一种准确鉴别回捕褐牙鲆中放流鱼的方法
【专利摘要】一种准确鉴别回捕褐牙鲆中放流鱼的方法，属于增殖放流领域，该方法首先进行形态学上区分，然后对褐牙鲆的线粒体DNA进行PCR扩增，通过倍型分析进一步确定疑似放流褐牙鲆，最后再分有针对性的进行荧光标记微卫星标记多重PCR扩增，确定放流个体，本发明方法减少了放流个体鉴定的盲目性，减轻了工作量，提高鉴定效率。
【专利说明】
一种准确鉴别回捕褐牙鲆中放流鱼的方法
技术领域
[0001] 本发明属于增殖放流领域，具体地涉及一种准确鉴别回捕褐牙鲆中放流鱼的方 法。
【背景技术】
[0002] 褐牙鲆(Paralichthys olivaceus)是我国黄渤海地区重要的渔业资源，具有个体 大、肉质细嫩鲜美等特点，深受广大消费者的喜爱。由于沿海水域环境污染日益严重，加上 捕捞强度不断增大，野生褐牙鲆的自然资源量不断减小。为了恢复褐牙鲆资源，从20世纪90 年代开始，科研工作者将大量人工繁育的褐牙鲆苗种投放到黄渤海海域。增殖放流的效果 究竟如何?这是政府和渔业工作者普遍关心的话题。增殖放流效果评估涉及到放流褐牙鲆 的成活率、生长速度以及回捕率等科学问题，而解决这些问题的关键技术之一是鉴别回捕 褐牙鲆中的放流鱼。
[0003] 目前，尚无鉴别放流褐牙鲆的专利文献，有关鱼类放流群体鉴别技术的专利文献 仅限于CN200710047313.2 (中华舞幼鱼野生种群与人工放流种群的鉴别方法）和 CN200410060149.5(大黄鱼线粒体分子标记及用于养殖群体与野生群体的鉴别）。专利公开 的手段分别是形态学鉴别（鼻孔有无变异、五行骨板椎古板是否磨损等）和线粒体分子标 记。现已发表文献中关于放流褐牙鲆鉴别的方法主要集中在形态学分析(刘奇，2009;吕红 健，2013)和分子标记（陈睿毅，2013;童爱萍，2015)两个方面。形态学分析的缺点是环境因 素对鱼类形态具有决定性，相同环境下同种生物的形态会呈现均一化的趋势，且细微的形 态学差异不易被辨识。线粒体分子标记的缺点是由于具有亲缘关系的个体之间存在共享单 倍型，导致不能识别出与放流鱼亲本具有亲缘关系的个体的后代。微卫星分子标记的缺点 是工作量比较大，只有使用12-18对微卫星引物进行分析时才能达到100%的准确率。尽管 童爱萍等（2015)首次采用线粒体DNA和4对微卫星标记相结合的方法成功对回捕鱼中的放 流褐牙鲆进行了准确鉴定，该方法较单独使用线粒体DNA标记准确，较单独使用微卫星标记 工作量小。但是该方法仅限于在一个体系中扩增单个位点的单重PCR，且使用传统的聚丙烯 酰胺凝胶电泳检测方法。单重PCR的缺点是如果需要扩增多对微卫星标记的话，工作量会增 大。传统的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测方法的缺点是分辨率不高、判读误读率高以及操作无 法自动化规模化等。
【发明内容】
[0004] 本发明要解决的技术问题在于提供一种准确鉴别回捕褐牙鲆中放流鱼的方法，该 方法首先进行形态学上区分，然后对褐牙鲆的线粒体DNA进行PCR扩增，通过倍型分析进一 步确定疑似放流褐牙鲆，最后再有针对性的进行荧光标记微卫星标记多重PCR扩增，确定放 流个体，本发明方法减少了放流个体鉴定的盲目性，减轻了工作量，提高鉴定效率。
[0005] 本发明是通过如下技术方案来实现的：
[0006] -种准确鉴别回捕褐牙鲆中放流鱼的方法，其步骤为：
[0007] a、形态学观察:观察回捕褐牙鲆无眼侧皮肤，具有黑化现象的为放流褐牙鲆；
[0008] b、对无眼侧皮肤没有黑化现象的回捕褐牙鲆进行线粒体DNA标记PCR扩增：
[0009] 1)设计合成一对褐牙鲆线粒体DNA控制区引物序列：
[0010] Dl-d:5 '-CCCACCACTAACTCCCAAAGC-3 ' 和
[0011] DI-S:5 '-TAGGAACCAAATGCCAGGAA-3 '；
[0012] 2)对无眼侧皮肤没有黑化现象的回捕褐牙鲆线粒体DNA进行PCR扩增：
[0013] 进一步，步骤2)中的PCR扩增体系为20ul，包括2 X Es Taq MasterMix IOul、上游 引物0.3ul、下游引物0.3ul、模板DNAO. 5ul以及ddH20 8.9ul。扩增程序为：95 °C 5min- (95 〇C60sec^58〇C60sec^72°C60sec) X33cycles^72〇C10min^4〇C^；
