一种焦测序定量检测甲基化的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，是一种PCR产物序列分析方法，具体设及一种特定核 巧酸加入的合成焦测序定量检测甲基化的方法。
【背景技术】
[0002] 人类基因组计划和各种模式生物基因组计划的开展和完成，使人类步入了后基因 时代，对当代的生物学研究和医学研究产生了巨大的影响，分子生物学相关学科得到了迅 猛的发展。从基因水平上认识生命的差异，疾病发生、发展的规律，W及药物与生命体的相 互作用将成为可能。就基因序列分析而言，后基因时代的重点已由全基因组序列测定转移 到了对基因组中个体遗传差异及物种间遗传差异的比较。越来越多的证据表明，DNA甲基 化参与了胚胎发育、基因印迹等过程。同时，它在疾病发展中也起着举足轻重的作用。甲基 化状态的改变被认为是引起癌症的一个重要因素，运种变化包括基因组整体甲基化水平的 降低和CpG岛局部甲基化水平的异常升高，从而导致基因组的不稳定（如染色体的不稳定、 原癌基因的表达）和抑癌基因的不表达。
[000引DNA甲基化分析包括定性与定量分析，目前存在很多方法可W选择。基因组DNA经过亚硫酸氨盐处理后，原始序列中未被甲基化的胞喀晚（C)残基转化为尿喀晚扣)，并在 PCR扩增中W胸腺喀晚（T)出现；而被甲基化的胞喀晚则保持不变。从亚硫酸氨盐转化运 条主干道出发，之后可W选择限制性酶切分析、实时定量PCR、Sanger测序、焦憐酸测序、W 及高通量DNA测序等。然而，并非所有方法都能提供单个CpG位点的定量数据。样本经亚 硫酸氨盐处理后PCR产物的Sanger测序一度被认为是甲基化分析中的金标准，但如果对 5-10个克隆测序，运种方法充其量只是半定量。高通量DNA测序对于甲基化研究，带来了非 常灵敏的DNA甲基化图谱，W单分子分辨率覆盖整个CpG岛。高通量DNA技术实现了整个 CpG岛的更全面覆盖，且单分子分辨率为甲基化模式的异质性提供了前所未有的信息。它 能够平行研究多个位点。然而，运些优点也伴随着一些劣势，比如相当大的一笔投资、试剂 昂贵、周转时间长、数据分析要求高等。运些特点使得高通量DNA测序技术更适用于在基因 组范围内目标区域的确定，而对不同样品在目标区域的CpG位点的定量分析由于样品数量 大，如果每个样品都采用高通量DNA测序技术进行分析，则成本就会过于巨大。
[0004] 传统的焦憐酸测序技术能够快速地检测甲基化的频率，对样品中的甲基化位点进 行定性及定量检测。样本经过亚硫酸氨盐处理后的PCR产物在焦测序延伸过程中，根据C 和T的渗入量来定量确定单个位点的C-T比例。因此，不同位点的甲基化变异就能被准确 检测。由于焦憐酸测序提供了真实的序列数据，甲基化状态也就W序列形式呈现。德国汉 诺威医学院AnnaPotapova领导的研究小组对高通量DNA测序和焦测序进行了系统的交叉 验证（BMCBiotechnology, 2011, 11:6)，对10个原发性肝癌标本中12个位点的甲基化模式 在高通量DNA测序所获得的单个CpG位点的甲基化水平与传统焦测序相应值进行比较的统 计分析表明，所有单个CpG位点的甲基化水平都有着极佳的一致性。表明传统的焦测序技 术是一种可用于目标区域的CpG位点定量分析的简单、价格便宜的分析技术。
[0005] 然而，传统焦测序技术由于每个反应需要加入相应体积的dNTP，运样，随着测序反 应的进行，反应物的体积越来越大，其反应物的浓度也就越来越少，测序的准确性也就越来 越低。传统焦测序一般在优化核巧酸加入顺序的前提下也只能测定大约60bp的片段长度 (MashayeWiiF,Rona曲iM.A.Analyticalbiochemistry, 2007, 363, 275-28719)，而运种每 个甲基化位点需要两个测序反应的实现的传统焦测序技术对甲基化PCR产物的分析就更 加受到测序长度的限制。一种变通的方法是将运段长序列用多个测序引物分段进行焦测 序。然而，一方面，使用多个测序引物也会增加分析成本；另一方面，由于经过亚硫酸氨盐 处理后被甲基化的胞喀晚则保持不变，因此每个位点被甲基化的程度不同，PCR产物中两种 DNA模板的含量也就不同，造成DNA模板类型的复杂，一般很难设计多个测序引物将其序列 分段进行测定。因而传统焦测序在对长片段序列甲基化的定量检测中存在不足。分析传统 焦测序技术用于甲基化定量检测可W发现，测序中只利用了CpG位点（即dGTP测序）信 息，而其它区域的测序信息并未使用，因此，依据我们实验室提出一种基于两核巧酸实时合 成测序的方法（肖鹏峰等，中国发明专利：ZL2012 1 0128597.6)，将其它区域的测序用特 定两核巧酸替代单个的核巧酸合成测序无疑将减少合成测序的数目，从而增加测序的阅读 长度。
