碱基序列中除SNP (rs2681472)以外的I~数个碱基缺失、置换或添加而得到的碱基序列，且由该碱基序列构成的多核苷酸能够与由所述(a)或(b)的碱基序列构成的多核苷酸在严格的条件下杂交的碱基序列。
[0070](d)序列号13所示的碱基序列、或序列号13所示的碱基序列的包含SNP(rs2681472)的部分序列。
[0071](e)与所述(d)的碱基序列互补的碱基序列。
[0072](f)所述(d)或(e)的碱基序列中除SNP (rs2681472)以外的I~数个碱基缺失、置换或添加而得到的碱基序列，且由该碱基序列构成的多核苷酸能够与由所述(d)或(e)的碱基序列构成的多核苷酸在严格的条件下杂交的碱基序列。
[0073]另外，具有上述(a)~(C)中的任一碱基序列的SNP (rs2681472)检测用多核苷酸是能够检测SNP (rs2681472)的A等位基因(A allele)的多核苷酸，具有上述(d)~(f)中的任一碱基序列的SNP (rs2681472)检测用多核苷酸是能够检测SNP (rs2681472)的G等位基因(G allele)的多核苷酸。
[0074]作为用于检测ATP2B1基因上的SNP (rsl401982)的引物或探针，特别优选使用具有下述的(a)~(f)中的任一碱基序列的、本发明的第四方案即高血压发病风险判定用多核苷酸(以下称为“SNP (rsl401982)检测用多核苷酸”。)。
[0075]Ca)序列号19所示的碱基序列、或序列号19所示的碱基序列的包含SNP(rs 1401982)的部分序列。
[0076](b)与所述(a)的碱基序列互补的碱基序列。
[0077](C)所述(a)或(b)的碱基序列中除SNP (rsl401982)以外的I~数个碱基缺失、置换或添加而得到的碱基序列，且由该碱基序列构成的多核苷酸能够与由所述(a)或(b)的碱基序列构成的多核苷酸在严格的条件下杂交的碱基序列。
[0078](d)序列号20所示的碱基序列、或序列号20所示的碱基序列的包含SNP(rs 1401982)的部分序列。
[0079](e)与所述(d)的碱基序列互补的碱基序列。
[0080](f)所述(d)或(e)的碱基序列中除SNP (rsl401982)以外的I~数个碱基缺失、置换或添加而得到的碱基序列，且由该碱基序列构成的多核苷酸能够与由所述(d)或(e)的碱基序列构成的多核苷酸在严格的条件下杂交的碱基序列。
[0081]另外，具有上述(a)~(C)中的任一碱基序列的SNP (rsl401982)检测用多核苷酸是能够检测SNP (rsl401982)的G等位基因的多核苷酸，具有上述(d)~(f)中的任一碱基序列的SNP (rsl401982)检测用多核苷酸是能够检测SNP (rsl401982)的A等位基因的多核苷酸。
[0082]另外，作为用于检测CYP11B2基因上的SNP (rsl799998)的引物或探针，特别优选具有下述的(a)~(f)中的任一碱基序列的、作为本发明的第五方案的高血压发病风险判定用多核苷酸(以下称为“SNP (rsl799998)检测用多核苷酸”。)。
[0083](a)序列号26所示的碱基序列、或序列号26所示的碱基序列的包含SNP(rsl799998)的部分序列。
[0084](b)与所述(a)的碱基序列互补的碱基序列。
[0085](C)所述(a)或(b)的碱基序列中除SNP (rs 1799998)以外的I~数个碱基缺失、置换或添加而得到的碱基序列，且由该碱基序列构成的多核苷酸能够与由所述(a)或(b)的碱基序列构成的多核苷酸在严格的条件下杂交的碱基序列。
[0086](d)序列号27所示的碱基序列、或序列号27所示的碱基序列的包含SNP(rsl799998)的部分序列。
[0087](e)与所述(d)的碱基序列互补的碱基序列。
