一种临床检测耳聋相关基因突变的hrm方法及试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种临床检测耳聋相关基因突变的HRM方法及试剂盒。通过提取待测样本DNA，使用如SEQ ID NO.1?30所示的引物进行PCR扩增和HRM扫描分析；根据扫描分析结果判断耳聋相关基因突变类型，HRM扫描分型无突变峰的样本为阴性，HRM扫描分型有突变峰的样本为阳性。本发明的试剂盒包含上述引物、质控品、PCR试剂和饱和荧光染料等；该试剂盒全部引物能在同一温度下进行PCR反应，检测灵敏度高，特异性强，反应体系小，检测样本来源丰富，反应简便迅速试剂价格低廉，高通量。本发明适用于临床新生儿遗传性耳聋基因筛查和优生优育孕前耳聋基因筛查，有助于指导优生优育和临床个体化用药。
【专利说明】
一种临床检测耳聋相关基因突变的HRM方法及试剂盒
技术领域
[0001] 本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种用于临床检测五种常见耳聋相关基 因突变的HRM方法及试剂盒。
【背景技术】
[0002] 耳聋是一种全球性的人类感觉神经缺陷，影响近6亿人口的健康，每1000儿童中约 有2~6人在出生或幼年时即遭遇严重的听力丧失，遗传因素在发病中占有重要位置。约 80%遗传性耳聋为非综合征型(non-syndromic hearing loss ,NSHL)，即不伴有其他症状 的耳聋，其中常染色体隐性遗传性非综合征型耳聋(ARNSHL)占 NSHL的80%。迄今为止，已报 道的与ARNSHL有关的耳聋基因突变位点多达46个（Hilgert N, Smith RJ, Van Camp G.Forty-six genes causing nonsyndromic hearing impairment:which ones should be analyzed in DNA diagnostics,Mutation research 2009;681:189-196·)，中国患者 中最常见的耳聋基因为GJB2、SLC26A4、mtDNA12S rRNA(Jiang Y，Huang S，Deng T，et al.Mutation Spectrum of Common Deafness-Causing Genes in Patients with Non-Syndromic Deafness in the Xiamen Area,China.PLoS 0ne.2015;10(8):e0135088·)。这 些基因突变的精准检测对遗传性耳聋疾病的临床诊断、治疗、预防以及指导优生优育均有 重要意义。
[0003] GJB2基因突变与ARNSHL的发生密切相关。约50%的ARNSHL患者存在GJB2基因突变 (Walsh T , Shahin H , EI kan-Mi Her T e t al . Whole exome sequencing and homozygosity mapping identify mutation in the cell polarity protein GPSM2 as the cause of nonsyndromic hearing loss DFNB82.American journal of human genetics 2010;87:90-94.)。6贝2基因位于人染色体13ql 1-12上，编码区长度为681bp，编 码产物是缝隙连接蛋白26(Connexin-26，Cx26)<Xx26蛋白含226个氨基酸，以六聚体的形式 在细胞缝隙连接处形成穿膜通道，是细胞间电解质(尤其是钾离子的循环）、第二信使和代 谢产物的细胞间转运的重要通路，在信息传递和物质交换中发挥重要作用（Nickel R， Forge A. Gap junctions and connexins in the inner ear: their roles in homeostasis and deafness . Current opinion in otolaryngoIogy&head and neck surgery 2008;16:452-457.)。缝隙连接蛋白在内耳中的分布分为耳蜗基底膜上皮细胞(支 持细胞)缝隙连接系统和耳蜗侧壁的结缔组织(血管纹和螺旋韧带)缝隙连接系统。Cx26的 表达具有细胞特异性，是耳蜗上皮细胞主要表达的两种缝隙连接蛋白之一（Zhao HB，Yu N.Distinct and gradient distributions of connexin26 and connexin30 in the cochlear sensory epithelium of guinea pigs. The Journal of comparative neurology 2006;499:506-518.)