一种近视风险评估的基因检测试剂盒及其检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种近视风险评估的基因检测试剂盒及其检测方法，包括盒体及盒体内单独存放试剂，单独存放试剂包括：(1)针对2个基因SNP多态位点的PCR反应引物组；(2)PCR扩增试剂；(3)琼脂糖凝胶电泳分析试剂。本发明通过PCR引物的设计使多个PCR扩增反应在同一台PCR仪上同步进行，对受测者的相关基因进行检测，并实现检测的高效性、特异性，分析得到受测者发展成为高度近视的风险，为其发现近视的遗传与基因内在因素，能够更好的为受测者提供科学的参考，帮助其改善、调理生活工作习惯，以预防或降低近视的风险，同时在日常生活中采取相应的策略避免对其无效甚至是有害的方法。
【专利说明】
-种近视风险评估的基因检测试剂盒及其检测方法
技术领域
[0001] 本发明设及基因检测领域，具体是一种近视风险评估的基因检测试剂盒及其检测 方法。
【背景技术】
[0002] 近视，是指眼在调节松弛状态下，平行光线经眼的屈光系统的折射后，光线在视网 膜前聚焦而非在视网膜上聚焦，运通常是因为晶状体的增厚和老化所导致，近视受先天遗 传因素和后天环境因素的共同影响。调查表明，近视的产生受遗传的影响比较大。如果父母 两人都是近视，子女同样近视的几率高达33-60%;如果父母一方是近视，子女近视的几率 降低到23-40%;如果父母两人都不近视，则子女近视的几率只有6-15%。与近视眼有关联 的基因在眼睛发育W及视觉信号向大脑的传递过程中发挥着关键作用。该类基因一旦出现 缺陷，眼球就可能过度发育生长，导致观看远处物体时发生视觉模糊，近视形成。
[0003] 很显然，近视的发生深受遗传因素的影响。2001年英国研究者对226对同卵李生成 年人和280对异卵李生成年人的研究表明，近视的遗传率高达0.89,也就是说，近视主要受 基因控制，与后天因素的关系不大。差不多同时丹麦研究者对53对同卵和61对异卵李生成 年人的研究也得出了相同的结论。
[0004] 不过，基因的表达离不开环境因素的作用，某些环境因素（例如阅读）可能是近视 的诱因。另外某些人在某些环境因素的刺激下，天生就比较容易得近视。总之，对近视的基 因检测将会帮助我们更好的了解遗传因素的影响，避免不利的环境因素诱发，更好的保护 视力。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种近视风险评估的基因检测试剂盒及其检测方法，该试 剂盒对受测者的相关基因进行检测，分析得到受测者发展成为高度近视的风险，为其发现 近视的遗传与基因内在因素，能够更好的为受测者提供科学的参考，帮助其改善、调理生活 工作习惯，W预防或降低近视的风险，同时在日常生活中采取相应的策略避免对其无效甚 至是有害的方法。且PCR扩增反应在同一台PCR仪上同步进行并具备检测的高效性、特异性， W解决上述【背景技术】中提出的问题。
[0006] 为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
[0007] 本实施例对测试者采用近视风险评估基因检测试剂盒同时检测2个基因的SNP多 态位点，并根据基因分型结果，分析得到受测者发展成为高度近视的风险，为其发现近视的 遗传与基因内在因素，能够更好的为受测者提供科学的参考，帮助其改善、调理生活工作习 惯，W预防或降低近视的风险，同时在日常生活中采取相应的策略避免对其无效甚至是有 害的方法。
[000引一种近视风险评估的基因检测试剂盒，包括盒体及盒体内单独存放试剂，所述单 独存放试剂包括：
[0009] (I)针对2个基因 SNP多态位点的PCR反应引物组，引物序列方向均为5 '端至3 '端：
[0010] ①针对SNP rsl89798的引物组：
[0011] 1 GTAGTGCTG GTGG
[0012] 2 CAGAGAGAGCACTTCAG
[0013] 3 GACAGA GACATTGAGGC
[0014] 4 GGAATACTGCAAGATCCGT
[0015] ②针对SNP rs100 34228的引物组：
[0016] 1 GGTGCTCTCT CAAGCCTTTG
[0017] 2 CTTTTGTGCCTCCACTATTC
[0018] 3 GAAGAAGTCA GAGATGTGTAT
[0019] 4 GACTGCCACACTAACAAAT；
