一种两核苷酸实时合成测序检测碱基连续突变序列的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种低成本单碱基核酸序列连续变化的实时合成测序检测方法，尤其 涉及一种从可能的多位点变化中确定具体单碱基变化检测方法，属于生物技术领域。 技术背景
[0002] 随着人类基因组计划和各种模式生物基因组计划的开展和完成，使人类步入了后 基因时代，对当代的生物学研究和医学研究产生了巨大的影响，分子生物学相关学科得到 了迅猛的发展。从基因水平上认识生命的差异，疾病发生、发展的规律，以及药物与生命体 的相互作用将成为可能。就基因序列分析而言，后基因时代的重点已由全基因组序列测定 转移到了对基因组中个体遗传差异及物种间遗传差异的比较。在诸多基因变异中，突变和 SNP是研究基因遗传与变异时一种高效的量化标志。通过获得与该疾病相关基因信息，对疾 病预防、用药选择、新药研发、疾病预后等诸多个体化医药学领域具有十分关键的影响。因 此，生物科技紧接着面临如何快速、可靠地对已知突变和SNP位点进行检测的问题，因此，这 将标记着巨大的商业机会蕴涵在其中，并成为为众多商家看好的潜在的巨大市场。
[0003] 与为数有限的蛋白质测序和DNA序列分析方法相比，基因突变(包括SNP)分析的基 本方法在数量上已达20余种。种类繁多的分析方法，既反映了研究基因突变(包括SNP)分析 方法在生物学和医学领域所受到的重视程度，也反映出任一单个方法尚无法满足后基因时 代对基因突变(包括S NP)分析的要求。目前绝极大部分的分析方法均是针对单个位点进行 分析，对于间隔很近的连续多个变化序列大部分的技术均无能为力，而这种碱基连续变化 的序列数量也很多。例如Kras基因编码12、13位点的序列，对于所有人而言，除了正常序列 外，还有7种突变的序列。然而，对于具体的一个人而言，它可能是只有一种正常(未突变)的 DNA序列，或者除了正常(未突变)一种DNA序列外、还有一种突变(七种中可能的一种)DNA序 列。因此，对一个具体样本而言，如何从8种可能的类型中快速、准确的判断出具体的分型， 对于临床诊断无疑是有积极意义的。现有的分析方法中，Sanger测序无疑是这类核酸序列 分析的"金标准"，但在定量分析上对丰度低于10 %的核酸片段也无能为力；另外，其相对复 杂的操作、仪器及其使用价格的相对昂贵也很难进行临床检测推广。DNA芯片组合延伸检测 碱基连续突变的方法（肖鹏峰，等.中国发明专利:ZL 201210128598.3)虽然能对这类序列 进行并行分析，但DNA芯片制备耗时过长，其总操作时间超过10小时，这样这个方法只适合 大样本的科研分析，而不适合快速诸如临床诊断类的分析。焦测序技术是继Sanger测序后 的测序技术，相对于Sanger测序，除了测序长度处于弱势外，在自动化程度，操作简易、价格 上均有优势，便宜、且检测限更低，容易推广、十分适合临床检测上使用。现有的焦测序技术 原理上如果能够通过优化核苷酸的加入顺序，使每种类型具有唯一、特征的测序图谱也就 能够完成对这类序列的分析。然而，现有焦测序单个核苷酸的加入方式一方面由于受到单 体(及其四个单体试剂仓)的限制，根据不同的序列很难优化出符合要求的单核苷酸加入顺 序，另一方面即使优化出符合要求的加入顺序，其反应次数也可能很多，增加了分析的费 用。
[0004] 本发明针对现有技术分析碱基连续突变序列的不足，提出一种两核苷酸实时合成 测序检测碱基连续突变序列的方法，通过设计两核苷酸加入类型和顺序，使每一种具体的 突变类型均有唯一、特征的不同测序图谱，从而确定分析样本的具体突变类型。该方法能够 通过一次测序操作将样本在可能发生连续多个单碱基突变的某个具体突变确定，简化了操 作步骤，减少分析费用。
【发明内容】
[0005] 本发明所解决的技术问题是:提供一种低成本单碱基核酸序列连续变化的实时合 成测序检测方法，从可能的多位点变化中确定具体单碱基变化。通过设计两核苷酸加入类 型和顺序，使每一种具体的突变类型均有唯一、特征的不同测序图谱，从而确定分析样本的 具体突变类型。
[0006] 为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：提供一种两核苷酸实时合成 测序检测碱基连续突变序列的方法，包括如下步骤：
[0007] (1)制备单链DNA模板；
[0008] ⑵测序引物杂交:将测序引物与单链DNA模板结合；