，对钾离子经内耳毛细胞循环回流入耳蜗内淋巴液起到调 控作用。目前研究显示GJB2基因的突变几乎覆盖整个编码区，突变位点在不同种族中存在 很大的差异，常见的突变位点包括235delC、299~300delAT、176dell6bp、35delG等，且多为 缺失突变（Dai P，Yu F，Han B et al.GJB2 mutation spectrum in 2,063 Chinese patients with nonsyndromic hearing impairment. Journal of translational medicine 2009; 7: 26.)。我国大规模耳聋分子流行病学发现中国汉族人群以235delC突变 最常见，检出率为13.96% (Zheng J，Ying Z，Cai Z et al.GJB2 Mutation Spectrum and Genotype-Phenotype Correlation in 1067 Han Chinese Subjects with Non-Syndromic Hearing Loss.PloS one 2015;10:6〇128691.)。6贝2基因序列中某些核苷酸的 缺失、插入、移码等突变，可产生功能缺陷或无功能的Cx26蛋白，如235delC的纯合性缺失、 使遗传密码发生移码突变、产生无功能的缝隙连接蛋白，降低缝隙连接的通透性，影响通道 的正常开闭，进入耳蜗内淋巴循环的钾离子减少，导致耳蜗内Corti器钾中毒，从而引起感 音神经性耳聋（sensorineural hearing loss,SNHL)(Terrinoni A,Codispoti A1Serra V et al.Connexin 26(GJB2)mutations as a cause of the KID syndrome with hearing loss.Biochemical and biophysical research communications 2010;395:25-30·)〇因 此，编码Cx26的GJB2基因突变检测成为临床精准诊断遗传性耳聋及个体化治疗的重要靶 点。
[0004] SLC26A4基因 （solute carrier family 26A，SLC26A)，属于离子转运体26A基因家 族，编码跨膜蛋白Pendr in，其突变可导致伴有前庭水管扩大的NSHL，与Pendred综合征的致 病基因相同。SLC26A4基因定位于人染色体7q31上，全长4930bp，含有21个外显子，开放阅读 框2343bp，编码的Pendrin蛋白在内耳主要表达于内淋巴管、内淋巴囊、椭圆囊和球囊斑相 连的非感觉上皮以及外沟的外侧壁，介导氯离子的转运，维持内淋巴液的离子平衡。在伴有 前庭水管扩大的NSHL患者（或合并Pendre综合征）中约50%携带SLC26A4突变(Alasti F， Van Camp G,Smith RJH.Pendred Syndrome/DFNB4. In:Pagon RA,Adam MP,Ardinger HH et al · eds .GeneReviews(R) · Seattle(WA) 1993 ·)。对SLC26A4基因全外显子测序发现IVS7-2A>G是中国前庭水管扩大耳聋患者人群的热点突变，占所有突变的57.63 % (Wang QJ，Zhao YL,Rao SQ et al.A distinct spectrum of SLC26A4 mutations in patients with enlarged vestibular aqueduct in China.Clinical genetics 2007;72:245_254.)〇 IVS7-2A>G突变位于外显子8剪切位点的位置，即内含子7的3'末端距外显子8起始位置的2 个碱基处，突变后该位置的腺嘌呤被鸟嘌呤置换，使前体mRNA不能正常剪接，外显子8完全 丢失，从而导致Pendrin的翻译发生移框或提前终止，影响Pendrin的结构和功能，使携带该 突变的个体发生耳聋。