[0020] (2)PCR扩增试剂：IOXPCR缓冲液，该PCR缓冲液由90~IlOmM Tris-HCl P册.3、 480~520mM KCU13~17mM MgC12组成;dNTPs混合物，该dNTPs混合物由S憐酸鸟嚷岭脱氧 核巧酸dGTP、=憐酸腺嚷岭脱氧核巧酸dATP、=憐酸胸腺喀晚脱氧核巧酸dTTP、=憐酸胞喀 晚脱氧核巧酸dCTP四种核巧酸组成，各组分浓度为2.2~2. SmM; 4~抓AU热启动化q酶;基 因组模板；
[0021] (3)琼脂糖凝胶电泳分析试剂:琼脂糖、TAE缓冲液、DNA分子量标准、Goldvi ew染色 液和DNA上样缓冲液，该缓冲液W漠酪蓝为指示剂稀释至1倍后使用。
[0022] 作为本发明进一步的方案：所述DNA无毒染色液为Biotium Gelred无毒染料或 Goldview染色液。
[0023] -种所述的近视风险评估的基因检测试剂盒的检测方法，步骤如下：
[0024] (1)提取样本基因组DNA
[0025] 采集测试者唾液，向1~2ml唾液样品中加入480~52化L提取缓冲溶液，该提取缓 冲溶液溶剂为48~52mM的化is-肥1 pH7.4、0.4~0.6mM的抓TA和48~52mM的化Cl，反复吹 打混匀后，8000 Xg离屯、4~6min，弃去上清，此步骤重复一次;得到的沉淀中加入480~52化 L裂解液，该裂解液溶剂为48~52mM化is-HCl抑7.4,48~52mM化is-HClpH7.4，145~ 155mMNaCl，0.9~l.lmMEDTA，0.9~l.l%Tritonx-100,0.9~l.l%Sodium deo巧cholate，0.09~0.11 % SDS，蛋白酶K20mg/mL，彻底悬浮沉淀并充分混匀后，室溫放置 28~32min，期间来回颠倒离屯、管数次;得到的混合液中，加入浓度为9~1 Img/mL RNA酶的 水溶液9~11化，36~38°C下静置IOmin;得到的上清液中，加入等体积苯酪-氯仿混合溶液， 苯酪和氯仿体积比为0.9~1.1:1，充分混匀，混合液3~5°C，12000 Xg离屯、4~6min，上清液 移入干净离屯、管内；加入等体积苯氛-氯仿-异戊醇混合溶液，苯酪、氯仿和异戊醇体积比为 24~26:23~25:1，充分混匀后，3~5°C，12000 Xg离屯、4~6min，上清液移入干净离屯、管内； 加入等体积氯仿-异戊醇混合溶液，充分混匀后，3~5°C，12000 Xg离屯、4~6min，上清液移 入干净离屯、管内；加入0.5~0.7倍体积的冰浴异丙醇溶液及0.09~0.11倍的2.8~3.2mol/ L醋酸钢溶液，-19~-2rC静置57~63min，3~5°C，12000 X g离屯、9~1 Imin，弃上清液;得到 的沉淀物中加入0.4~0.6mL 70 %乙醇清洗沉淀物，3~5°C，12000 X g离屯、4~6min，弃上清 液，此步骤重复一次;得到的沉淀物自然风干，加入18~22化无菌超纯水回溶，电泳检测，-20°C保存；
[00%] (2)PCR 扩增
[0027] 每个SNP的检测需要一对上下游引物、两条多态引物共4条PCR引物，共需要8条引 物，每个SNP的检测需要做两管PCR扩增，为防止出现假阳性之类的反应，衡量PCR是否成功， 加设一管阴性对照组，共做5管PCR，阴性对照组基因组模板没有引物存在；
[0028] 根据不同的检测位点，用相应的引物按如下比例分别配制PCR反应体系：2.3~2.7 化10 X PCR缓冲液，1.8~2.化L dNTPs，0.4~0.6化引物组，热启动Taq酶0.12~0.1祉L，基 因组模板78~82mg，添加超纯水至总体积为24~
[0029] 将装有反应溶液的Eppendorf试管放入PCR仪中，设置反应条件如下:预变性94~ 96^2.5~3.5111111;热循环93~95^28~323,59~61^28~323,71~73^28~323,35个循 环;延伸71~73°C2.5~3.5min，反应结束后，取出试管；
[0030] (3)琼脂糖凝胶电泳检测
[0031] 将扩增后的产物进行琼脂糖电泳检测，过程如下：2.7~3.3g琼脂糖，加入95~ 105mL去离子水，微波炉加热55~65s，冷却到58~62°C，加入4.8~5.化L DNA无毒染色液， 审Ij成2.9~3.1 %的琼脂糖凝胶，用9~11化的PCR产物与0.7~0.9化的6 X T肥缓冲液混合上 样，在98~102V电压下电泳14~16min，紫外灯下读取结果并拍照。
