专利名称：牙鲆myostatin基因序列的制作方法
技术领域：
本发明涉及肌肉生长抑制素(MYOSTATIN)，具体地说是牙鲆MYOSTATIN基因序列。
背景技术：
Myostatin基因最早于1997年在小鼠中发现，该基因是骨骼肌发育的一种负调控因子，其功能突变失活的小鼠骨骼肌过度发育，单块肌肉要比正常小鼠重2～3倍。在随后的几个月内，3个研究小组分别独立证明产生牛“双肌”性状的基因也是由于Myostatin的突变。对养殖动物来说，后天促进肌肉生长的方法(如使用生长激素等)虽可增加肌肉产量，但往往导致肌肉粗韧，品质下降。Myostatin功能缺失品系可导致肌肉纤维数量增多，在增加肌肉产量的同时保证了肌肉品质细嫩，同时饲料投入基本不增加，这已在有“双肌”性状的肉牛品种中得到体现。现已发现Myostatin基因广泛分布于脊椎动物并且结构保守，在几种鱼类中已克隆到这个基因，但是牙鲆MYOSTATIN克隆及序列未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供牙鲆MYOSTATIN基因序列，该基因能够抑制肌肉的发育，将其突变后可增加肌肉的产生。
为了实现上述目的，本发明的技术方案如下本发明克隆了牙鲆鱼MYOSTATIN基因得到全序列，该序列来源于牙鲆鱼，名称为牙鲆鱼MYOSTATIN或者牙鲆肌肉生长抑制素，该基因能够抑制肌肉的发育，将其突变后可增加肌肉的产生。将突变体转入牙鲆鱼中也可以促进肌肉的发育，增加牙鲆鱼肉的比率，从而提高产量。
图1为牙鲆基因组DNA消化。
图2为第一轮GENOMEWALKING，左第一次PCR；右第二次PCR。
具体实施例方式
实施例1牙鲆基因组GENOMEWALKING基因文库构建a.基因组DNA提取利用牙鲆新鲜的或者-20℃保存的肌肉、肝脏、鳍、精巢、精液等组织作为基因组DNA提取来源。
消化液成分为Tris-HCl，pH8.0 10mmol/L，EDTA，pH8.0 100mmol/L，SDS，pH7.2 1％，Proteinase K 100μg/ml，RNase A 20μg/ml。
将组织剪碎、碾磨后按照1∶5(重量g体积ml)加入消化液，在55℃消化3小时，然后等体积酚，酚∶氯仿(1∶1)，氯仿∶异戊醇(24∶1)各抽提一次，最后上清液加入0.2体积10mol/L乙酸铵，2体积预冷无水乙醇沉淀DNA，离心弃上清，70％乙醇洗涤沉淀2次，室温干燥，按照1∶500(原始重量g体积ul)的量加入TE溶解，-20℃保存。
b.使用7种平末端内切酶彻底消化基因组DNA，避免产生GENOMEWALKING时不能跨越的缺口；7种内切酶为G；基因组DNA1，Dra I；2，Pvu II；3，EcoR V；4，Stu I；5，Sma I；6，Hpa I；7，Sca I；消化结果见图1。
c.连接接头，构建GENOMEWALKING基因文库利用CLONTECH公司UNIVERSAL GENOMEWALKER KIT提供的GENOMEWALKER ADAPTORS，连接已消化基因组DNA，构建文库。
2牙鲆基因组Myostatin基因的克隆a.根据斑马鱼等鱼类以及其它动物已知Myostatin基因序列保守区，合成一对反向巢式PCR引物，sbE3R1(5’-AGGGGATCTTGCCGTAGATG-3’)和sbE3R2(5’-GCCGTAGATGATCTGCTCTTT-3’)；b.配合Clontech UNIVERSAL GENOMEWALKER KIT提供的正向巢式PCR引物AP1(5′-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3′)和AP2(5′-ACTATAGGGCACGCGTGGT-3)，进行第一轮GENOMEWALKING；结果见图2。
c.将第二次PCR的2，4，6获得的单一强带纯化回收，克隆入PromegapGEM-T easy载体，扩增质粒，使用通用测序引物测序。
d.根据3个片段测序得到结果，经比较发现该片段是MYOSTATIN基因。