[0005]线粒体基因(mtDNA)具有母系遗传特点，其突变与氨基糖戒类药物致聋(Aminogly coside Antibiotic-Induced Deafness ,AAID)和非综合征型耳聋有关。3%以上的感音神 经性耳聋患者中存在线粒体基因突变（Liu X，Dai P，Huang DL, et al .Large-scale screening of mtDNA A1555G mutation in China and its significance in prevention of aminoglycoside antibiotic induced deafness.Zhonghua yi xue za zhi.2006；86(19):1318-22.Jiang Y1Huang S1Deng T,et al.Mutation Spectrum of Common Deafness-Causing Genes in Patients with Non-Syndromic Deafness in the Xiamen Area,China.PLoS 0ne.2015;10(8) :e0135088.)。其中非综合征型耳聋常见的 mtDNA突变位点是 12SrRNA的A1555G和C1494 T突变（Ding Y,Leng J,Fan F,Xia B,Xu P. The role of mitochondrial DNA mutations in hearing loss.Biochemi cal genetics 2013;51:588-602. )<X1494T和A1555G突变均位于mtDNA 12SrRNA的小核糖体亚 单位的编码区域，其序列从细菌到哺乳动物高度保守。由C1494T或A1555G突变所形成新的 U-A或G-C碱基配对导致rRNA的二级结构与大肠杆菌16SRNA的相应区域更加相似，因而该突 变使线粒体DNA更容易与氨基糖戒类药物结合(Hamasaki K,Rando RR.Specific binding of aminoglycosides to a human rRNA construct based on a DNA polymorphism which causes aminoglycoside-induced deafness . Biochemistry 1997；36:12323-12328.)。氨基糖甙类抗生素耳毒性的发生机制:氨基糖甙类抗生素进入耳蜗和前庭积累， 通过与12SrRNA C1494T或A1555G突变的线粒体相互作用，抑制线粒体蛋白合成，线粒体的 翻译缺陷导致耳蜗和前庭细胞内ATP的生成下降，同时大量活性氧(ROS)产生，损伤线粒体 和细胞内的蛋白、脂类和核酸等，线粒体的转运通道开放并启动细胞死亡途径，导致耳蜗和 前庭细胞功能的丧失或细胞死亡并出现听力损失。携带线粒体A1555G突变者在没有使用氨 基糖甙类抗生素的情况下也可出现耳聋。因此，mtDNA C1494T或A1555G突变的检测对药物 性耳聋的早期诊断和预防，以及指导携有该突变的育龄女性优生优育具有重要意义。
[0006]目前，针对GJB2、SLC26A4、mtDNA12SrRNA基因突变位点的检测，临床常用方法有两 种:一是DNA直接测序法，虽然其是目前公认金标准方法，但必须有DNA测序仪，试剂成本高， 而且操作烦锁，灵敏度不高（只能检出突变频率高于25 %的突变）；二是基因芯片法(博奥生 物有限公司），其特点是高通量，但存在阳性检出率和准确率较传统方法低(尤其是SLC26A4 基因突变位点），试剂耗量大(25yL反应体系），检测时间长，成本高等不足(王国建，张冠斌， 袁永一等.十五项遗传性耳聋基因突变微阵列诊断芯片的临床应用研究.中华耳科学杂志， 2014:6-10)。此外还有荧光定量法、限制性片段长度多态性分析、变性高效液相色谱等等， 但这些方法均存在检测时间长、操作繁琐、灵敏度低等不足。随着国家二胎政策的推出，新 生儿出生缺陷筛查的日益普及，现有的耳聋相关基因突变检测方法已不能满足临床需求， 迫切需要研发一种快速、准确、低成本、高灵敏度的耳聋相关基因检测技术。
[0007] 高分辨溶解曲线(High Resolution Melting，HRM)技术是一种新的检测技术，其 基本原理是基于DNA双链中的A、T、C、G组成不同，在加热变性时不同碱基序列的DNA双链的 解链温度和熔解曲线的形状不同，根据熔解曲线的不同判断是否存在突变。HRM技术使用的 是饱和荧光染料LCGreen，在PCR时以饱和的浓度加入，不会抑制PCR反应。在进行HRM分析 时，由于饱和染料占据了DNA双链每一对碱基上的空位，当双链解链时，染料立即与双链脱 离，荧光信号会发生较大的变化，使用检测灵敏度高。而且，操作简便，样品经PCR扩增后直 接进行HRM，PCR产物实现闭管式操作，无气溶胶污染。由于HRM完全是基于核酸的物理性质 进行分析，因而无需序列特异性探针，检测价格低。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种用于临床检测常见耳聋 相关基因5个位点突变的HRM方法。基于该方法，本发明的目的还在于提供实施该方法的试 剂盒(基于HRM技术的GJB2、SLC26A4、mtDNAl 2SrRNA基因突变检测PCR试剂盒）。
