亚硫酸氢钠测序法定量检测大鼠h19基因印记控制区甲基化水平的引物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及基因甲基化检测领域，尤其设及一种亚硫酸氨钢测序法定量检测印记 基因化9印记控制区甲基化水平的引物。
【背景技术】
[0002] 基因印记(genomic imprinting)是一种不遵循孟德尔遗传规律的亲本等位基因 差异性表达的现象，通过修饰使启动子附近的印记控制区域来控制等位基因的不对称表 达，运种修饰常为DNA甲基化修饰，也包括组蛋白乙酷化、甲基化等修饰。在基因印记与男性 生殖的研究中，发现印记基因甲基化异常，导致表达改变。因此，基因印记与男性生殖关系 密切，对印记基因甲基化的研究不仅可为掲示男性不育发生机制提供重要依据，而且还可 提供有效的预测标记。
[0003] 印记基因化9位于人染色体11P15.5,鼠7号染色体，在进化上具有高度的保守性。 H19基因为母源性印迹基因受转录其实位点上游4kb处差异甲基化区（differentially methylated region,DMR)或印记调控区（imprinting control region,ICR)调控。大量研 究显示，少、弱精子症男性精子细胞印记基因 H19印记控制区域低甲基化，故其被认为是一 个候选的印记基因。
[0004] 目前，单个基因 DNA甲基化检测方法有：
[0005] (1)甲基化特异性PCR(MS-PCR)，DNA在亚硫酸盐作用后，分别用一对甲基化引物和 一对非甲基化引物进行PCR扩增，产物跑胶后定性分析是否出现甲基化，其缺点在于只能定 性检测而不能定量分析且需设计多对引物。
[0006] (2)联合亚硫酸氨钢的限制性内切酶分析法(COBRA)，DNA样本经亚硫酸氨盐处理 后，进行PCR扩增，扩增产物用限制性内切酶(Bs优1)消化。与MS-PCR类似，可对DNA样本中特 定位点甲基化水平进行快速定量，然而，它的局限性也十分明显，只能获得特殊酶切位点的 甲基化情况，且阴性结果并不能排除样品DNA中存在甲基化的可能。
[0007] (3)甲基化敏感性高分辨率烙解曲线分析(MS-HRM)，通过烙解曲线分析可W将单 碱基序列的差异转变成烙解曲线的差异，甲基化与未甲基化DNA的差异可通过烙解曲线分 析来发现。但该方法只能对检测片段整体甲基化情况进行分析，并不能明确每个CpG位点的 甲基化状态。
[000引（4)焦憐酸测序，一种基于化学发光法测定焦憐酸盐(PPi)的高通量、短片段、全自 动、实时DNA测序技术，可同时分析96个样本。该方法根据序列延伸过程中C和T的渗入量来 定量确定单个CpG位点的C-T比例，能够快速地检测甲基化的频率。但是仪器昂贵，在普通的 分子遗传学实验室没法开展。
[0009] (5)亚硫酸氨盐测序PCR(BSP)，经过亚硫酸盐处理后，设计引物进行PCR扩增获得 目的片段，并对PCR产物进行克隆测序，将序列与未经处理的序列进行比较，判断CpG位点是 否发生甲基化。该方法可靠，且精确度高，能明确目的片段中每一个CpG位点的甲基化状态， 不需要昂贵的仪器，适合在普通的分子遗传学实验室开展，引物设计是实验成功的关键。
【发明内容】
[0010] 本发明提供了一种亚硫酸氨钢测序法定量检测大鼠 H19基因印记控制区甲基化水 平的引物，利用该引物可W准确检测大鼠化9基因印记控制区的甲基化水平。
[0011] 本发明的目的是通过W下技术方案实现的：亚硫酸氨钢测序法定量检测大鼠 H19 基因印记控制区甲基化水平的引物，所述引物包括PCR引物和测序引物，所述PCR引物的上 游引物和测序引物的上游引物的序列均为5^ -AGTGTGTAGGGATTAAGGGGAAATT-3/ (SEQ ID NO. 1);所述PCR引物的下游引物和测序引物的下游引物的序列均为5 / -TCAATCTCAATTACAATCTATTTCAACAAA-3/(沈Q ID N0.2)。
[0012] 与现有技术相比，本发明的有益效果为:本发明在p，p'-孤E暴露大鼠中筛查H19基 因的印记控制区，并针对该印记控制区设计亚硫酸氨盐测序PCR引物，通过测序能能明确目 的片段中每一个CpG位点的甲基化状态，不需要昂贵的仪器，适合在普通的分子遗传学实验 室开展。