【发明内容】
[0006] 为了克服现有技术中存在的不足，本发明提供一种焦测序定量检测甲基化的方 法，为样本经过亚硫酸氨盐处理后的PCR产物提供一种快速、高效、灵敏的甲基化定量分析 方法。
[0007] 为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
[0008] 一种焦测序定量检测甲基化的方法，步骤包括：1)DNA提取；2)亚硫酸氨盐处理； 3)PCR扩增；4)测序；5)关联分析；
[0009] 所述步骤4)的测序方法为：按照特定两核巧酸、dGTP加入方式进行焦测序；其中， 两核巧酸测定序列反应得到合成数目的编码信息、dGTP测定序列反应得到合成数目信息。
[0010] 所述步骤4)的具体方法包括W下步骤：
[0011] 4-1)制备单链DNA模板：将PCR扩增产物与链霉亲和素包裹的磁珠反应，生物素 修饰的DNA链固定到所述磁珠上，在0. 05-0. 2M化OH溶液下变性；将未固定的另一条DNA 链清除；然后用洗液洗涂，得到固定的单链DNA模板； 阳01引 4-。测序引物杂交：将测序引物与所述单链DNA模板在杂交反应体系中，70-80°C 下放置5-lOmin，自然冷却至室溫，完成杂交；
[0013] 4-3)测序：配备测序反应体系，与所述步骤4-2)得到的杂交产物混合，焦测序反 按照特定两核巧酸、dGTP加入方式进行。
[0014] 所述步骤4-2)中，所述测序引物是一段与单链DNA模板完全互补的一段序列。
[0015] 所述步骤4)中，两核巧酸每个测序反应获得两核巧酸合成测序的信号强度信息， dGTP每个测序反应获得单个核巧酸合成测序的信号强度信息，所述测序信号强度与合成核 巧酸数目成正比，即每个测序反应的测序信号强度均可W转化为核巧酸合成的数目。
[0016] 所述步骤5)中，根据焦测序得到的dGTP每个测序反应获得的核巧酸合成的数目 信息，该数目信息为1;
[0017] 所述关联分析为：假定容易一个GC位点中C被甲基化的程度为Xi，其中 0《1，那么，在经过亚硫酸氨盐处理的PCR产物运个碱基序列中，含有"C"的DNA模 板序列含量为Xi,而含有由运个碱基未被甲基化转化而来的"r'DNA模板序列含量则为 (I-Xi);根据dGTP测序反应得到的核巧酸合成的数目信息，即可求出Xi的数值。
[0018] 所述步骤2)中，采用传统的亚硫酸氨盐转化方法，或者采用市售的试剂盒、按照 其操作流程实施。
[0019] 所述步骤3)中，PCR扩增所用的PCR-条引物为5'端被生物素、氨基或者丙締酷 胺基团修饰，与表面修饰链霉亲合素、簇基的固相载体反应，或者与丙締酷胺单体聚合反应 制备单链DNA模板。 W20] 其特征在于：所述特定两核巧酸是依据DNA模板分析片段确定的，包括 (dCTP+dTT巧、（dATPaS+dCTP)、（dATPaS+dTTP)。
[0021] 本发明的有益效果是：
[0022] 本发明与传统焦测序相比，具有如下有益效果：
[0023] 1)本发明适合所有经亚硫酸氨盐转化的PCR产物序列的甲基化分析。相对于传统 的焦测序分析方法，本发明能够大幅度提高DNA序列的测定长度，拓宽了焦测序的分析范 围。
[0024] 2)本发明适合多个混合样本的多模板PCR产物分析，可W直接测定混合样本中各 个DNA模板的比例，可W用于从大规模样本中寻找、筛选核酸标志物。
[00巧]3)本发明直接采用商品化、非标记的天然核巧酸进行合成测序，它可W在现有任 何基于实时合成测序的测序平台进行。
【附图说明】 阳0%] 图1为本发明方法对任意拟定的包含多个甲基化位点的PCR产物DNA模板序列 (5,-TTTTGGAG(CA)TTG(CA)AG(CA)TTTG(C/T)GTTTTTG(C/T)-3'，其中（C/T)表示经亚硫 酸氨盐转化后PCR产物中的可能碱基信息），按照特定两核巧酸、dGTP加入方式进行焦测 序及其各个位点的甲基化含量关联分析示