[0088](f)所述(d)或(e)的碱基序列中除SNP (rs 1799998)以外的I~数个碱基缺失、置换或添加而得到的碱基序列，且由该碱基序列构成的多核苷酸能够与由所述(d)或(e)的碱基序列构成的多核苷酸在严格的条件下杂交的碱基序列。[0089]另外，具有上述(a)~(C)中的任一碱基序列的SNP (rsl799998)检测用多核苷酸是能够检测SNP (rsl799998)的T等位基因的多核苷酸，具有上述(d)~(f)中的任一碱基序列的SNP (rsl799998)检测用多核苷酸是能够检测SNP (rsl799998)的C等位基因的多核苷酸。
[0090]另外，本发明中，“严格的条件下”例如可列举出:在5XSSC (150mM氯化钠、15mM柠檬酸钠、pH7.4)+0.3%SDS (十二烷基硫酸钠)中热变性后，在65°C下杂交4~16小时，分别用常温的2XSSC+0.1%SDS、&2XSSC各洗涤5分钟，并用0.05 X SSC冲洗等。
[0091]此外，工序(a)中使用的高血压发病风险判定用多核苷酸中，除与检测对象的基因的碱基序列互补或相同的序列以外，还能够以不阻碍SNP分型的程度具有附加的序列。作为该附加的序列，例如有限制酶识别序列、提供核酸标记的序列等。另外，为了易于检测和分析SNP分型结果，各高血压发病风险判定用多核苷酸中能够以不阻碍SNP分型的程度添加标记物。该标记物只要是通常用于标记多核苷酸的化合物，则没有特别限定。作为该标记物，例如有放射性同位素、荧光物质、化学发光物质、生物素等低分子化合物等。
[0092]另外，由人个体采集的核酸、高血压发病风险判定用多核苷酸等在SNP分型中的用量没有特别限定，能够以通常的用量使用。另外，聚合酶等酶、核苷酸、反应用缓冲液等没有特别限定，能够以通常的用量使用通常进行SNP分型时使用的物质。
[0093]接下来，作为工序(b)，根据通过工序(a)获得的分型结果来判定所述人个体的高血压发病风险。例如，高血压发病风险可利用下述表2、8、14、20、25等的比值比(odds ratio)来判定。此外,可以利用对本发明的高血压的遗传标记进行荟萃分析(Metaanalysis)而得到的比值比来判定，可以利用对本发明的高血压的遗传标记进行队列研究而得到的相对危险度(风险比)来判定，也可以采用其他现有公知的统计方法并利用经统计学处理的值来判定。
[0094]具体而言，利用SNP (rslll05378)的分型结果时，可按照CC型、TC型、TT型的顺序判定风险由高到低。此外，SNP (rslll05378)为TT型时，可判定为低风险组；为TC型或CC型时，可判定为高风险组。
[0095]利用SNP (rs2681472)的分型结果时，可按照AA型、AG型、GG型的顺序判定风险由高到低。此外，SNP (rs2681472)为GG型或AG型时，可判定为低风险组；为AA型时，可判定为高风险组。
[0096]利用SNP (rsl401982)的分型结果时，可按照GG型、AG型、AA型的顺序判定风险由高到低。此外，SNP (rsl401982)为AA型时，可判定为低风险组；为AG型或GG型时，可判定为高风险组。
[0097]利用SNP (rsl1105364)的分型结果时，可按照TT型、TG型、GG型的顺序判定风险由高到低。此外，SNP (rslll05364)为GG型时，可判定为低风险组；为TT型或TG型时，可判定为高风险组。
[0098]另一方面，利用SNP (rsl799998)的分型结果时，可按照TT型、CT型、CC型的顺序判定风险由高到低。此外，SNP (rsl799998)为CC型或CT型时，可判定为低风险组；为TT型时，可判定为高风险组。
[0099]另外，组合本发 明的遗传标记时，与单独时相比，能够更准确地判定高血压发病风险。例如，SNP (rslll05378)为TT型，SNP (rsl799998)为CC型或CT型时，可判定为低风险组；SNP (rslll05378)为TC型或CC型，SNP (rsl799998)为TT型时，可判定为高风险组。另外，SNP (rs2681472)为GG型或AG型，SNP (rsl799998)为CC型或CT型时，可判定为低风险组；SNP (rs2681472)为AA型，SNP (rsl799998)为TT型时，可判定为高风险组。SNP (rsl401982)为AA型，SNP (rsl799998)为CC型或CT型时，可判定为低风险组；SNP (rsl401982)为AG型或GG型，SNP (rsl799998)为TT型时，可判定为高风险组。SNP (rslll05364)为GG型，SNP (rsl799998)为CC型或CT型时，可判定为低风险组；SNP(rslll05364)为TT型或TG型，SNP (rsl799998)为TT型时，也可判定为高风险组。