[0032] 与现有技术相比，本发明的有益效果是:本发明通过PCR引物的设计使多个PCR扩 增反应在同一台PCR仪上同步进行，对受测者的相关基因进行检测，并实现检测的高效性、 特异性，分析得到受测者发展成为高度近视的风险，为其发现近视的遗传与基因内在因素， 能够更好的为受测者提供科学的参考，帮助其改善、调理生活工作习惯，W预防或降低近视 的风险，同时在日常生活中采取相应的策略避免对其无效甚至是有害的方法。
【附图说明】
[0033] 图1为反应产物琼脂糖凝胶电泳图。
【具体实施方式】
[0034] 下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完 整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于 本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他 实施例，都属于本发明保护的范围。
[00对实施例
[0036] (1)针对2个基因 SNP多态位点的PCR反应引物组（W下引物序列方向均为5 '端至3 ' 端)：
[0037] 针对SNP rsl89798的引物组：
[0038] 1 GTAGTGCTG GTGG
[oow] 2 CAGAGAGAGCACTTCAG
[0040] 3 GACAGA GACATTGAGGC
[0041 ] 4 GGAATACTGCAAGATCCGT
[0042] 针对SNP rs100 34228的引物组：
[0043] 1 GGTGCTCTCT CAAGCCTTTG
[0044] 2 CTTTTGTGCCTCCACTATTC
[0045] 3 GAAGAAGTCA GAGATGTGTAT
[0046] 4 GACTGCCACACTAACAAAT
[0047] (2)PCR扩增试剂aOXPCR缓冲液，该PCR缓冲液为IOOmM IYis-HCl P册.3,500mM KCl，15mM MgCl 2; dNTPs混合物，该dNTPs混合物为S憐酸鸟嚷岭脱氧核巧酸dGTP，S憐酸腺 嚷岭脱氧核巧酸dATP，S憐酸胸腺喀晚脱氧核巧酸dTTP，S憐酸胞喀晚脱氧核巧酸dCTP四 种核巧酸，各组分浓度为2.5mM;抓AU热启动化q酶；
[004引（3)琼脂糖凝胶电泳分析试剂:琼脂糖、TAE缓冲液、DNA分子量标准、Goldvi ew染色 液和DNA上样缓冲液，该缓冲液W漠酪蓝为指示剂稀释至1倍后使用。
[0049]使用上述运动后体质恢复状况基因检测试剂盒按如下步骤进行检测：
[(K)加](1)提取样本基因组DNA
[0051 ]采集该测试者唾液，向l-2ml唾液样品中加入50化L提取缓冲溶液，该DNA提取缓冲 溶液溶剂为50mM的化is-肥1 pH7.4、0.5mM的邸TA和50mM的化Cl，反复吹打混匀后，8000 X g 离屯、5min，弃去上清，此步骤重复一次;得到的沉淀中加入5(K)化裂解液，该裂解液溶剂为 50mM Tris-肥 1 pH7.4,50mM Tris-肥 1 pH7.4，150mM NaCiamM EDTA，l%Triton X-100， I % Sodium deoxycholate，0.1 % SDS，蛋白酶K20mg/mL，彻底悬浮沉淀并充分混匀后，室溫 放置30min，期间来回颠 倒离屯、管数次;得到的混合液中，加入浓度为lOmg/mLRNA酶的水溶 液10化，37°C下静置IOmin;得到的上清液中，加入等体积苯酪-氯仿混合溶液，苯酪和氯仿 体积比为1:1，充分混匀，混合液4°C，12000 X g离屯、5min，上清液移入干净离屯、管内；加入等 体积苯氛-氯仿-异戊醇混合溶液，苯酪、氯仿和异戊醇体积比为25: 24:1，充分混匀后，4°C， 12000 X g离屯、5min，上清液移入干净离屯、管内；加入等体积氯仿-异戊醇混合溶液，充分混 匀后，4°C，12000 X g离屯、5min，上清液移入干净离屯、管内；加入0.6倍体积的冰浴异丙醇溶 液及0.1倍的3mol/L醋酸钢溶液，-20°C静置60min后，4°C，12000Xg离屯、lOmin，弃上清液； 得到的沉淀物中加入0.5mL 70 %乙醇清洗沉淀物，4°C，12000 X g离屯、5min，弃上清液，此步 骤重复一次;得到的沉淀物自然风干，加入20化无菌超纯水回溶，电泳检测，-20°C保存。 [0化 2] (2)PCR 扩增
