一种人体身高预测的基因检测试剂盒及其检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种人体身高预测的基因检测试剂盒及其检测方法，包括盒体及盒体内单独存放的试剂，单独存放的试剂包括：(1)针对2个基因SNP多态位点的PCR反应引物组；(2)PCR扩增试剂；(3)琼脂糖凝胶电泳分析试剂。本发明通过PCR引物的设计使多个PCR扩增反应在同一台PCR仪上同步进行，对受测者的相关基因进行检测，并实现检测的高效性、特异性，分析得到儿童今后可能的身高范围的基因基础，从而为受测者获得一个合适的预判，并能够通过该预判进行科学合理的营养、运动搭配，以帮助受测者尽可能的达到应有的身高。
【专利说明】
一种人体身高预测的基因检测试剂盒及其检测方法
技术领域
[0001] 本发明涉及基因检测领域，具体是一种人体身高预测的基因检测试剂盒及其检测 方法。
【背景技术】
[0002] 身高，又称身长，是指一个人从头顶到脚底的身体长度。身高是对人体纵向各部分 的长度与比例而言，原于人体的纵向生长，受遗传因素的影响较大。男性在20~24岁、女性 在19~23岁，四肢长骨和脊椎骨均已完成骨化，身高就停止增长了。个体的最终身高由遗 传、环境、心理和疾病等因素相互作用而决定。研究证实身高是由多基因共同控制的数量遗 传性状，其遗传度为80 %~90 %。
[0003] 很多家长和儿童希望了解自己孩子的未来身高情况，运动员的身高是影响到一些 运动项目成绩的关键因素，如:跳高、篮球等。传统上，人们使用根据经验和简单统计的方法 来预测身高，比如瓦尔克尔氏"自身身高预测法"。该方法是一个较为简便的预测最终身高 的方法，这个方法是利用儿童少年某一时期的身高来预测未来的最终身高，或是以两个时 期的身高进行比较后得出最终身高。该方法有一定的可靠性，被广泛运用于身高预测中。此 法共分为一次预测法及两次预测法。
[0004] 然而，此类方法只是粗浅的经验学和统计学，缺乏支持其的科学基础。随着科技的 日益发展，人们发现高迀移率蛋白A2(HMGA2)等数种蛋白质与基因活化、细胞增殖有着密切 关系。这些基因的表达与多态性与人类身高密切相关，这种关联在不同人种间是普遍存在 的。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种人体身高预测的基因检测试剂盒及其检测方法，该试 剂盒对受测者的相关基因进行检测，分析得到儿童今后可能的身高范围的基因基础，从而 为受测者获得一个合适的预判，并能够通过该预判进行科学合理的营养、运动搭配，以帮助 受测者尽可能的达到应有的身高，且PCR扩增反应在同一台PCR仪上同步进行并具备检测的 高效性、特异性，以解决上述【背景技术】中提出的问题。
[0006] 为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
[0007] -种人体身高预测的基因检测试剂盒，包括盒体及盒体内单独存放的试剂，单独 存放的试剂包括：
[0008] (1)针对2个基因 SNP多态位点的PCR反应引物组，引物序列方向均为5 '端至3 '端：
[0009] 针对SNP rsl042725的引物组：
[0010] 1GGCAATCTCT CTCTGTG
[0011] 2CTTGGTTAAAAAATTTTCAAG
[0012] 3CTACCTCTG AATGTTACAAC
[0013] 4GTACTAGACTGTAAATTCT；
[0014] 针对SNP rs6060369的引物组：
[0015] 1CATGCAGATA TTTTATAAGC
[0016] 2CCCGTCCCTGGCCTG
[0017] 3GAGCACTCA ATAGGAGGCTC
[0018] 4GCTGCTCATTTAGCCT；
[0019] (2)PCR扩增试剂：10XPCR缓冲液，该PCR缓冲液由90~llOmM Tris-HCl ρΗ8·3、 480~520mM KC1、13~17mM MgC12组成;dNTPs混合物，该dNTPs混合物由三磷酸鸟嘌呤脱氧 核苷酸dGTP、三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸dATP、三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸dTTP、三磷酸胞嘧 啶脱氧核苷酸dCTP四种核苷酸组成，各组分浓度为2.3~2.7mM; 4~6U/yL热启动Taq酶;基 因组模板；