[0100]此外，本发明的遗传标记也能够与其他高血压的遗传标记组合使用。组合的遗传标记没有特别限定，也可以组合公知的高血压的遗传标记。特别优选与具有如下特征的高血压的遗传标记组合，所述高血压的遗传标记的特征在于，其由与包含AGT (encodingAngiotensinogen，血管紧张肽原)基因的SNP即SNP (rs699)的AGT基因的部分碱基序列或全部碱基序列相同或互补的序列构成。 [0101]AGT基因是具有多个SNP的公知的高血压易感基因。SNP (rs699)为Μ/T多态性，由后述实施例28的结果可知，与正常血压组相比较的情况下，高血压组中，T等位基因的频率显著高于M等位基因，作为高血压的遗传标记是有用的。因此，例如，SNP (rs699)为MM型或MT型时，可判定为低风险组；为TT型时，可判定为高风险组。另外，本申请说明书中，M为蛋氨酸(Met)，T表示苏氨酸(Thr)。这里，作为碱基序列，MM型为TT型所表现出的多态性，MT型为TC型所表现出的多态性，TT型为CC型所表现出的多态性。
[0102]SNP (rs699)的分型能够与 SNP (rslll05378)、SNP (rsl799998)同样地使用公知的SNP分型法来进行，优选的是，使用由与包含SNP (rs699)的AGT基因的部分碱基序列或全部碱基序列相同或互补的序列构成的多核苷酸作为引物或探针，通过SNP分型法来鉴定SNP。作为能够作为用于检测AGT基因上的SNP (rs699)的引物或探针使用的多核苷酸，优选具有下述的(a)~(f)中的任一碱基序列的多核苷酸(以下称为“SNP (rs699)检测用多核苷酸”。)。
[0103](a)序列号33所示的碱基序列、或序列号33所示的碱基序列的包含SNP (rs699)的部分序列。
[0104](b)与所述(a)的碱基序列互补的碱基序列。
[0105](C)所述(a)或(b)的碱基序列中除SNP (rs699)以外的I~数个碱基缺失、置换或添加而得到的碱基序列，且由该碱基序列构成的多核苷酸能够与由所述(a)或(b)的碱基序列构成的多核苷酸在严格的条件下杂交的碱基序列。
[0106](d)序列号34所示的碱基序列、或序列号34所示的碱基序列的包含SNP (rs699)的部分序列。
[0107](e)与所述(d)的碱基序列互补的碱基序列。
[0108](f)所述(d)或(e)的碱基序列中除SNP (rs699)以外的I~数个碱基缺失、置换或添加而得到的碱基序列，且由该碱基序列构成的多核苷酸能够与由所述(d)或(e)的碱基序列构成的多核苷酸在严格的条件下杂交的碱基序列。
[0109]另外,具有上述(a)~(C)中的任一碱基序列的SNP (rs699)检测用多核苷酸为能够检测SNP (rs699)的T等位基因的多核苷酸，具有上述(d)~(f)中的任一碱基序列的SNP (rs699)检测用多核苷酸为能够检测SNP (rs699)的M等位基因的多核苷酸。[0110]例如，根据SNP (rslll05378)和 SNP (rs699)的分型结果，SNP (rslll05378)为TT型，SNP (rs699)为MM型或MT型时，可判定为低风险组；SNP (rslll05378)为TC型或CC型，SNP (rs699)为TT型时，可判定为高风险组。另外，根据SNP (rs2681472)和SNP(rs699)的分型结果，SNP (rs2681472)为GG型或AG型，SNP (rs699)为MM型或MT型时，可判定为低风险组；SNP (rs2681472)为AA型，SNP (rs699)为TT型时，可判定为高风险组。另外，根据 SNP (rsl401982)和 SNP (rs699)的分型结果，SNP (rsl401982)为 AA 型，SNP (rs699)为MM型或MT型时，可判定为低风险组；SNP (rsl401982)为AG型或GG型，SNP(rs699)为TT型时，可判定为高风险组。