[0009] 本发明的目的通过下述技术方案实现：
[0010] -种用于临床检测耳聋相关基因突变的HRM方法，包括如下步骤:提取待测样本 DNA;使用引物对A、B、C、D、E对样本DNA进行PCR扩增;对PCR产物进行HRM分析;根据分析结果 判断GJB2、SLC26A4、mtDNA12SrRNA基因突变类型，HRM扫描分型无突变峰的样本为阴性，HRM 扫描分型有突变峰的样本为阳性。
[0011] 其中，引物对A用于检测GJB2基因编码区第176位点16bp缺失突变（176dell6bp)， 其优选为以下三对序列中的一对：
[0012] A_F1：CAGGCCGACTTTGTCTG,
[0013] A_R1:GGAGATGGGGAAGTAGTGAT;或
[0014] A_F2：TGAGCAGGCCGACTTTG,
[0015] A_R2:GAGATGGGGAAGTAGTGATCGTA;或
[0016] A_F3：CGACTTTGTCTGCAACACC,
[0017] A_R3:CCGGATGTGGGAGATGG。
[0018] 引物对B用于检测GJB2基因编码区第235位点C碱基缺失突变(235delC)，其优选为 以下三对序列中的一对：
[0019] B_F1:CCACATCCGGCTATGGGCC，
[0020] B_R1:GTGCATGGCCACTAGGAG;或
[0021] B_F2:CTCCCACATCCGGCTATGGGC，
[0022] B_R2:CATGGCCACTAGGAGCGC;或
[0023] B_F3:CTCCCACATCCGGCTATGGGC，
[0024] B_R3:CACTAGGAGCGCTGGCG。
[0025]引物对C用于检测SLC26A4基因 IVS7-2A>G位点突变，其优选为以下三对序列中的 一对：
[0026] C_F1:ACAAGGAATTATTAAAACCAATGGAG，
[0027] C_R1:ATGGCAGTAGCAATTATCGT;或
[0028] C_F2:AACCAATGGAGTTTTTAACATCTTT，
[0029] C_R2:TATGAAATGGCAGTAGCAATTATCG;或
[0030] C_F3：AACCAATGGAGTTTTTAACATCTTT,
[0031] C_R3:TTGGCTCCATATGAAATGGCA。
[0032] 弓丨物对D用于检测mtDNA 12SrRNA基因 C1494T突变，其优选为以下三对序列中的一 对：
[0033] D_F1:GTACACACCGCCCGTCA，
[0034] D_R1:ATAAATGCGTAGGGGTTTTAGT;或
[0035] D_F2:GTACACACCGCCCGTCA，
[0036] D_R2:GGGTTTTAGTTAAATGTCCTTTGAAG;或
[0037] D_F3：GTACACACCGCCCGTCA,
[0038] D_R3：CGTAGGGGTTTTAGTTAAATGTCCo
[0039] 引物对E用于检测mtDNA 12SrRNA基因 A1555G突变，其优选为以下三对序列中的一 对：
[0040] E_FI:CATTTAACTAAAACCCCTACGCA，
[0041 ] E_R1:TTTCCAGTACACTTACCATGTTACGA;或
[0042] E_F2:ACTTCAAAGGACATTTAACTAAAACC，
[0043] E_R2:ACACTTACCATGTTACGACTTG;或
[0044] E_F3:ACTTCAAAGGACATTTAACTAAAACC，
[0045] E_R3:TTTCCAGTACACTTACCATGTTACGA。
[0046] 上述引物通过如下方法设计得到：针对常见的GJB2、SLC26A4、mtDNA12SrRNA基因 突变位点，从PUBMED在线数据库检索GJB2、SLC26A4、mtDNAl2SrRNA基因突变位点的DNA序 列，通过NCBI BLAST软件(http : //www.ncbi .nlm.nih · gov/BLAST/)进行比对，然后应用 LightScannerPr imer( IdahoTechnologyInc，USA)软件针对这些突变区域设计引物。经过反 复试验筛选和验证，得到了一组扩增效率高、特异性好、能够正确区分待检测样本耳聋相关 基因突变的引物。
[0047] -种基于HRM技术的耳聋相关基因突变检测PCR试剂盒，包含上述引物对A、B、C、D 和/或E。