[0020] (3)琼脂糖凝胶电泳分析试剂:琼脂糖、TAE缓冲液、DNA分子量标准、DNA无毒染色 液和DNA上样缓冲液，该缓冲液以溴酚蓝为指示剂稀释至1倍后使用。
[0021]作为本发明进一步的方案：所述DNA无毒染色液为Biotium Gelred无毒染料或 Goldview染色液。
[0022] -种所述的人体身高预测的基因检测试剂盒的检测方法，步骤如下：
[0023] (1)提取样本基因组DNA
[0024] 采集测试者唾液，向1~2ml唾液样品中加入480~520yL提取缓冲溶液，该提取缓 冲溶液溶剂为48~52mM的Tris-HCl pH7.4、0.5~0.6mM的EDTA和48~52mM的NaCl，反复吹 打混勾后，8000 Xg离心4~6min，弃去上清，此步骤重复一次;得到的沉淀中加入480~520μ L裂解液，该裂解液溶剂为48~52mM Tris-HCl ρΗ7·4,48~52mM Tris-HCl ρΗ7·4，145~ 155mM NaCl，0.9 ~l.lmM EDTA，0.9 ~l.l%Triton χ-100,0·9 ~l.l%Sodium deoxycholate，0 · 09~0 · 11 % SDS，蛋白酶K20mg/mL，彻底悬浮沉淀并充分混勾后，室温放置 28~32min，期间来回颠倒离心管数次;得到的混合液中，加入浓度为9~1 lmg/mL RNA酶的 水溶液9~1 lyL，36~38 °C下静置9~1 lmin;得到的上清液中，加入等体积苯酚-氯仿混合溶 液，苯酸和氯仿体积比为0.9~1.1:1，充分混勾，混合液3~5°C，12000 X g离心4~6min，上 清液移入干净离心管内；加入等体积苯氛-氯仿-异戊醇混合溶液，苯酚、氯仿和异戊醇体积 比为24~26: 23~25:1，充分混勾后，3~5°C，12000 X g离心4~6min，上清液移入干净离心 管内；加入等体积氯仿-异戊醇混合溶液，充分混匀后，3~5°C，12000 X g离心4~6min，上清 液移入干净离心管内；加入〇 . 5~0.7倍体积的冰浴异丙醇溶液及0.09~0.11倍的2.8~ 3 · 2mol/L醋酸钠溶液，-19~-21°C静置57~63min，3~5°C，12000 X g离心9~1 lmin，弃上清 液；得到的沉淀物中加入〇 . 4~0.6 m L 7 0 %乙醇清洗沉淀物，3~5 °C，12 0 0 0 X g离心4~ 6min，弃上清液，此步骤重复一次;得到的沉淀物自然风干，加入18~22yL无菌超纯水回溶， 电泳检测，-20 °C保存；
[0025] (2)PCR 扩增
[0026] 每个SNP的检测需要一对上下游引物、两条多态引物共4条PCR引物，共需要8条引 物，每个SNP的检测需要做两管PCR扩增，为防止出现假阳性之类的反应，衡量PCR是否成功， 加设一管阴性对照组，共做5管PCR，阴性对照组基因组模板没有引物存在；
[0027]根据不同的检测位点，用相应的引物按如下比例分别配制PCR反应体系：2.3~2.7 yL 10 X PCR缓冲液，1 · 8~2 · 2yL dNTPs，0 · 4~0 · 6yL 引物组，热启动Taq酶0 · 12~0 · 18yL，基 因组模板78~82mg，添加超纯水至总体积为24~26yL;
[0028]将装有反应溶液的Eppendorf试管放入PCR仪中，设置反应条件如下：预变性94~ 961€2.5~3.5111丨11;热循环93~951€28~328,59~61 1€28~328,71~731€28~328,35个循 环;延伸71~73°C2.5~3.5min，反应结束后，取出试管；
[0029] (3)琼脂糖凝胶电泳检测
[0030]将扩增后的产物进行琼脂糖电泳检测，过程如下：2.7~3.3g琼脂糖，加入95~ 105mL去离子水，微波炉加热55~65s，冷却到58~62°C，加入4.8~5.2yL DNA无毒染色液， 制成2.9~3.1 %的琼脂糖凝胶，用9~1 lyL的PCR产物与0.7~0.9yL的6 X TBE缓冲液混合上 样，在98~102V电压下电泳14~16min，紫外灯下读取结果并拍照。
[0031] 与现有技术相比，本发明的有益效果是:本发明通过PCR引物的设计使多个PCR扩 增反应在同一台PCR仪上同步进行，对受测者的相关基因进行检测，并实现检测的高效性、 特异性，分析得到儿童今后可能的身高范围的基因基础，从而为受测者获得一个合适的预 判，并能够通过该预判进行科学合理的营养、运动搭配，以帮助受测者尽可能的达到应有的 身高。