进而，根据SNP (rslll05364)和SNP (rs699)的分型结果，SNP (rslll05364)为GG型，SNP (rs699)为MM型或MT型时，可判定为低风险组；SNP (rslll05364)为TT型或TG型，SNP (rs699)为TT型时，可判定为高风险组。此外，根据 SNP (rsl799998)和 SNP (rs699)的分型结果，SNP (rsl799998)为 CC 型或 CT 型，SNP(rs699)为MM型或MT型时，可判定为低风险组；SNP (rsl799998)为TT型，SNP (rs699)为TT型时，可判定为高风险组。
[0111]进而，通过组合作为本发明的第一方案的高血压的遗传标记、作为本发明的第五方案的高血压的遗传标记、以及由包含SNP (rs699)的AGT基因构成的高血压的遗传标记这3种遗传标记，从而能够获得可靠性非常高的风险评价。例如，SNP (rslll05378)为TT型，SNP (rsl799998)为CC型或CT型，SNP (rs699)为MM型或MT型时，可判定为低风险组；SNP (rslll05378)为 TC 型或 CC 型，SNP (rsl799998)为 TT 型，SNP (rs699)为 TT 型时，可判定为高风险组。另外，SNP (rs2681472)为GG型或AG型，SNP (rsl799998)为CC型或CT型，SNP (rs699)为MM型或MT型时，可判定为低风险组；SNP (rs2681472)为AA型，SNP(rsl799998)为TT型，SNP (rs699)为TT型时，可判定为高风险组。进而，SNP (rsl401982)为AA型，SNP (rsl799998)为CC型或CT型，SNP (rs699)为MM型或MT型时，可判定为低风险组；SNP (rs 1401982)为 AG 型或 GG 型，SNP (rsl799998)为 TT 型，SNP (rs699)为 TT型时，可判定为高风险组。
[0112]另外，组合这3种遗传标记，根据高风险多态性的数目、低风险多态性的数目等，也能够进行更精细的风险评价。例如，高风险多态性的数目越多，则能够判定高血压发病风险越闻。另外，低风险多态性的数目越少，则能够判定闻血压发病风险越闻。此外，闻风险多态性的数目越少，则也能够判定高血压发病风险越低，低风险多态性的数目越多，则也能够判定高血压发病风险越低。
[0113]具体而言，以SNP (rslll05378)的 CC 型、SNP (rsl799998)的 TT 型、SNP (rs699)的TT型分别作为高风险多态性，能够按照这些高风险多态性的个数为3个、2个、I个、O个的顺序来判定风险由高到低。另外，以SNP (rs2681472)的AA型、SNP (rsl799998)的TT型、SNP (rs699)的TT型分别为高风险多态性，能够按照这些高风险多态性的个数为3个、2个、I个、O个的顺序来判定风险由高到低。进而，以SNP (rsl401982)的GG型、SNP(rsl799998)的TT型、SNP (rs699)的TT型分别作为高风险多态性，能够按照这些高风险多态性的个数为3个、2个、I个、O个的顺序来判定风险由高到低。
[0114]另外，以SNP (rslll05378)的 TT 型、SNP (rsl799998)的 CC 型、SNP (rs699)的 MM型分别作为低风险多态性·，能够按照这些低风险多态性的个数为O个、I个、2个、3个的顺序来判定风险由高到低。另外，以SNP (rs2681472)的GG型、SNP (rsl799998)的CC型、SNP(rs699)的MM型分别作为低风险多态性，能够按照这些低风险多态性的个数为O个、I个、2个、3个的顺序来判定风险由高到低。进而，以SNP (rsl401982)的AA型、SNP (rsl799998)的CC型、SNP (rs699)的MM型分别作为低风险多态性，也能够按照这些低风险多态性的个数为O个、I个、2个、3个的顺序来判定风险由高到低。