[0048] 优选的，所述的试剂盒还包括质控品，质控品包括两组:①上海生工生物工程股份 有限公司合成的GJB2基因176de 116bp、235de IC突变阳性对照、临界阳性对照和阴性对照； S L C 2 6 A 4基因 IV S 7 - 2 A > G突变阳性对照、临界阳性对照和阴性对照品；m t D N A12 S r R N A A1555G、C1494T突变阳性对照、临界阳性对照和阴性对照（表1)。②武汉市妇女儿童保健中 心提供的经DNA测序确认的上述位点突变阳性和阴性的临床患者基因组DNA对照。
[0049] 衷1.耳砻相关基闵质棹品信息
[0051 ] 所述的试剂盒还包含PCR试剂(dNTPs、DNA聚合酶、DNA聚合酶buffer等）和饱和荧 光染料(如LC GREEN)等。
[0052]上述试剂盒的使用方法，包括如下步骤：提取待测样本DNA;配制包含待测样本 DNA、引物对、PCR试剂和饱和荧光染料的PCR反应体系进行PCR扩增;对PCR产物进行HRM分析 扫描。该使用方法不用于疾病的诊断。
[0053] 所述的PCR反应体系优选为：Taq buffer(10 X ) IyL，dNTPs(IOmM) IyL，Taq(2U/yL) lyL，上游引物(F)0.5yL，下游引物(R)0.5yL，LC GREEN IyUMgCl2 0.8yL，ddH20 3.2yL，DNA IyL0
[0054] 所述的 PCR 扩增条件优选为：951€2111丨11;95°(：158,60°(：158,72°(：158,45个循环 ；72 〇C 7min, 94 〇C 30s, 28 〇C 30s 〇
[0055] 所述的HRM分析扫描条件优选为:95 °C 5s，40 °C 30s，65 °C保温，70 °C~90 °C扫描。
[0056] 本发明基于HRM技术的耳聋相关基因突变检测PCR试剂盒可分为检测系统和质控 系统两个部分。检测系统包括上述5种引物对，可由其中的任意一种组合而成。质控系统则 包括:①阴性对照，包括2种，第1种是不含耳聋相关基因突变的正常人DNA模板;第2种是人 工合成的野生型DNA质控品。正常情况下，所有阴性对照HRM分析无突变峰，若HRM分析出现 突变峰，则表明实验过程中存在污染。②阳性对照，包括2种，第1种是经DNA测序证实含耳聋 相关基因突变的患者DNA模板;第2种是人工合成的含有待测耳聋基因突变位点阳性的DNA 质控品；正常情况下，阳性质控品应出现突变峰、而阴性质控品不出现突变峰，可作为判断 阳性的标准;若阳性质控品不出现突变峰则说明实验失败。
[0057] 本发明提供的试剂盒具有如下优点:①针对特定基因突变的全部引物能在同一温 度下(60°C)进行稳定的PCR反应，获取特异性的基因片段;②检测灵敏度高，特异性强，可以 检测5%拷贝数突变;③小反应体系（IOyL)，标本和试剂用量少;④采用检测样本为DNA，来 源丰富，可支持组织、胸水等多种来源的标本;⑤反应简便迅速，2小时即可获得实验结果， 便于临床大样本处理;⑥试剂价格低廉，高通量。试验表明，本发明提供的HRM方法可快速检 测耳聋相关基因的多种常见突变（图1、图2、图3、图4、图5、图6、图7、图8、图9、图10)，适用于 临床新生儿遗传性耳聋基因筛查和优生优育孕前耳聋基因筛查。本发明为耳聋相关基因突 变的快速检测提供了一种新的检测方法，可用于临床指导用药、突变携带者的生活指导和 优生优育。
【附图说明】
[0058]图1是实施例1不同突变含量的GJB2基因176dell6bp突变质控品检测结果图（标准 化的溶解曲线峰），百分比表示突变含量，QCl、QC2、QC3对应的突变含量为100%、0%、5%。 [0059]图2是实施例1不同突变含量的GJB2基因235delC突变质控品检测结果图（标准化 的溶解曲线峰），百分比表示突变含量，QCl、QC2、QC4对应的突变含量为100%、0%、5%。
[0060]图3是实施例1不同突变含量的SLC26A4基因 IVS7-2A>G突变质控品检测结果图（标 准化的溶解曲线峰），百分比表示突变含量，QC5、QC6、QC7对应的突变含量为100 %、0 %、 5%〇
[0061 ] 图4是实施例1不同突变含量的mtDNA 12SrRNA基因 C1494T突变质控品检测结果图 (标准化的溶解曲线峰），百分比表示突变含量，QC8、QC9、QC10对应的突变含量为100 %、 0%、5%〇
[0062] 图5是实施例1不同突变含量的mtDNA 12SrRNA基因 A1555G突变质控品检测结果图 (标准化的溶解曲线峰），百分比表示突变含量，QC8、QC9、QC11对应的突变含量为100 %、 0%、5%〇
[0063]图6是实施例2临床标本GJB2基因176dell6bp突变检测结果图，百分比表示突变含 量。
