针对膀胱癌的dna甲基化生物标志物的制作方法
【专利说明】针对膀脯癌的DNA甲基化生物标志物
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求于2013年5月10日递交的美国专利申请第61/821,838号的优先权，并 将其全部内容通过援引完整地并入本文中。
[0003] 关于受联邦资助的研发的声明
[0004] 本发明用美国国家癌症研究所的基金R01CA083867-PAJ和R01CA123518-GL在政府 支持下做出。政府享有本发明的一定权利。
技术领域
[0005] 本发明设及膀脫癌(包括膀脫癌复发)的非侵入性筛查和诊断领域。
【背景技术】
[0006] 在2011年，膀脫癌是患病率最高的十种男性恶性肿瘤之一，在死亡和新病例方面 分别排第四和第八(Siegel ,Ward等，2011)。最常见的膀脫癌症状是血尿，该疾病的常见风 险因素包括吸烟和致癌因子暴露(Morgan和Clark 2010)。非肌肉浸润性膀脫癌(醒IBC)占 所有病例的80%，并且可W进一步分类为乳头状(Ta)、扁平原位癌(Tis)和上皮下结缔组织 侵袭型（Tl)损伤。其余病例作为肌肉浸润性膀脫癌(MIBC)而存在（Sobin，Gospodarowicz 等，2009,Babjulc,化Sterlinck等，2011)。醒IBC当前的一线疗法是膀脫肿瘤的经尿道切除 (TURBT);但是，50%的患者在TURBT程序后会复发，最高的复发率出现在具有高风险疾病的 患者中（Mi 11自n-Ro化Iguez ,化自chi Ie-Toniolo等，2000;化el ley ,Mason等，2010)。结果， TURBT患者需要频繁的监视和终身的保持治疗，运使膀脫癌在患者管理方面成为花费最高 的癌症类型之一。
[0007] 目前监视和治疗膀脫癌复发的金标准包括使用膀脫镜检和细胞学结合Bacile (^ilmette-Guerin(BCG)免疫疗法和化学疗法（Morgan 和Clark，2010; Bab化k, Oosterl inck 等，2011)。疾病监视是具有挑战性的，运是因为膀脫镜检具有侵入性特性，运会带来一定程 度的患病，并且还因为在检测低级别肿瘤时尿细胞学所展现出的低灵敏度化intula和 化化kainen，2010)。近年来，已致力于发现在用非侵入性方法收集的样品（例如尿沉淀物） 中的疾病诊断和预后的更好的标志物(Sturgeon ,Duffy等，2010)。膀脫瘤细胞比正常或良 性的膀脫尿路上皮细胞具有更弱的细胞附着性，因此其脱落得更多且可W收集在尿液(尿 沉淀物）中。但是，由于特异性较差，目前提出的标志物都未在常规临床实践中采用(Parker 和Spiess ,2011)。因此，亟需发现用来监视TURBT患者复发的可靠标志物，其进而可有助于 便利和改进疾病管理。
[000引最近已提出，尿沉淀物的纵向收集和测试可帮助评估标志物的预后、监视和复发 预测值化0que，Begum等，2006)。通过使用DNA甲基化分析、微卫星标志物和成纤维细胞生长 因子受体3 (FGFR3)突变测定，若干项研究实施了上述方法（氏抑巧始t，化pertan等，2008 ; Zuiverloon,van der Aa等，2010)。虽然运些标志物的灵敏度很高，但它们却显示出低特异 性，某些情况下与细胞学的特异性相当（Brems-EskiIdsen,Zieger等，2010)。一种四DNA甲 基化标志物组提供了更好的特异性；但是，其还显示出较高比例的假阳性结果（33%) (Zuiverloon ,Beukers等，2012)。因此，仍然需要针对膀脫癌和膀脫癌复发的更好、特异性 更高且更准确的测试方法。
【发明内容】
[0009] 本发明的一个目的是提供可用于鉴定膀脫癌已复发的患者的方法、系统和试剂 盒。
[0010] 本发明的另一目的是提供可W用于鉴定有高风险复发膀脫癌的患者的方法、系统 和试剂盒。
[0011] 本发明的另一个目的是提供可用于诊断膀脫癌的方法、系统和试剂盒。