[0115]此外，例如，以SNP (rslll05378)为 TT 型，SNP (rsl799998)为 CC 型或 CT 型，SNP(rs699)为MM型或MT型的情况作为第一组；以SNP (rslll05378)为TC型或CC型、SNP(rsl799998)为 CC 型或 CT 型、SNP (rs699)为 MM 型或 MT 型的情况，SNP (rslll05378)为 TT型、SNP (rsl799998)为 CC 型或 CT 型、SNP (rs699)为 TT 型的情况，或者，SNP (rslll05378)为TT型、SNP (rsl799998)为TT型、SNP (rs699)为MM型或MT型的情况作为第二组；以SNP(rslll05378)为 TC 型或 CC 型、SNP (rsl799998)为 CC 型或 CT 型、SNP (rs699)为 TT 型的情况，SNP (rslll05378)为 TC 型或 CC 型、SNP (rsl799998)为 TT 型、SNP (rs699)为 MM 型或 MT 型的情况，或者 SNP (rslll05378)为 TT 型、SNP (rsl799998)为 TT 型、SNP (rs699)为TT型的情况作为第三组；以SNP (rslll05378)为TC型或CC型、SNP (rsl799998)为TT型、SNP (rs699)为TT型的情况作为第四组；在所述工序(b)中，能够按照所述第四组、所述第三组、所述第二组、所述第一组的顺序判定风险由高到低。 [0116]另外，以SNP (rs2681472)为 GG 型或 AG 型、SNP (rsl799998)为 CC 型或 CT 型、SNP(rs699)为 MM 型或 MT 型的情况作为第一组；以 SNP (rs2681472)为 AA 型、SNP (rsl799998)为CC型或CT型、SNP (rs699)为MM型或MT型的情况，SNP (rs2681472)为GG型或AG型、SNP (rsl799998)为 CC 型或 CT 型、SNP (rs699)为 TT 型的情况，或者 SNP (rs2681472)为GG型或AG型、SNP (rsl799998)为TT型、SNP (rs699)为MM型或MT型的情况作为第二组；以 SNP (rs2681472)为 AA 型、SNP (rsl799998)为 CC 型或 CT 型、SNP (rs699)为 TT 型的情况，SNP (rs2681472)为 AA 型、SNP (rsl799998)为 TT 型、SNP (rs699)为 MM 型或 MT 型的情况，或者 SNP (rs2681472)为 GG 型或 AG 型、SNP (rsl799998)为 TT 型、SNP (rs699)为TT型的情况作为第三组；以SNP (rs2681472)为AA型、SNP (rsl799998)为TT型、SNP(rs699)为TT型的情况作为第四组；所述工序(b)中，能够按照所述第四组、所述第三组、所述第二组、所述第一组的顺序判定风险由高到低。
[0117]进而，以SNP (rsl401982)为 AA 型、SNP (rsl799998)为 CC 型或 CT 型、SNP (rs699)为MM型或MT型的情况作为第一组；以SNP (rsl401982)为AG型或GG型、SNP (rsl799998)为 CC 型或 CT 型、SNP (rs699)为 MM 型或 MT 型的情况，SNP (rs 1401982)为 AA 型、SNP(rsl799998)为 CC 型或 CT 型、SNP (rs699)为 TT 型的情况，或者 SNP (rsl401982)为 AA型、SNP (rsl799998)为TT型、SNP (rs699)为MM型或MT型的情况作为第二组；以SNP(rsl401982)为 AG 型或 GG 型、SNP (rsl799998)为 CC 型或 CT 型、SNP (rs699)为 TT 型的情况，SNP (rs 1401982)为 AG 型或 GG 型、SNP (rsl799998)为 TT 型、SNP (rs699)为 MM 型或 MT 型的情况、或者以 SNP (rsl401982)为 AA 型、SNP (rsl799998)为 TT 型、SNP (rs699)为TT型的情况作为第三组；以SNP (rs 1401982)为AG型或GG型、SNP (rsl799998)为TT型、SNP (rs699)为TT型的情况作为第四组；在所述工序(b)中，也能够按照所述第四组、所述第三组、所述第二组、所述第一组的顺序判定风险由高到低。