[0014] 3)扩增结果经纯化、测序，然后统计单倍型;单倍型与褐牙鲆母本不一致的为非放 流褐牙鲆，可以直接排除，单倍型一致的为疑似放流褐牙鲆；
[0015] c、对疑似放流褐牙鲆进行荧光标记微卫星引物多重PCR扩增：
[0016] 1)构建3重PCR体系，对疑似放流褐牙鲆进行荧光标记微卫星标记3重PCR扩增，荧 光标记微卫星引物序列见表1;
[0017]表1微卫星引物序列
[0019] 2)毛细管电泳检测:将甲酰胺与分子量内标按100:1的体积比混匀后，取15yL加入 上样板中，再加入IyL稀释10倍的PCR产物，然后使用3730XL测序仪进行毛细管电泳检测； [0020] 3)数据分析:利用Genemarker中的Fragment片段分析软件对测序仪得到的原始数 据进行分析，将各泳道内分子量内标的位置与各样品峰值的位置做比较分析，得到片段大 小。然后与父本和单倍型一致的母本相同微卫星位点的片段大小进行对比，片段大小完全 对应的为放流褐牙鲆。
[0021] 本发明与现有技术相比的有益效果：
[0022] (1)采用荧光标记微卫星引物，经PCR反应扩增后，目的条带也会结合上荧光，可以 利用机器去自动判读目的条带的大小，这样得到的结果不仅精确而且检出效率大大提升， 可用于大规模识别放流回捕个体。
[0023] (2)采用微卫星引物多重PCR扩增体系，多对微卫星标记在一个反应体系内扩增， 既节约了成本，还提高了鉴别效率。
[0024] (3)该方法首先进行形态学上区分，然后对褐牙鲆的线粒体DNA进行PCR扩增，通过 倍型分析进一步确定疑似放流褐牙鲆，最后再有针对性的进行荧光标记微卫星标记多重 PCR扩增，确定放流个体，本发明方法减少了放流个体鉴定的盲目性，减轻了工作量，提高鉴 定效率。
【附图说明】
[0025] 图1褐牙鲆亲缘关系图
【具体实施方式】
[0026] 下面通过实施例来对本发明的技术方案作进一步解释，但本发明的保护范围不受 实施例任何形式上的限制。
[0027] 实施例1:
[0028] -种准确鉴别回捕褐牙鲆中放流鱼的方法，具体步骤如下：
[0029] 1实验材料
[0030] 褐牙鲆母本6尾，编号分别为8522、2512、2528、9204、5278、1019;父本8尾，编号分 别为0228、6#、9048、8#、2591、0285、2509、0289。构建5个家系，其中家系1、3、4和5的亲本已 知，分别为8522乂0228、2512乂6#、2528乂9048和2512乂8#，家系2为野生褐牙鲆后代，不来 自上述14尾亲鱼。每个家系随机取20尾，共计100尾，构建模拟回捕褐牙鲆群体，进行褐牙鲆 亲子鉴定，其中家系1、3、4和5的褐牙鲆为放流群体，家系2的褐牙鲆为自然群体。
[0031] 2实验方法
[0032] 2.1形态学观察
[0033] 经观察，100尾褐牙鲆无眼侧皮肤均无黑化现象，无法鉴别出放流群体。
[0034] 2.2线粒体DNA标记扩增
[0035]剪取6尾褐牙鲆母本和100尾模拟回捕褐牙鲆的鳍条，提取总DNA并标记家系，然后 设计合成一对褐牙鲆线粒体DNA控制区引物序列进行线粒体DNAPCR扩增，所述的引物为01_ d: 5 ' -CCCACCACTAACTCCCAAAGC-3 ' 和Dl-s: 5' -TAGGAACCAAATGCCAGGAA-3 '，对PCR产物进行 测序，用DNAMAN进行多重比对，然后用MEGA5.0构建NJ树，分析亲缘关系，并用DNA SP 5.10 统计单倍型。结果如图1、表2:
[0036]表2褐牙鲆亲本与回捕褐牙鲆单倍型分布表
[0038]图1和表2的结果表明6尾褐牙鲆母本和100尾回捕牙鲆共检测出6种单倍型，其中 亲本1019、5278、7204和家系2个体分别检测出一种单倍型;亲本2515、8522和家系1、3、5的 个体共享一个单倍型；亲本2528和家系4的个体共享一个单倍型。这说明家系2不是放流褐 牙鲆，家系4的个体和亲本2528有亲缘关系，家系1、3、5的个体和亲本1019、5278、7204有亲 缘关系，家系1、3、4和5为疑似放流鱼。
[0039] 2.3荧光标记微卫星引物三重PCR扩增
[0040] 1)构建3重PCR体系根据步骤2.2的结果，运用微卫星标记对家系1、3、4、5的个体和 3 尾母本（2512、8522、2528)以及 8 尾父本（0228、6#、9048、8#、2591、0285、2509、0289)对疑似 放流褐牙鲆进行荧光标记微卫星标记3重PCR扩增，荧光标记微卫星引物序列见表1;