[0064]图7是实施例2临床标本GJB2基因235delC突变检测结果图，百分比表示突变含量。 [0065] 图8是实施例2临床标本SLC26A4基因 IVS7-2A>G突变检测结果图。
[0066] 图9是实施例2临床标本mtDNA 12SrRNA基因 C1494T突变检测结果图。
[0067] 图10是实施例2临床标本mtDNA 12SrRNA基因 A1555G突变检测结果图。
【具体实施方式】
[0068]下面结合实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不 背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本 发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手 段。
[0069] 实施例1人工合成DNA质控品的耳聋相关基因突变检测 [0070] (1)稀释DNA质控品
[0071] DNA质控品为上海生工生物工程股份有限公司合成的耳聋相关基因5个突变位点 不同突变含量的DNA。采用无菌双蒸水将DNA质控品稀释至0. lng/yL。
[0072] (2)引物序列及检测的突变位点如列表2所示。
[0073]表2.引物序列及检测位点的信息
[0076] 采用表2中5对引物进行PCR反应，扩增得到目的DNA13PCR反应液包括10 Xbuffer (Biostar)、10ymol/L的上下游引物、10mmol/L dNTPs(罗氏公司）、2U Taq DNA聚合酶 (Biostar)、LC GREEN( IdahoTechnologyInc，USA)和无菌水。
[0077] IOyL的PCR反应体系：Taq buffer(10 X ) IyL，dNTPs(IOmM) IyL，Taq(2U/yL) IyL，上 游引物〇.5yL，下游引物0.5yL，LC GREEN IyUMgCl2 〇.8yL，ddH2〇 3.2yL，DNA lyL。其中DNA 为上海生工生物工程股份有限公司合成的耳聋相关基因5个突变位点不同突变含量的质控 品。
[0078] (3)加样完成后，将反应管直接置于 LightScanner_32( IdahoTechnologyInc，USA) 仪器中进行反应。
[0079] 具体扩增条件为：951€2111丨11;95°(：158,60°(：158,72°(：158,45个循环 ；721€7111丨11，94 〇C 30s, 28 〇C 30s 〇
[0080] 具体HRM分析扫描条件为:95 °C 5s，40 °C 30s，65 °C保温，70 °C~90 °C扫描。
[0081] (4)结果判读
[0082] 按照上述步骤（1)~（3)，分别对耳聋相关基因的5个突变位点进行检测。结果表 明，阴性对照均为单一峰，即未分型；阳性对照均显示为杂合双峰或宽峰，即分型成功;针对 每个突变位点进行检测时，仅存在突变的标本才会出现相应的杂合双峰或宽峰。图1-5为耳 聋相关基因5个突变位点不同突变含量质控品的检测结果图，突变型DNA解链温度较低，突 变峰位于左侧，而且突变含量越高突变峰越高。
[0083] 实施例2临床标本的检测 [0084] (1)提取患者外周血DNA模板
[0085] ①取抗凝血200yL，②使用TIANamp Genomic DNA Kit(中国TIANGEN公司）提取全 血标本DNA，按照说明书操作。
[0086] (2)按照实施例1的方法，对30例临床耳聋患者标本(武汉市妇女儿童保健中心，湖 北武汉）以及上海生工生物工程股份有限公司合成的质控品进行耳聋基因突变双盲检测， 结果见图6-10和表3-7。检测结果与临床报告结果(测序法)具有良好的一致性。
[0087] 表3.GJB2基因编码区176dell6bp突变临床标本检测结果比较
[0099] 因此，实施例2结果表明本发明建立的HRM方法检测耳聋基因突变的结果与金标准 测序方法具有良好的一致性。