[0012] 本发明的另一个目的是提供可用于使常用于膀脫癌复发管理中的侵入性昂贵程 序的频率最小化的方法、系统和试剂盒。
[0013] 本发明的另一个目的是提供一种工具，所述工具可用于决定对不具有膀脫癌临床 证据但仍保留有异常DNA甲基化的患者进行严密监视，或用于决定为运些患者提供个体化 治疗，因为运些患者可能有高风险复发膀脫癌。
[0014] 本发明的一方面是一种准确度和特异性高的多DNA甲基化生物标志物方法，其用 于膀脫癌和膀脫癌复发的预后、预后及诊断。例如，本发明的一个发现在于，H0XA9、S0X1、 NPY、IRAK3、Z02和Ll-MET的DNA甲基化状态与复发显著相关且灵敏度和特异性高（全部^ 0.0 OOl )，包含SOXl、IRAK3和Ll-MET的S标志物特征的复发预测能力远远优于细胞学(准确 度90%相比7%)。
[0015]本发明的另一方面是用于筛查患者测试样品的高甲基化化ypermethy Iated)的 DNA甲基化生物标志物和低甲基化化ypomethy Iated)的DNA甲基化生物标志物的组合。
[0016] 本发明的另一方面是如下发现:来自TURBT患者的尿沉淀物中的DNA甲基化变化能 够用于检测早期膀脫癌复发。具体而言，H0XA9、SOXl、NPY、IRAK3、Z02的甲基化(高甲基化标 志物)和Ll-MET的去甲基化(低甲基化标志物)表现出与肿瘤复发的正相关性，且灵敏度和 特异性高(P<〇. OOOl)。在检测早期复发变化方面，SOXl、IRAK3和Ll-MET标志物的组合提供 了比细胞学和膀脫镜检更好的分辨力。本发明的方法、试剂盒和系统提供了用于评估TURBT 患者的具有成本效益的非侵入性方法，如果将该方法应用于临床环境，其可W有助于延迟 或减少肿瘤复发风险并限制诸如膀脫镜检等侵入性程序的使用。
[0017] 本发明的一个实施方式是对受试对象的膀脫癌或膀脫癌复发进行预测、预后和/ 或诊断的方法，所述方法包括：
[0018] 提供来自所述受试对象的测试样品；
[0019] 测量所述测试样品中的一种或多种多核巧酸的至少一部分的DNA甲基化水平，所 述一种或多种多核巧酸选自由册乂49、5(^1、^￥、11?41(3、1^-]\^1'和202组成的组；
[0020] 将所述测试样品中的所述一种或多种多核巧酸的DNA甲基化水平与基于对照组中 的所述一种或多种多核巧酸的DNA甲基化水平的参比DNA甲基化谱进行比较，所述对照组的 成员具有膀脫癌;和
[0021] 基于所述比较，确定W下（1)、（2)和(3)中的至少一项：（1)膀脫癌是否已复发；（2) 是否存在膀脫癌复发的可能性;和(3)患者是否具有膀脫癌。
[0022] 本发明的另一个实施方式是对受试对象的膀脫癌或膀脫癌复发进行预测、预后 和/或诊断的方法，所述方法包括：
[0023] 提供来自所述受试对象的测试样品；
[0024] 测量所述测试样品中的两种或多于两种多核巧酸的至少一部分的DNA甲基化水 平，所述两种或多于两种多核巧酸选自由册乂49、50乂1、^￥、1341(3、1^-161'和202组成的组；
[0025] 基于所测量的DNA甲基化水平计算风险评分，
[00%] 将所计算的风险评分与阔值(CUt-Off value)进行比较，所述阔值源自基于从对 照组获得的一种或多种生物标志物的DNA甲基化水平的参比DNA甲基化谱，所述对照组的成 员具有膀脫癌;和
[0027] 基于所计算的风险评分与所述阔值的比较，确定W下（1)、（2)和（3)中的至少一 项：（1)膀脫癌是否已复发；（2)是否存在膀脫癌复发的可能性;和(3)患者是否具有膀脫癌。
[0028] 本发明的另一实施方式是一种系统，所述系统包括:非暂时性计算机可读介质，所 述介质包含储存在其中的计算机可读程序代码，所述程序代码用于使处理器获得测试样品 中的H0XA9、SOX1、NPY、IRAK3、L1 -MET和Z02中的一种或多种的测得的DNA甲基化水平;将所 述测试样品中的所述一种或多种生物标志物的DNA甲基化水平与源自对照组的所述一种或 多种生物标志物的参比DNA甲基化谱进行比较，所述对照组的成员具有膀脫癌。优选的是， 所述系统包括基于所述比较而产生的报告，所述报告提供关于W下（1)、（2)和(3)之一的指 导：（1)膀脫癌是否已复发；（2)是否存在膀脫癌复发的风险;和(3)患者是否具有膀脫癌。