[0041] 2)毛细管电泳检测:将甲酰胺与分子量内标按100:1的体积比混匀后，取15yL加入 上样板中，再加入IyL稀释10倍的PCR产物，然后使用3730XL测序仪进行毛细管电泳检测； [0042] 3)数据分析:利用Genemarker中的Fragment片段分析软件对测序仪得到的原始数 据进行分析，将各泳道内分子量内标的位置与各样品峰值的位置做比较分析，得到片段大 小。然后与父本和单倍型一致的母本相同微卫星位点的片段大小进行对比，片段大小完全 对应的为放流褐牙鲆。结果如下：
[0043]表3褐牙鲆群体(亲本和回捕褐牙鲆)遗传信息
[0047] 表4的结果表明家系1是母本0228和父本8522的后代，家系3是母本2512和父本6# 的后代，家系4是母本2528和父本9048的后代，家系5是母本2512和父本8#的后代。
[0048]综合以上结果，运用该专利方法能够成功的将放流群体从模拟回捕褐牙鲆群体中 鉴别出来。
【主权项】
1. 一种准确鉴别回捕褐牙解中放流鱼的方法，其特征在于所述方法的步骤为： a、 形态学观察:观察回捕褐牙解无眼侧皮肤，具有黑化现象的为放流褐牙解； b、 对无眼侧皮肤没有黑化现象的回捕褐牙解进行线粒体DNA标记PCR扩增： 1) 设计合成一对褐牙解线粒体DNA控制区引物序列： Dl-d:5 '-CCCACCACTAACTCCCAAAGC-3 ' 和 D1-S:5 '-TAGGAACCAAATGCCAGGAA-3 '； 2) 对无眼侧皮肤没有黑化现象的回捕褐牙解线粒体DNA进行PCR扩增： 3) 扩增结果经纯化、测序，然后统计单倍型；单倍型与褐牙解母本不一致的为非放流褐 牙解，可W直接排除，单倍型一致的为疑似放流褐牙解； C、对疑似放流褐牙解进行巧光标记微卫星引物多重PCR扩增： 1) 构建3重PCR体系，对疑似放流褐牙解进行巧光标记微卫星标记3重PCR扩增，巧光标 记微卫星引物序列见表1; 表1微卫星引物序列2) 毛细管电泳检测:将甲酯胺与分子量内标按100:1的体积比混匀后，取15化加入上样 板中，再加入化L稀释10倍的PCR产物，然后使用3730化测序仪进行毛细管电泳检测； 3) 数据分析:利用Genemarker中的Fragment片段分析软件对测序仪得到的原始数据进 行分析，将各泳道内分子量内标的位置与各样品峰值的位置做比较分析，得到片段大小。然 后与父本和单倍型一致的母本相同微卫星位点的片段大小进行对比，片段大小完全对应的 为放流褐牙解。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤2)中的PCR扩增体系为20ul，包括2XES Taq MasterMix lOul、上游引物0.3ul、下游引物0.3ul、模板DNA0.加 及d地2〇 8.9ul。扩 增程序为:95°C 变性 5min，接着 95°C60sec 一 58°C60sec 一 72°C60sec，共 33 个循环，最后 72°C 延伸10min，4°C保存。3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于对疑似放流褐牙解进行巧光标记微卫星标 记3重PCR扩增的扩增体系为20ul，包括2XEs Taq MasterMix lOul、上游引物各0.3ul、下 游引物各0.3ul、模板DNA 2ul W及ddH2〇 6.2ul;扩增程序为：94°C变性5min，接着94°C 60sec 一 54°C35sec 一 72°C40sec，共 35 个循环，最后 72°C 延伸 3min，4°C 保存。
【文档编号】C12Q1/68GK106086174SQ201610422623
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月15日 公开号201610422623.7, CN 106086174 A, CN 106086174A, CN 201610422623, CN-A-106086174, CN106086174 A, CN106086174A, CN201610422623, CN201610422623.7
【发明人】王青林, 司飞, 于姗姗, 王桂兴, 张红涛, 任建功, 于清海, 孙朝徽, 任玉芹, 姜秀凤
【申请人】中国水产科学研究院北戴河中心实验站