【附图说明】
[0032] 图1为反应产物琼脂糖凝胶电泳图。
【具体实施方式】
[0033]下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完 整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于 本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他 实施例，都属于本发明保护的范围。
[0034] 本实施例对测试者采用人体身高预测基因检测试剂盒同时检测2个基因的SNP多 态位点，并根据基因分型结果，分析得到儿童今后可能的身高范围的基因基础，从而为受测 者获得一个合适的预判，并能够通过该预判进行科学合理的营养、运动搭配，以帮助受测者 尽可能的达到应有的身尚。
[0035] 使用到的人体身高预测基因检测试剂盒内试剂由以下组成：
[0036] (1)针对2个基因 SNP多态位点的PCR反应引物组（以下引物序列方向均为5'端至3' 端)：
[0037] 针对SNP rsl042725的引物组：
[0038] 1GGCAATCTCT CTCTGTG
[0039] 2CTTGGTTAAAAAATTTTCAAG
[0040] 3CTACCTCTG AATGTTACAAC [0041 ] 4GTACTAGACTGTAAATTCT
[0042] 针对SNP rs6060369的引物组：
[0043] 1CATGCAGATA TTTTATAAGC
[0044] 2CCCGTCCCTGGCCTG
[0045] 3GAGCACTCA ATAGGAGGCTC
[0046] 4GCTGCTCATTTAGCCT
[0047] (2)PCR扩增试剂：10XPCR缓冲液，该PCR缓冲液为lOOmM Tris-HCl pH8.3,500mM KC1，15mM MgCl2; dNTPs混合物，该dNTPs混合物为三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸dGTP，三磷酸腺 嘌呤脱氧核苷酸dATP，三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸dTTP，三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸dCTP四 种核苷酸，各组分浓度为2.5mM; 5U/yL热启动Taq酶。
[0048] (3)琼脂糖凝胶电泳分析试剂:琼脂糖、TAE缓冲液、DNA分子量标准、Goldvi ew染色 液和DNA上样缓冲液，该缓冲液以溴酚蓝为指示剂稀释至1倍后使用。
[0049] 使用上述运动后体质恢复状况基因检测试剂盒按如下步骤进行检测：
[0050] (1)提取样本基因组DNA
[00511 采集该测试者唾液，向l_2ml唾液样品中加入500yL提取缓冲溶液，该DNA提取缓冲 溶液溶剂为50mM的Tris-HCl pH7.4、0.5mM的EDTA和50mM的NaCl，反复吹打混匀后，8000 X g 离心5min，弃去上清，此步骤重复一次;得到的沉淀中加入500yL裂解液，该裂解液溶剂为 50mM Tris-HCl pH7.4,50mM Tris-HCl pH7.4,150mM NaCl,lmM EDTA,l%Triton x-100, 1 % Sodium deoxycholate，0.1 % SDS，蛋白酶K20mg/mL，彻底悬浮沉淀并充分混勾后，室温 放置30min，期间来回颠倒离心管数次;得到的混合液中，加入浓度为1 Omg/mLRNA酶的水溶 液10yL，37°C下静置10min;得到的上清液中，加入等体积苯酚-氯仿混合溶液，苯酚和氯仿 体积比为1:1，充分混匀，混合液4°C，12000 X g离心5min，上清液移入干净离心管内；加入等 体积苯氛-氯仿-异戊醇混合溶液，苯酚、氯仿和异戊醇体积比为25: 24:1，充分混匀后，4°C， 12000 X g离心5min，上清液移入干净离心管内；加入等体积氯仿-异戊醇混合溶液，充分混 匀后，4°C，12000 X g离心5min，上清液移入干净离心管内；加入0.6倍体积的冰浴异丙醇溶 液及0.1倍的3mol/L醋酸钠溶液，-20°C静置60min后，4°C，12000Xg离心10min，弃上清液； 得到的沉淀物中加入0.5mL 70%乙醇清洗沉淀物，4°C，12000 X g离心5min，弃上清液，此步 骤重复一次;得到的沉淀物自然风干，加入20yL无菌超纯水回溶，电泳检测，-20°C保存。