[0118]此外，工序(b)中的高血压发病风险的判定也可以组合通过工序(a)得到的分型结果、和除遗传标记以外的I个以上高血压的危险因素来进行。作为除遗传标记以外的危险因素，例如有人个体的性别、年龄、BMI值、脑血管疾病的有无、心脏病的有无、吸烟的有无、饮酒量、总胆固醇值、HDL胆固醇值、中性脂肪值、空腹时血糖值等。
[0119]利用微阵列法来进行工序(a)中的SNP分型时，优选采用作为本发明的第八方案的高血压发病风险判定用微阵列，即优选的是，在固相载体上固定有SNP (rslll05378)检测用多核苷酸、SNP (rs2681472)检测用多核苷酸、SNP (rsl401982)检测用多核苷酸、SNP(rslll05364)检测用多核苷酸和SNP (rsl799998)检测用多核苷酸中的至少I种。作为本发明的第八方案的高血压发病风险判定用微阵列，优选为固定有SNP (rslll05378)检测用多核苷酸、SNP (rs2681472)检测用多核苷酸和SNP (rsl401982)检测用多核苷酸中的至少I种以及SNP (rsl799998)检测用多核苷酸的微阵列；更优选固定有SNP (rslll05378)检测用多核苷酸、SNP (rs2681472)检测用多核苷酸、SNP (rsl401982)检测用多核苷酸和SNP (rsl799998)检测用多核苷酸中的任一者的微阵列。
[0120]另外，作为本发明的第八方案的高血压发病风险判定用微阵列，进一步优选在固相载体上固定有SNP (rslll05378)检测用多核苷酸、SNP (rs2681472)检测用多核苷酸、SNP (rsl401982)检测用多核苷酸、SNP (rslll05364)检测用多核苷酸、SNP (rsl799998)检测用多核苷酸和SNP(rs699)检测用多核苷酸中的至少I种的微阵列；更优选固定有SNP(rslll05378)检测用多核苷酸、SNP (rs2681472)检测用多核苷酸、SNP (rsl401982)检测用多核苷酸和SNP (rsl799998)检测用多核苷酸中的至少I种以及SNP (rs699)检测用多核苷酸的微阵列。进一步优选固定有SNP (rslll05378)检测用多核苷酸、SNP (rs2681472)检测用多核苷酸和SNP (rsl40 1982)检测用多核苷酸中的至少I种、以及SNP (rsl799998)检测用多核苷酸和SNP(rs699)检测用多核苷酸的微阵列；特别优选固定有SNP(rslll05378)检测用多核苷酸、SNP (rs2681472)检测用多核苷酸、SNP (rsl401982)检测用多核苷酸、SNP (rsl799998)检测用多核苷酸和SNP (rs699)检测用多核苷酸中的任一者的微阵列。
[0121]另外，本发明中，微阵列是指在固相载体上按照能够确定位置的方式固定有作为探针的多核苷酸的检测装置，固定化有探针(多核苷酸)的载体自身可以为分散性，只要是能够按照检测时能确定位置的方式固定在2维的固相载体上的状态即可。
