一种单分子测序芯片的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及DNA测序芯片的制备技术领域，具体涉及一种单分子测序芯片的制备方法。
【背景技术】
[0002]进入21世纪后，人类基因组计划的完成对当代的生物学研究和医学研究产生了巨大的影响。就基因序列分析而言，后基因组时代的重点已由单个物种的全基因组序列测定转移到了对某一物种在基因组DNA序列层次上对个体遗传差异及物种间遗传差异的比较。靶向基因重测序将会是未来临床基因检测的主流技术。单分子测序技术被誉为第三代测序技术，其显著特征是可以高保真地对DNA片段直接进行识别，单分子测序技术由于能识别到单个核酸分子，其具有比高通量测序技术(统称为二代测序技术)更高的检测灵敏度。
[0003]基因芯片是测序技术得以实现的关键部件。然而，二代测序芯片是目前市场上的主流产品，它们大多是采用半导体纳米加工工艺得到高密度的纳米阵列，加工工艺精细且复杂，成本非常高，且需要大型的高精度仪器和超高级别的洁净室来完成。另外，二代测序芯片为了实现高通量的测序目的，芯片通道的宽度通常较大，在负压抽液方式进样进行生化反应时，通常会存在流体的流场分布不均问题和盖玻片易变形的问题。流场分布不均问题会造成试剂切换不干净，并使生化反应受影响，盖玻片变形会影响芯片的质量，更会影响碱基光学信号的采集。
[0004]单分子测序技术由于在测序数据量上要求不高，无需像二代测序芯片要求超高密度的纳米阵列，因此，有必要提供一种适用于单分子测序的芯片的制备方法。
【发明内容】
[0005]鉴于此，本发明提供了一种单分子测序芯片的制备方法，该方法制备工艺简单，成本低，采用该方法所制得的单分子测序芯片的流场分布情况良好，芯片的变形率低，芯片内流体的冲刷切换彻底。
[0006]本发明提供的单分子测序芯片的制备方法，包括以下步骤:
[0007](I)取一基板，根据设计好的反应池阵列的图形模板，采用光刻法在基板的表面制作反应池阵列的阳膜；
[0008](2)用模型胶浇注所述阳膜，经过真空除气后，在90-100°C下固化l_3h，使所述反应池阵列的阳膜转移在所述模型胶的底部，揭膜，得到带有多个流道的模型胶层，并在每个流道的两端各打一个孔，形成流体输入孔和输出孔，得到基片；
[0009](3)基底修饰:取一透明基底，在所述透明基底的表面制备一聚甲基戊二酰亚胺(PMGI)层，得到表面修饰的透明基底；
[0010](4)封装芯片:将上述基片与所述表面修饰的透明基底进行氧等离子体清洗，之后将所述基片与透明基底压合形成容纳流体的空间；然后往每个流道内注入N-甲基吡咯烷酮(简写为NMP)，反应时间为10min-15min，以清洗掉与各流道接触的聚甲基戊二酰亚胺层，得到位于所述透明基底表面的间隔层，完成单分子测序芯片的制备。
[0011]优选地，步骤(I)中，所述基板包括硅片、玻璃、金属或陶瓷中的一种。
[0012]优选地，步骤⑵中，所述模型胶包括聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、乙烯-醋酸乙烯(EVA)和聚胺脂(PUA)中的一种，但不限于此，只要是适用于软光刻法的模型胶即可。
[0013]更优选地，步骤⑵中，所述模型胶为聚二甲基硅氧烷(PDMS)。
[0014]如本发明所述的，所述基片的材质与模型胶相同。
[0015]优选地，步骤(3)中，所述聚甲基戊二酰亚胺(PMGI)层的厚度为1-5 μπι。
[0016]本发明中，所述聚甲基戊二酰亚胺，其英文全称为polymethylglutarimide (PMGI)，所述PMGI 是购买自 MicroChem公司的、产品名为 SF1、SF2、SF3、SF4、SF5、SF6、SF7、SF7.5、SF8、SF9、SF10、SFlU SF12、SF13、SF14、SF15、SF17、SF19、SF23中的一种或多种。