[0052] (2)PCR 扩增
[0053] 本实施例同时检测rsl042725、rs6060369。每个SNP的检测需要一对上下游引物、 两条多态引物共4条PCR引物，共需要8条引物。每个SNP的检测需要做两管PCR扩增，为防止 出现假阳性之类的反应，衡量PCR是否成功，加设一管阴性对照组，共做5管PCR，所述阴性对 照组基因组模板及反应体系是一样的，但没有引物存在。
[0054] 根据不同的检测位点，用相应的引物按如下比例分别配制PCR反应体系：2.5yL10 X PCR缓冲液，2yL dNTPs，0.5yL引物组，热启动Taq酶0.15yL，基因组模板80mg，添加超纯水 至总体积为25yL。
[0055] 将装有反应溶液的Eppendorf试管放入ABI 9700PCR仪中，设置反应条件如下：预 变性95°C3min;热循环941€3〇8,6〇1€3〇8,721€3〇8,35个循环 ；延伸721€3111丨11。反应结束后， 取出试管。
[0056] 由于5管PCR扩增反应是在同一台PCR仪上同步进行的，为了实现检测的高效性、特 异性，要求8条PCR引物的Tm值相近，为此需要先进行大量的DNA序列软件分析来设计PCR引 物，并通过大量的实验来进行Tm值的优化并确定设计的合理性，本试剂盒各基因 SNP多态性 的检测是既相对独立又相互联系的，不可分割。
[0057] (3)琼脂糖凝胶电泳检测
[0058] 将扩增后的产物进行琼脂糖电泳检测，过程如下：3g琼脂糖，加入lOOmL去离子水， 微波炉加热lmin，冷却到60°C时加入5yL Goldview染色液，制成3%的琼脂糖凝胶。PCR产物 10yL与6 X TBE缓冲液0.8yL混合上样，电压100V电泳15min。紫外灯下读取结果并拍照，所得 琼脂糖电泳检测图如图1所示。
[0059] 检测得到2个基因分型分析结果如下：
[0060]
[0061]根据以上分析结果，表明受测者可能会较人群平均身高略高。身高受遗传影响较 大，也会受到营养摄入、发育环境的影响。如果在遗传角度具有较高身高的趋势，则更应当 在日常生活中，保证营养的摄入，那么就更加能够保证在成年后的身高优势。
[0062]对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在 不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论 从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权 利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有 变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
【主权项】
1. 一种人体身高预测的基因检测试剂盒，包括盒体及盒体内单独存放的试剂，其特征 在于，单独存放的试剂包括： (1) 针对2个基因 SNP多态位点的PCR反应引物组，引物序列方向均为5 '端至3 '端： 针对SNP rsl042725的引物组： 1GGCAATCTCT CTCTGTG 2CTTGGTTAAAAAATTTTCAAG 3CTACCTCTG AATGTTACAAC 4GTACTAGACTGTAAATTCT； 针对SNP rs6060369的引物组： 1CATGCAGATA TTTTATAAGC 2CCCGTCCCTGGCCTG 3GAGCACTCA ATAGGAGGCTC 4GCTGCTCATTTAGCCT； (2) PCR扩增试剂：10XPCR缓冲液，该PCR缓冲液由90~llOmM Tris-HCl pH8.3、480~ 520mM KC1、13~17mM MgCl2组成；dNTPs混合物，该dNTPs混合物由三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷 酸dGTP、三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸dATP、三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸dTTP、三磷酸胞嘧啶脱 氧核苷酸dCTP四种核苷酸组成，各组分浓度为2.3~2.7mM; 4~6U/yL热启动Taq酶;基因组 模板； (3) 琼脂糖凝胶电泳分析试剂:琼脂糖、TAE缓冲液、DNA分子量标准、DNA无毒染色液和 DNA上样缓冲液，该缓冲液以溴酚蓝为指示剂稀释至1倍后使用。