[0100] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的 限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化， 均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种基于HRM技术的耳聋相关基因突变检测PCR试剂盒，其特征在于:包含引物对A、 B、C、D和/或E; 其中，引物对A用于检测GJB2基因编码区第176位点16bp缺失突变，其为以下三对序列 中的一对： A_F1:CAGGCCGACTTTGTCTG， A_R1:GGAGATGGGGAAGTAGTGAT;或 A_F2:TGAGCAGGCCGACTTTG， A_R2:GAGATGGGGAAGTAGTGATCGTA;或 A_F3：CGACTTTGTCTGCAACACC, A_R3：CCGGATGTGGGAGATGG； 弓丨物对B用于检测GJB2基因编码区第235位点C碱基缺失突变，其为以下三对序列中的 一对： B_F1:CCACATCCGGCTATGGGCC， B_R1:GTGCATGGCCACTAGGAG;或 B_F2:CTCCCACATCCGGCTATGGGC， B_R2:CATGGCCACTAGGAGCGC;或 B_F3:CTCCCACATCCGGCTATGGGC， B_R3：CACTAGGAGCGCTGGCG； 引物对C用于检测SLC26A4基因 I VS7-2A>G位点突变，其为以下三对序列中的一对： C_F1:ACAAGGAATTATTAAAACCAATGGAG， C_R1:ATGGCAGTAGCAATTATCGT;或 C_F2：AACCAATGGAGTTTTTAACATCTTT, C_R2:TATGAAATGGCAGTAGCAATTATCG;或 C_F3：AACCAATGGAGTTTTTAACATCTTT, C_R3：TTGGCTCCATATGAAATGGCA； 引物对D用于检测mtDNA 12 SrRNA基因 C1494T突变，其为以下三对序列中的一对： D_F1:GTACACACCGCCCGTCA， D_R1:ATAAATGCGTAGGGGTTTTAGT;或 D_F2：GTACACACCGCCCGTCA, D_R2:GGGTTTTAGTTAAATGTCCTTTGAAG;或 D_F3：GTACACACCGCCCGTCA, D_R3：CGTAGGGGTTTTAGTTAAATGTCC； 引物对E用于检测mtDNA 12SrRNA基因 A1555G突变，其为以下三对序列中的一对： E_F1:CATTTAACTAAAACCCCTACGCA， E_R1:TTTCCAGTACACTTACCATGTTACGA;或 E_F2:ACTTCAAAGGACATTTAACTAAAACC， E_R2:ACACTTACCATGTTACGACTTG;或 E_F3:ACTTCAAAGGACATTTAACTAAAACC， E_R3:TTTCCAGTACACTTACCATGTTACGA。2. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于:包括阴性对照、阳性对照；阴性对照为不 含耳聋相关基因突变的正常人DNA或人工合成的野生型DNA，阳性对照为含有相应突变位点 的耳聋患者DNA或人工合成的突变型DNA。3. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于:包括临界阳性对照，临界阳性对照包括： 5%拷贝数突变的GJB2基因176dell6bp突变、235delC突变的DNA，5%拷贝数突变的SLC26A4 基因 IVS7-2A>G突变的DNA，5%拷贝数突变的mtDNA 12SrRNA基因 C1494T突变、A1555G突变 的 DNA。4. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于:包含PCR试剂和饱和荧光染料。5. 权利要求1-4任一项所述的试剂盒的使用方法，其特征在于包括如下步骤:提取待测 样本DNA;配制包含待测样本DNA、引物对、PCR试剂和饱和荧光染料的PCR反应体系进行PCR 扩增;对PCR产物进行HRM分析扫描;该使用方法不用于疾病的诊断。6. 根据权利要求5所述的使用方法，其特征在于:所述的PCR反应体系为:Taq buffer 1 yL，dNTPs lyL，Taq lyL，上游引物0.5yL，下游引物0.5yL，LC GREEN lyL，MgCl2 0.8yL， ddH20 3.2yL,DNA lyL〇7. 根据权利要求5所述的使用方法，其特征在于:所述的PCR扩增条件为:95 °C 2min; 95 。(：158,60。(：158,72。(：158,45个循环；721€711^11，94 1€3〇8,281€3〇8。8. 根据权利要求5所述的使用方法，其特征在于:所述的HRM分析扫描条件为:95°C5s， 40 °C 30s，65 °C 保温，70 °C ~90 °C 扫描。
【文档编号】C12Q1/68GK106086186SQ201610459975
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月22日
【发明人】刘松梅, 袁二凤, 黄景涛
【申请人】武汉大学