[0122]另外，通过将用于工序(a)中的SNP分型的高血压发病风险判定用多核苷酸等制成试剂盒，从而能够更简便地进行工序(a)的SNP分型。例如，作为用于选自由SNP(rslll05378)、SNP(rs2681472)、SNP(rsl401982)、SNP(rslll05364XS SNP(rsl799998)所组成的组中的I种以上SNP的分型的SNP分型试剂盒，优选像作为本发明的第九方案的高血压发病风险判定用SNP分型试剂盒那样包含选自由SNP (rslll05378)检测用多核苷酸、SNP (rs2681472)检测用多核苷酸、SNP (rsl401982)检测用多核苷酸、SNP (rslll05364)检测用多核苷酸、SNP (rsl799998)检测用多核苷酸及在固相载体上固定有SNP (rslll05378)检测用多核苷酸、SNP (rs2681472)检测用多核苷酸、SNP (rsl401982)检测用多核苷酸、SNP (rslll05364)检测用多核苷酸和SNP (rsl799998)检测用多核苷酸中的至少I种的微阵列所组成的组中的I种以上。此外，作为在选自由SNP (rslll05378)、SNP (rs2681472)、SNP (rsl401982)、及 SNP (rsl799998)所组成的组中的 I 种以上 SNP 和 SNP (rs699)的分型中使用的SNP分型试剂盒，优选像作为本发明的第十方案的SNP分型试剂盒那样，包含选自由下述多核苷酸和微阵列所组成的组中的I个以上:SNP(rslll05378)检测用多核苷酸，SNP (rs2681472)检测用多核苷酸，SNP (rsl401982)检测用多核苷酸，SNP (rslll05364)检测用多核苷酸，SNP (rsl799998)检测用多核苷酸，SNP (rs699)检测用多核苷酸，在固相载体上固定有SNP (rslll05378)检测用多核苷酸、SNP (rs2681472)检测用多核苷酸、SNP (rsl401982)检测用多核苷酸、SNP (rslll05364)检测用多核苷酸、SNP (rsl799998)检测用多核苷酸的微阵列，以及在固相载体上固定有SNP (rslll05378)检测用多核苷酸、SNP (rs2681472)检测用多核苷酸、SNP (rsl401982)检测用多核苷酸、SNP (rslll05364)检测用多核苷酸、SNP (rsl799998)检测用多核苷酸以及SNP (rs699)检测用多核苷酸的微阵列。
[0123]此外，使用特征在于包含用1xP序列夹持ATP2B1基因的碱基序列的全部或一部分而成的碱基序列的ATP2B1基因局部缺失小动物制作用1xP重组载体，能够制作ATP2B1基因局部缺失小动物制作用1xP重组小动物。特别优选使用包含下述碱基序列的ATP2B1基因局部缺失小动物制作用1xP重组载体，来制作ATP2B1基因局部缺失小动物制作用1xP重组小动物，所述碱基序列中，包含选自由SNP (rsl1105378)、SNP (rs2681472)、SNP(1401982),SNP (rslll05364)所组成的组中的I个以上SNP的ATP2B1基因区域被1xP序列夹持。
[0124]进而，通过使该ATP2B1基因局部缺失小动物制作用1xP重组小动物与以适当的启动子作为Cre重组酶的表达启动子的选择性Cre表达转基因小动物交配，从而能够制作ATP2B1基因局部缺失小动物。作为Cre重组酶的表达启动子，例如优选为选自由Tie-2启动子、Tie-1启动子、Flk-1启动子、SM22启动子、SM-MHC启动子、Wtl启动子、PO启动子、Pax3启动子、a MHC启动子、Nkx2.5启动子、Tbxl启动子、四环素诱导启动子(tetracycline-1nducible promoter)及CMV增强子-鸡P -肌动蛋白启动子(CMVenhancer-chicken ^ -actin promoter)所组成的组中的一个启动子。
[0125]这样制作的ATP2B1基因局部缺失小动物优选呈现出高血压症状。另外，该ATP2B1基因局部缺失小动物能够优选作为用于筛选钙拮抗药的试验动物使用，也能够作为具有ATP2B1基因的基因多态性及表达异常的疾病的模`型小动物使用。
[0126]实施例
[0127]下面示出实施例对本发明进行更详细的说明，但本发明并不限定于以下的实施例。
[0128][实施例1]用于SNP分型的核酸的调制
[0129]以8924个一般地区居民作为对象，为了调查SNP的基因型与高血压的关系而进行了回顾性队列研究。这些对象者从横浜(1811人)、滋贺(3730人)、爱媛(3383人)召集。