[0029] 本发明的另一实施方式是一种系统，所述系统包括:非暂时性计算机可读介质，所 述介质包含储存在其中的计算机可读程序代码，所述程序代码用于使处理器获得测试样品 中的H0XA9、SOX1、NPY、IRAK3、L1 -MET和Z02中的两种或多于两种的测得的DNA甲基化水平； 计算风险评分;将所述风险评分与阔值进行比较，所述阔值源自基于从对照组获得的一种 或多种生物标志物的DNA甲基化水平的参比DNA甲基化谱，所述对照组的成员具有膀脫癌。
[0030] 在另一方面，本发明设及一种用于评估膀脫癌复发可能性的诊断性测试。本发明 该方面的诊断性测试通常包括：用于从尿液中提取DNA的尿液处理试剂盒，和特定用于检测 基本由SOXl、IRAK3和Ll-MET组成的S种生物标志物的组的DNA检测单元。如下文的说明性 实例所示，可W用本领域已知的任何方法、设备或商购试剂盒来从尿液中提取DNA。所述S 种生物标志的检测可W用本领域已知的任何DNA甲基化检测测定、试剂盒、设备来完成，例 如PCR、焦憐酸测序，但不限于此。
[0031] 在另一方面，本发明设及一种监视膀脫癌复发的方法。本发明该方面的方法通常 包括W下步骤:从受试对象获得尿样;从所述尿样中分离出DNA;和分析所述DNA中是否存在 甲基化的基本由SOXl、IRAK3和Ll-MET组成的生物标志物。
[0032] 本发明的其他方面和优点将从W下说明和附图中变得明显。
【附图说明】
[0033] 图1显示出，在TURBT患者的尿沉淀物中测试的六种DNA甲基化标志物的组与膀脫 肿瘤的复发正相关，并且具有高灵敏度和特异性。(A)来自肿瘤切除后的膀脫癌患者的纵向 收集的尿沉淀物样品的时间线。每个患者的起始点由时刻0表示，是指研究中的第一次收集 尿样的随访。用红色标出的随访表示复发时刻。(B)H0XA9、S0X1、NPY、IRAK3、Z02和L1-MET的 接受者操作特性(ROC)曲线是使用第一次复发时的TURBT患者的31个尿沉淀物和来自无复 发患者的最后一次随访的56个尿沉淀物制作的。AUC:曲线下面积。（C，D)对TURBT患者的长 期DNA甲基化分析W及其与无复发患者(C)和已复发患者化）的临床状态的关系。（-):阴性； (*):疑似；（ + ):阳性(活检或组织学证实的膀脫肿瘤，在细胞学或膀脫镜检中有严重的异型 或乳头状损伤）；R:复发；BCG:Bacille (Wilmette Guerin。
[0034] 图2显示了 =标志物特征在检测肿瘤复发方面具有高灵敏度和特异性。(A)在最后 一次随访时无复发的TURBT患者W及复发的TURBT患者的尿沉淀物中，计算了风险评分:-0.37608+0.17095 X S0X1+0.21604 X IRAK3-0.09887 X L1-MET。（B)五倍交叉验证显示出了 86%的灵敏度和89%的特异性。（C)在单独的尿沉淀物样品中验证了该=标志物模型，该样 品包含来自在最后一次随访前无复发的患者的尿沉淀物(CU)和携带肿瘤的患者的尿沉淀 物(TU)，并确定了灵敏度和特异性。高于阔值(红色虚线）的风险评分表示正分，低于阔值的 表示负分。
[0035] 图3显示了利用S种DNA甲基化标志物的组合得出的风险评分有助于在尿液中预 测膀脫肿瘤的复发风险。(A，B)使用=标志物组合的DNA甲基化水平来计算两个单独的患者 的尿沉淀物样品中的复发风险评分，所述样品来自无复发(A)或复发(B)的TURBT患者。V: TURBT手术;R:复发;风险评分= -0.37608+0.17095 X S0X1+0.21604 X IRAK3-0.09887 XLl-MET。红色虚线表示阔值。澄色箭头代表复发前的正分。
[0036] 图4显示了 S种DNA甲基化标志物的组合有助于在尿沉淀物中预测膀脫肿瘤的复 发风