[0017]优选地，所述PMGI是购买自MicroChem公司的、产品名为SFll的聚甲基戊二酰亚胺。
[0018]优选地，步骤(4)中，每个流道内N-甲基吡咯烷酮的注入量为100-500 μ L。
[0019]所述N-甲基吡咯烷酮的注入量可以将透明基底上的牺牲层全部或部分清洗掉，但只要保证与各流道接触的牺牲层清洗掉即可，使得注入流道的DNA流体可与基底表面的环氧基、氨基、羧基、巯基和醛基等官能团发生作用而被固定下来。
[0020]如本发明所述的，在将基片与表面修饰的透明基底进行氧等离子处理表面之前，制备PMGI层的目的是为了保护透明基底表面的官能团(如环氧基、氨基、羧基、巯基和醛基中的一种)，避免其受等离子氧处理的影响，使得后续的基因样本固定到透明基底上。修饰后的透明基底在经过氧等离子清洗后，透明基底的表面由疏水性变成亲水性；再向每个流道注入N-甲基吡咯烷酮，该试剂可以将与各流道接触的PMGI腐蚀掉，使得透明基底表面的官能团再次暴露。
[0021]该单分子测序芯片的流道为亲水性，可以减少对待测DNA分子的非特异性吸附，同时基底表面的官能团不受影响。
[0022]优选地，步骤(4)中，所述基片与透明基底的压合具体为:先将基片与透明基底初步贴合，并放入温度为95_120°C的烤箱内，用重物压住烘烤l_3h。
[0023]优选地，步骤(I)中，所述光刻法包括以下步骤:
[0024]a、将负性光刻胶通过旋涂法制备到基板表面，得到匀胶后的基板，其中基板表面的光刻胶层厚度为600-650 μπι ;
[0025]b、对匀胶后的基板进行前烘处理，所述前烘的温度控制为:缓慢加热到90-100°C并稳定15-20min，之后自然冷却至室温；
[0026]C、将设计好的反应池阵列的图形模板作为掩膜版，并覆盖在前烘处理后的基板表面，进行曝光处理，曝光时间为90-150s ；
[0027]d、将曝光后的基板进行后烘处理，所述后烘的温度控制为:先缓慢加热到90_95°C并稳定5-10min，之后自然冷却至室温；
[0028]e、将后烘处理后的基板浸入显影液中，进行显影处理，清洗掉掩膜版以外的部分，得到反应池阵列的阳膜。
[0029]优选地，在进行所述光刻法的步骤a之前，还包括对基板进行以下预处理:
[0030]依次用无水乙醇、水清洗基板的表面，之后将清洁过的基板置于150°C的热板上加热lOmin，使表面水分彻底蒸发。
[0031]优选地，在所述光刻法的步骤e之后，还包括以下处理:
[0032]f、将步骤e得到的反应池阵列的阳膜进行硬烘处理，所述硬烘是在所述阳膜上加一玻璃板，并压一铁块，加热至130-150°C下烘烤45-60min。
[0033]所述硬烘是为了使阳膜的光刻胶层更牢固地粘附在基板表面，并增加光刻胶层的抗刻蚀能力。
[0034]优选地，步骤b中，所述前烘的温度控制为:先在65°C时烘烤6min，再按1°C /min的速率逐渐升温至95°C，保持20min，自然冷却至室温。所述前烘的目的是将光刻胶中的有机溶剂蒸发掉，并使光刻胶凝固。
[0035]优选地，步骤e中，所述后烘的温度控制为:先以0.50C /min的速率逐渐升温至95°C，保持5min，再以1_3°C /min的速率自然冷却至室温。所述后烘的目的是以使曝光部分的负性光刻胶的交联反应充分进行。
[0036]优选地，所述负性光刻胶为SU-8 2150。
[0037]优选地，所述反应池阵列包括15-25个流道。
[0038]优选地，所述间隔层沿与所述流道的长度方向垂直的方向之间的宽度为1-1.5mm。
[0039]如本发明所述的，相邻流道之间的间距为1-1.5mm。
[0040]优选地，所述锥形末端的夹角为30-60°。
[0041]优选地，每个所述流道相对设置的两个侧壁的交汇处的距离为每个流道的长度，每个所述流道的长度为50-75mm。
[0042]优选地，每个所述流道相对设置的两个侧壁之间的距离为每个流道的宽度，每个所述流道的宽度为I_2mm。
[0043]优选地，每个所述流道的深度为0.6-lmm。