[0化3] 本实施例同时检测rsl89798、rs100 34228,每个SNP的检测需要一对上下游引物、 两条多态引物共4条PCR引物，共需要8条引物。每个SNP的检测需要做两管PCR扩增，为防止 出现假阳性之类的反应，衡量PCR是否成功，加设一管阴性对照组，共做5管PCR，所述阴性对 照组基因组模板及反应体系是一样的，但没有引物存在。
[0054] 根据不同的检测位点，用相应的引物按如下比例分别配制PCR反应体系:2.5化10 X PCR缓冲液，dNTPs，0.5化引物组，热启动化q酶0.15化，基因组模板SOmg，添加超纯水 至总体积为2如L。
[0055] 将装有反应溶液的化pendorf试管放入ABI 9700PCR仪中，设置反应条件如下:预 变性 95°C3min;热循环 941：3〇3,6〇1：3〇3,721：3〇3,35个循环;延伸721：3111111。反应结束后， 取出试管。
[0056] 由于5管PCR扩增反应是在同一台PCR仪上同步进行的，为了实现检测的高效性、特 异性，要求8条PCR引物的Tm值相近，为此需要先进行大量的DNA序列软件分析来设计PCR引 物，并通过大量的实验来进行Tm值的优化并确定设计的合理性，本试剂盒各基因 SNP多态性 的检测是既相对独立又相互联系的，不可分割。
[0057] (3)琼脂糖凝胶电泳检测
[0058] 将扩增后的产物进行琼脂糖电泳检测，过程如下:：3g琼脂糖，加入IOOmL去离子水， 微波炉加热Imin，冷却到60°C时加入扣L Goldview染色液，制成3%的琼脂糖凝胶。PCR产物 10化与6 X T邸缓冲液0.祉L混合上样，电压IOOV电泳15min。紫外灯下读取结果并拍照，所得 琼脂糖电泳检测图如图1所示。
[0059] 检测得到2个基因分型分析结果如下：
[0061] 根据W上分析结果，该测试者不容易患高度近视。如在平常生活和学习中，注意用 眼保护，则更能保证眼睛的健康，远离近视的苦恼。
[0062] 对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在 不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够W其他的具体形式实现本发明。因此，无论 从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权 利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有 变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所设及的权利要求。
【主权项】
1. 一种近视风险评估的基因检测试剂盒，包括盒体及盒体内单独存放试剂，其特征在 于，所述单独存放试剂包括： (1) 针对2个基因 SNP多态位点的PCR反应引物组，引物序列方向均为5 '端至3 '端： ① 针对SNP rsl89798的引物组： 1 GTAGTGCTG GTGG 2 CAGAGAGAGCACTTCAG 3 GACAGA GACATTGAGGC 4 GGAATACTGCAAGATCCGT ② 针对SNP rs100 34228的引物组： 1 GGTGCTCTCT CAAGCCTTTG 2 CTTTTGTGCCTCCACTATTC 3 GAAGAAGTCA GAGATGTGTAT 4 GACTGCCACACTAACAAAT； (2) PCR扩增试剂：10XPCR缓冲液，该PCR缓冲液由90~llOmM Tris-HCl pH8.3、480~ 520mM KC1、13~17mM MgCl2组成；dNTPs混合物，该dNTPs混合物由三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷 酸dGTP、三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸dATP、三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸dTTP、三磷酸胞嘧啶脱 氧核苷酸dCTP四种核苷酸组成，各组分浓度为2.2~2.8mM; 4~6UAU热启动Taq酶;基因组 模板； (3) 琼脂糖凝胶电泳分析试剂:琼脂糖、TAE缓冲液、DNA分子量标准、Go 1 dvi ew染色液和 DNA上样缓冲液，该缓冲液以溴酚蓝为指示剂稀释至1倍后使用。