[0130]首先，使用作为DNA提取试剂盒的QIAamp DNA Blood KitCQIAGEN GmbH制)，从由对象者采集的末梢血中的白细胞提取各人的基因组DNA。将所得基因组DNA用GenomiPhiDNA Amplification Kit (GE HEALTHCARE JAPAN CORPORATION 制)进行扩增。将扩增获得的DNA用buffer AE (QIAGEN GmbH制)稀释至50倍，供于SNP分型。
[0131][实施例2]ATP2B1基因上的SNP(rslll05378)的分型
[0132]以各对象者的完成扩增后的基因组DNA作为模板，通过TaqMan探针法对ATP2B1基因上的SNP(rslll05378)进行分析。具体而言，在实施例1中得到的DNA溶液2.0 y L中添加 2.5 u L 的 TaqMan Universal Master Mix (Applied Biosystems Inc.制)、0.05111^对rslll05378的各多态性特异性的TaqMan Pre-Designed SNP基因分型分析(Assay ID;C—32174448_10>Applied Biosystems Inc.制)、0.45 ii L 的蒸懼水,调制反应溶液后,供于利用PCR法的延伸反应。延伸反应中，在52°C下加热2分钟，接着在95°C下加热10分钟后，重复60次下述过程:在95°C下加热15秒钟、在60°C下加热I分钟。延伸反应后，用7900HTFast实时PCR系统(Applied Biosystems Inc.制)测定突光强度，从而对基因多态性进行分型。
[0133][实施例3]rsl 1105378多态性与高血压的相关性
[0134]以一般地区居民为对象,通过相关分析(关联方法(association method))对实施例2中鉴定的SNP的基因型与高血压的相关性进行分析。
[0135][表 1]
【权利要求】
1.一种ATP2B1基因局部缺失小动物制作用1xP重组载体，其特征在于，其包含用1xP序列夹持ATP2B1基因的碱基序列的全部或一部分而成的碱基序列。
2.—种ATP2B1基因局部缺失小动物制作用1xP重组小动物，其特征在于，其通过使用权利要求1所述的载体制作得到。
3.一种ATP2B1基因局部缺失小动物，其特征在于，其通过使选择性Cre表达转基因小动物与权利要求2所述的ATP2B1基因局部缺失小动物制作用1xP重组小动物交配而制得，所述选择性Cre表达转基因小动物以选自由下述启动子所组成的组中的一种启动子作为Cre重组酶的表达启动子:Tie-2启动子、Tie-1启动子、Flk-1启动子、SM22启动子、SM-MHC启动子、Wtl启动子、PO启动子、Pax3启动子、a MHC启动子、Nkx2.5启动子、Tbxl启动子、四环素诱导启动子及CMV增强子-鸡β -肌动蛋白启动子。
4.根据权利要求3所述的ΑΤΡ2Β1基因局部缺失小动物，其特征在于，其呈现出高血压症状。
5.一种ΑΤΡ2Β1基因的局部缺失小动物的使用方法，其特征在于，使用权利要求4所述的ΑΤΡ2Β1基因局部缺失小动物作为用于筛选钙拮抗药的试验动物。
6.一种ΑΤΡ2Β1基因的局部缺失小动物的使用方法，其特征在于，使用权利要求4所述的ΑΤΡ2Β1基因的局部缺失小动物作为具有ΑΤΡ2Β1基因的基因多态性及表达异常的疾病的模型小动物。
7.根据权利要求6所述的ΑΤΡ2Β1基因的局部缺失小动物的使用方法，其特征在于，所述基因多态性为选自由SNP遗传标记rslll05378、SNP遗传标记rs2681472、及SNP遗传标记rslll05364所组成的 组中的I种以上。
【文档编号】A61K49/00GK103667326SQ201310537507
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2009年2月20日 优先权日:2008年2月21日
【发明者】三木哲郎, 田原康玄, 小原克彦, 名仓润, 梅村敏, 平和伸仁, 上岛弘嗣, 喜多义邦, 中村保幸 申请人:国立大学法人爱媛大学, 国立大学法人滋贺医科大学, 公立大学法人横滨市立大学