e.根据获得的牙鲆MYOSTATIN基因片断，再分别合成巢式PCR引物，向下游走的(5’-CATGCACTTGCAGAAGTAT-3′和5’-AGAAGTATCCCCACACCCA-3′)、向上游走的引物(5’-GTCTCTCTGCACACTGAAA-3′和5′-CACACTGAAACCTCTGGAG-3′)。配合Clontech Universal GenomeWalker Kit提供的正向巢式PCR引物AP1和AP2，进行第二轮GENOMEWALKING。
f.然后将获得片断测序，再根据获得到的序列设计向上游走的引物(5′-CATTTTCTCTGGTGGGAGGT-3′和5′CTCTGGTGGGAGGTTTGATTTAGAAA-3′)引物，配合AP1和AP2进行巢式PCR，最后利用计算机推断出得到了完整的MYOSTATIN基因后停止巢式PCR，完整的MYOSTATIN基因的基因组序列如下。
(1)序列特征长度5587碱基对；类型核苷酸；链型单链；拓扑结构线性；(2)分子类型DNA(3)假设否(4)反义否
(5)最初来源牙鲆鱼(Paralichthys olivaceus)CCTTGTAATGTTATTTAAACATTTTAATATGTTCTATTTGACTTATTGAACCTCTTAACATGCACTCTTTTGCACACCCTTGCTCTAAAATGCCACAGTCACAATGAATAGTGCATCTCTTCAAGTCCTGTTCAATGAAATTCTTTCTTTGCCTTTCACTCTGAATGCTGTGTTTTTACAACTGGTCTATGAAGAATCTTGCTGTATATATAAATGATATATGTTACAGGTGTTTGAGTATATATATATATATAAATGAATAATCTTGGTGCATATATAAAGGTAACACCTGTAACATTTCTGCAAATGTGTAAGTGTCAGTATAGATGGTCAGAGTAAATGAAGGTGGAACATAACATAAATGAAAGAGTTTATTTCAAATTGCATATGATAAATCTGTCTGCCTGTCTATTTATCTATCTGTCTCTCTATACTGCTGATGGTGTTTGAGTTTCCAAGCCGCCACACGATGGCGCTATCCTCTCAGTTGCTAAAACCAGTTTTCACACTCAAGGATTTGGAGAAATCTTTGACTCAGGATTTTCTTTATCTCCGTTGGTTTTTGGTTGAAGTGCCCGTTGTGAAGTATTTGCACAGTCTACTTCTGATTTTACACGAGCTGATAATAAAGGATAGTGAATAAATTATAATCTAAGAAACCTGACATTAGACCAACTGAAATGATTTGACTGGAGTTGAATACATTTATAATTCTTACTCCTTCTCGTGGGTGACATTGATTTGTTCCCGAAAGAAATGGAAACAAACACACACACGTTTGAGGGACCTGTCATGTCCGATGTAAATTTGACACATCAGCTTATTATGTTATAACGCGTTCTTTTGAAAAATAAAGCGCGATCAACATTTAAAGAAGTCCTGTATGATTGAAACTGTATTATCTTAATATGCAAAACATGGAATAGATGATTATTTGTGTGTACAACTTGAGATTGGAACAGTAAGTAGTCGTTTTGCGCACAGTCAAGTCTGCGCCCCCCTGTGCCCATTGCGCAATCATCGTAAGAAAAGCGACTATCCATCTGTGGCCACGTTCGGTCCACGCTCACAGTCTGCGTCCCTTTATGGTTTGACAGTGGGAAAAAAAATTTTCAAGTCAGTCGGTTAAAATTCATTGTTGCCTGTCCAGCCAATCATAGTTTTTGACGACACAAAAGAGGCTAAAGTTGGAGTATAAAAAGGTGTGCGCTAATAAAGTATGATGCCTATCAGAGTGCGACATTAATCCAAACGCAGCGCAGACACGCATTGGGTCCAGCACACACCGGGGGATCTGCCTCGTTTTTTTTTTCTAAATCAAACCTCCCACCAGAGAAAATGCATCTGTCTCACATTGTGCTCTATCTCAGTTTGCTGGTTGCTTTGGGTCCAGTAGTTCTGAGCGACCAAGAGACGCACCATCAGCCCCCGGCCAGCAGCCCGGAGGACGCGGAGCAGTGCGCCACCTGCGACGTCCGGCAGCAGATAAAAACCATGCGACTAAACGCGATCAAATCTCAGATTCTGAGCAAACTGCGAATGAAGGAAGCTCCGAACATCAGCCGAGACATTGTGAAGCAGCTCCTGCCCAAAGCACCGCCGCTGCAGCAGCTTCTCGACCAGTACGACGTGCTGGGAGATGACAACAGGGATGTGGTCATGGAGGATGATGATGAGCACGCCACCACAGGGACAATCATGATGATGGCCACCGAACGTAAGTTTTTATTTCACTTAATTAGGAATGAAAAGGACGCGCTCTTAGACTTTTACGCGCGGGGCCAGGCAGAGCGCGCGCGGCAGAGCGCACGGGAGACGCTAGATCTAGGTTTATTTAGATTTGATTTGGAGGCACTATTAGAAATACGGATAGATAAGAGTACCAAGACTTAAGATTGTACAGGAATCACTACATTTAGTCATGCGGCGCATGATGTAAAGGGTTCATTTCAGATGTCGTGCCATGGGTTTTTATTAATG
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牙鲆SEQUENCE LISTING<110>中国科学院海洋研究所<120>牙鲆MYOSTATIN基因序列<130>
<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>5587<212>DNA<213>牙鲆鱼(Paralichthys olivaceus)<220>
<221>gene<222>(1)..(5587)<223>
<400>1ccttgtaatg ttatttaaac attttaatat gttctatttg acttattgaa cctcttaaca 60tgcactcttt tgcacaccct tgctctaaaa tgccacagtc acaatgaata gtgcatctct120tcaagtcctg ttcaatgaaa ttctttcttt gcctttcact ctgaatgctg tgtttttaca180actggtctat gaagaatctt gctgtatata taaatgatat atgttacagg tgtttgagta240tatatatata tataaatgaa taatcttggt gcatatataa aggtaacacc tgtaacattt300ctgcaaatgt gtaagtgtca gtatagatgg tcagagtaaa tgaaggtgga acataacata360aatgaaagag tttatttcaa attgcatatg ataaatctgt ctgcctgtct atttatctat420ctgtctctct atactgctga tggtgtttga gtttccaagc cgccacacga tggcgctatc480ctctcagttg ctaaaaccag ttttcacact caaggatttg gagaaatctt tgactcagga540ttttctttat ctccgttggt ttttggttga agtgcccgtt gtgaagtatt tgcacagtct600
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1.牙鲆MYOSTATIN基因序列，其特征在于具有序列表中SEQ ID NO.1碱基序列。
全文摘要
本发明涉及肌肉生长抑制素(MYOSTATIN)，具体地说是牙鲆MYOSTATIN基因序列，具有序列表中SEQ ID NO.1碱基序列。本发明克隆了牙鲆鱼MYOSTATIN基因得到全序列，该序列来源于牙鲆鱼，该基因能够抑制肌肉的发育，将其突变后可增加肌肉的产生。将突变体转入牙鲆鱼中也可以促进肌肉的发育，增加牙鲆鱼肉的比率，从而提高产量。
文档编号C12N15/10GK1740319SQ200410050329
公开日2006年3月1日 申请日期2004年8月27日 优先权日2004年8月27日
发明者徐成, 张培军, 谭训刚 申请人:中国科学院海洋研究所