2. 根据权利要求1所述的近视风险评估的基因检测试剂盒，其特征在于，所述DNA无毒 染色液为Biotium Gelred无毒染料或Goldview染色液。3. -种如权利要求1所述的近视风险评估的基因检测试剂盒的检测方法，其特征在于， 步骤如下： (1)提取样本基因组DNA 采集测试者唾液，向1~2ml唾液样品中加入480~520yL提取缓冲溶液，该提取缓冲溶 液溶剂为48~52mM的Tris-HCl pH7 ·4、0 ·4~0 · 6mM的EDTA和48~52mM的NaCl，反复吹打混 匀后，8000 Xg离心4~6min，弃去上清，此步骤重复一次;得到的沉淀中加入480~520yL裂 解液，该裂解液溶剂为48~52mM Tris-HCl ρΗ7·4,48~52mM Tris-HCl ρΗ7·4，145~155mM NaCl，0.9~l.lmM EDTA，0.9~l.l%Triton χ_100,0·9~l.l%Sodium deoxycholate， 0.09~0.11 % SDS，蛋白酶K20mg/mL，彻底悬浮沉淀并充分混匀后，室温放置28~32min，期 间来回颠倒离心管数次;得到的混合液中，加入浓度为9~1 lmg/mL RNA酶的水溶液9~11μ L，36~38°C下静置10min;得到的上清液中，加入等体积苯酚-氯仿混合溶液，苯酚和氯仿体 积比为0.9~1.1:1，充分混匀，混合液3~5°C，12000 Xg离心4~6min，上清液移入干净离心 管内；加入等体积苯氛-氯仿-异戊醇混合溶液，苯酚、氯仿和异戊醇体积比为24~26: 23~ 25:1，充分混匀后，3~5°C，12000 Xg离心4~6min，上清液移入干净离心管内；加入等体积 氯仿-异戊醇混合溶液，充分混匀后，3~5°C，12000 X g离心4~6min，上清液移入干净离心 管内；加入0.5~0.7倍体积的冰浴异丙醇溶液及0.09~0.11倍的2.8~3.2mol/L醋酸钠溶 液，-19~-21°C静置57~63min，3~5°C，12000Xg离心9~llmin，弃上清液;得到的沉淀物 中加入0.4~0.6mL 70 %乙醇清洗沉淀物，3~5°C，12000 X g离心4~6min，弃上清液，此步 骤重复一次;得到的沉淀物自然风干，加入18~22yL无菌超纯水回溶，电泳检测，-20°C保 存； (2) PCR扩增 每个SNP的检测需要一对上下游引物、两条多态引物共4条PCR引物，共需要8条引物，每 个SNP的检测需要做两管PCR扩增，为防止出现假阳性之类的反应，衡量PCR是否成功，加设 一管阴性对照组，共做5管PCR，阴性对照组基因组模板没有引物存在； 根据不同的检测位点，用相应的引物按如下比例分别配制PCR反应体系：2.3~2.7yL 10 X PCR缓冲液，1 · 8~2 · 2yL dNTPs，0 · 4~0 · 6yL引物组，热启动Taq酶0 · 12~0 · 18yL，基因 组模板78~82mg，添加超纯水至总体积为24~26yL; 将装有反应溶液的Eppendorf试管放入PCR仪中，设置反应条件如下：预变性94~96°C 2.5~3.5111丨11;热循环93~951€28~328,59~611€28~328,71~73 1€28~328,35个循环；延 伸71~73°C2.5~3.5min，反应结束后，取出试管； (3) 琼脂糖凝胶电泳检测 将扩增后的产物进行琼脂糖电泳检测，过程如下：2.7~3.3g琼脂糖，加入95~105mL去 离子水，微波炉加热55~65s，冷却到58~62°C，加入4.8~5.2yLDNA无毒染色液，制成2.9~ 3.1 %的琼脂糖凝胶，用9~1 lyL的PCR产物与0.7~0.9yL的6 X TBE缓冲液混合上样，在98~ 102V电压下电泳14~16min，紫外灯下读取结果并拍照。
【文档编号】C12Q1/68GK105861714SQ201610345524
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年5月22日
【发明人】李则轩
【申请人】深圳中美基因研究院有限公司