[0009] (3)利用两核苷酸对目的片段进行两核苷酸合成焦磷酸测序反应，所述的两核苷 酸为从非标记或者标记的dATPaS、dCTP、dTTP、dGTP、以及ddATPaS、ddCTP、ddTTP、ddGTP中选 择的两种不同的核苷酸，通过设计两核苷酸加入类型和顺序，使得每一种具体的突变类型 均有唯一、特征的不同测序图谱，然后按照设计的两核苷酸加入类型和顺序对分析样本进 行合成测序；
[0010] (4)每个测序反应得到的测序信息包括加入的两核苷酸信息、以及核苷酸合成的 数目信息，连续多个两核苷酸合成焦测序反应的测序信息构成测序图谱，由测序图谱确定 分析样本的突变类型。
[0011] 所述碱基连续突变序列是指相邻位置两个或者两个以上碱基发生单碱基序列突 变。
[0012] 所述步骤⑴制备单链DNA模板按照如下方法进行：
[0013] (Η)采用一个5 '端修饰生物素的引物对目的DNA片段进行PCR扩增；
[0014] (1-2)将PCR扩增产物与链霉亲和素包裹的磁珠进行反应，生物素修饰的DNA链则 固定到所述磁珠上，得到单链DNA模板；
[0015]当待测序列除了含有一种野生型DNA序列外，还含有一种突变型DNA序列时，选定 两种序列相同的一个或者多个碱基作为一个峰高的基准，这个基准峰既可以选择单个核苷 酸加入、也可以选择两个核苷酸加入的测序反应来确定，通过基准峰高及每个反应的峰高 值计算待测序列中野生型DNA序列与突变型DNA序列的含量。
[0016] 所述的一种两核苷酸实时合成测序检测碱基连续突变序列的方法，步骤(3)中不 同dNTPs、ddNTPs合成插入到DNA链后释放出相同的检测分子、且释放出检测分子的量与核 苷酸合成的数目成线性关系，其检测分子是化学发光检测的焦磷酸盐，电化学检测的氢离 子或者光学检测的荧光信号。
[0017] 本发明的有益效果是：与现有技术相比，实现了分析的序列片段中可能包含多个 位置的碱基连续变化的同时检测，快速判断一个具体样本确定样本是否发生突变、以及突 变发生的位点类型。由于一般DNA片段序列除了特定位置的碱基序列不同外，其它序列均为 已知的，因此只需要从几种可能中判断出正确序列即可。因此，如果能够通过设计两核苷酸 加入类型和顺序，使每一种具体的突变类型均有唯一、特征的不同测序图谱，然后按照设计 的两核苷酸加入类型和顺序对分析样本进行合成测序，比较测序图谱、确定突变类型。此 外，本发明在保持现有基于合成测序检测方法的准确性、灵敏度的前提下，能够快速、简单 地实现不同样本的并行检测。由连续多个测序"峰"构成的测序图谱不仅能够实现定性分 析，还能够实现定量分析，可以用于低丰度突变DNA序列的分析。
【具体实施方式】
[0018] 本发明提供一种两核苷酸实时合成测序检测碱基连续突变序列的方法，这里，碱 基连续突变序列是指序列中相邻位置两个或者两个以上碱基发生单碱基序列突变，由于一 般DNA片段序列除了特定位置的碱基序列不同外，其它序列均为已知的，因此只需要从几种 可能中判断出正确序列即可。因此，如果能够通过设计两核苷酸加入类型和顺序，使每一种 具体的突变类型均有唯一、特征的不同测序图谱，然后按照设计的两核苷酸加入类型和顺 序对分析样本进行合成测序，比较测序图谱、确定突变类型。具体步骤为：（1)制备待测序列 的单链DNA模板；（2)将测序引物与单链DNA模板结合；（3)对待测序列进行两核苷酸合成焦 磷酸测序反应，通过有选择的几种具体的两核苷酸交替加入，完成连续的多个两核苷酸实 时合成测序反应。该步骤中，根据分析样本所有可能的突变序列，设计两核苷酸加入类型和 顺序，使得每一种具体的突变类型均有唯一、特征的不同测序图谱，然后按照设计的两核苷 酸加入类型和顺序对分析样本进行合成测序，比较测序图谱、确定突变类型。
[0019] 以下将结合实施例对本发明作进一步说明。
[0020] 实施例一
[0021]表1是采用本发明一种两核苷酸实时合成测序检测碱基连续突变序列的方法来分 析拟订序列3 ' -AGCA突变为(GGCA、CGCA、TGCA、ACCA、AACA、ATCA)设计的一种两核苷酸加入 类型和顺序、以及每种具体的突变类型对应的唯一、特征测序图谱。表中3'-AGCA为野生型 序列，％CA、0CA、JGCA、A^CA、A^CA、A]；CA为突变型序列(其中下划线字母表示突变碱基）。而 一个?体的分析#本要么只含有一种野生型DNA序列，或者除了含有一