2. 根据权利要求1所述的人体身高预测的基因检测试剂盒，其特征在于，所述DNA无毒 染色液为Biotium Gelred无毒染料或Goldview染色液。3. -种如权利要求1所述的人体身高预测的基因检测试剂盒的检测方法，其特征在于， 步骤如下： (1)提取样本基因组DNA 采集测试者唾液，向1~2ml唾液样品中加入480~520yL提取缓冲溶液，该提取缓冲溶 液溶剂为48~52mM的Tris-HCl pH7 ·4、0 · 5~0 · 6mM的EDTA和48~52mM的NaCl，反复吹打混 匀后，8000 Xg离心4~6min，弃去上清，此步骤重复一次;得到的沉淀中加入480~520yL裂 解液，该裂解液溶剂为48~52mM Tris-HCl ρΗ7·4,48~52mM Tris-HCl ρΗ7·4，145~155mM NaCl，0.9~l.lmM EDTA，0.9~l.l%Triton χ_100,0·9~l.l%Sodium deoxycholate， 0.09~0.11 % SDS，蛋白酶K20mg/mL，彻底悬浮沉淀并充分混匀后，室温放置28~32min，期 间来回颠倒离心管数次;得到的混合液中，加入浓度为9~1 lmg/mL RNA酶的水溶液9~11μ L，36~38°C下静置9~1 lmin;得到的上清液中，加入等体积苯酚-氯仿混合溶液，苯酚和氯 仿体积比为0.9~1.1:1，充分混匀，混合液3~5 °C，12000 X g离心4~6min，上清液移入干净 离心管内；加入等体积苯氛-氯仿-异戊醇混合溶液，苯酚、氯仿和异戊醇体积比为24~26: 23~25:1，充分混勾后，3~5°C，12000 X g离心4~6min，上清液移入干净离心管内；加入等 体积氯仿-异戊醇混合溶液，充分混匀后，3~5°C，12000 X g离心4~6min，上清液移入干净 离心管内；加入0.5~0.7倍体积的冰浴异丙醇溶液及0.09~0.11倍的2.8~3.2mol/L醋酸 钠溶液，-19~_21°C静置57~63min，3~5°C，12000Xg离心9~llmin，弃上清液;得到的沉 淀物中加入ο. 4~0.6mL 70 %乙醇清洗沉淀物，3~5 °C，12000 X g离心4~6min，弃上清液， 此步骤重复一次;得到的沉淀物自然风干，加入18~22yL无菌超纯水回溶，电泳检测，-20°C 保存； (2) PCR扩增 每个SNP的检测需要一对上下游引物、两条多态引物共4条PCR引物，共需要8条引物，每 个SNP的检测需要做两管PCR扩增，为防止出现假阳性之类的反应，衡量PCR是否成功，加设 一管阴性对照组，共做5管PCR，阴性对照组基因组模板没有引物存在； 根据不同的检测位点，用相应的引物按如下比例分别配制PCR反应体系：2.3~2.7yL 10 X PCR缓冲液，1 · 8~2 · 2yL dNTPs，0 · 4~0 · 6yL引物组，热启动Taq酶0 · 12~0 · 18yL，基因 组模板78~82mg，添加超纯水至总体积为24~26yL; 将装有反应溶液的Eppendorf试管放入PCR仪中，设置反应条件如下：预变性94~96°C 2.5~3.5111丨11;热循环93~951€28~328,59~611€28~328,71~73 1€28~328,35个循环；延 伸71~73°C2.5~3.5min，反应结束后，取出试管； (3) 琼脂糖凝胶电泳检测 将扩增后的产物进行琼脂糖电泳检测，过程如下：2.7~3.3g琼脂糖，加入95~105mL去 离子水，微波炉加热55~65s，冷却到58~62°C，加入4.8~5.2yL DNA无毒染色液，制成2.9 ~3.1 %的琼脂糖凝胶，用9~1 lyL的PCR产物与0.7~0.9yL的6 X TBE缓冲液混合上样，在98 ~102V电压下电泳14~16min，紫外灯下读取结果并拍照。
【文档编号】C12Q1/68GK105838813SQ201610343122
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2016年5月22日
【发明人】李则轩
【申请人】深圳中美基因研究院有限公司