【附图说明】
[OOU]图1为H19印记控制区CpG岛预测图；
[0014] 图2为亚硫酸氨钢测序引物与DNA模板的结合位置图；
[0015] 图3为W现有的引物进行亚硫酸氨钢测序PCR扩增产物的电泳结果图；
[0016] 图4为PCR扩增产物进行克隆后菌液PCR扩增产物的电泳结果图；
[0017] 图5为测序后进行甲基化分析图；
[0018] 图6为P，P ' -DDE对精子细胞化9甲基化水平的影响图。
【具体实施方式】
[0019] 下面结合附图和【具体实施方式】对本发明作进一步详细说明。
[0020] 1.印记控制区分析及引物设计
[00別]口，口'-006暴露大鼠精子数量和活力显著下降，印记基因刖9(该基因66加曰111^ Accession是NC_005100.3)表达显著上调，为检验该筛测结果的准确性，本发明对该基因印 记控制区进行CpG岛分析，如图1所示。W经重亚硫酸盐转化后的基因组DNA为模板，使用 meth primer软件设计亚硫酸氨钢PCR引物，并由invihogen公司合成。引物序列如表1所 /J、- 〇
[0022] 表 1
[0023]
[0024] 2.大鼠精子细胞基因组DNA提取
[0025] 收集6只大鼠精子细胞(3只大鼠为p，p'-DDE暴露组，3只大鼠为对照组），用基因组 DM提取试剂盒提取每只大鼠精子细胞基因组DM，操作按照试剂盒说明书进行。
[00%] 3.重亚硫酸盐转化
[0027] 使用德国QIAGEN公司转化试剂盒化piTect Bisulfite Kit)进行重亚硫酸盐转 化，将未甲基化的胞喀晚转变为尿喀晚，而甲基化的胞喀晚不变转化步骤按照该试剂盒说 明书进行。
[002引 4.PCR扩增、克隆和测序
[0029]分别W重亚硫酸盐转化前后的基因组DNA为模板，利用表1中的PCR引物进行扩增， PCR反应体系如下：
[0034] 反应完成后对PCR产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳并拍照，部分样本的电泳结果见 图3,未显示的部分样本的电泳结果与之相同。由图3可见，扩增条带的长度与预期相符。
[0035] PCR产物克隆至pMD19-T-simple载体，参见Takara说明书，挑选10个菌落，使用PCR 法确认载体中插入片段的长度大小，部分样本的电泳结果见图4,未显示的部分样本的电泳 结果与之相同，利用测序引物对阳性菌液进行测序。测序结果用BiQ analyzer软件进行分 析，黑色圆圈代表甲基化，白色圆圈代表非甲基化，见图5。对甲基化水平进行统计分析，见 图6。
[0036] 5.结论:研究结果发现p，p'-DDE暴露大鼠化9印记控制区甲基化水平明显低于对 照。因此，本发明针对H19印记控制区设计的亚硫酸氨钢引物可用于对p，p'-孤E暴露大鼠精 子细胞基因组DNA中化9甲基化水平进行定量检测。
【主权项】
1.亚硫酸氢钠测序法定量检测大鼠 H19基因印记控制区甲基化水平的引物，其特征在 于，所述引物包括PCR引物和测序引物，所述PCR引物的上游引物和测序引物的上游引物的 序列均为S'-AGTGTGTAGGGATTAAGGGGAAAmlSEQ ID N0.1);所述PCR引物的下游引物和 测序引物的下游引物的序列均为Y -TCAATCTCAATTACAATCTATTTCAACAAA-3YSEQ ID N0.2)〇
【专利摘要】本发明公开了一种亚硫酸氢钠测序法定量检测大鼠H19基因印记控制区甲基化水平的引物，所述引物包括PCR引物和测序引物，所述PCR？引物的上游引物和测序引物的上游引物的序列均为5′-AGTGTGTAGGGATTAAGGGGAAATT-3′；所述PCR？引物的下游引物和测序引物的下游引物的序列均为5′-TCAATCTCAATTACAATCTATTTCAACAAA-3′。本发明在p,p’-DDE暴露大鼠中筛查H19基因的印记控制区，并针对该区设计PCR？引物和测序引物，通过亚硫酸氢钠测序能对该印记控制区的甲基化水平进行准确的定量检测。
【IPC分类】C12Q1/68, C12N15/11
【公开号】CN105506108
【申请号】CN201511028206
【发明人】宋杨, 吴南翔, 高明, 王禹, 范宏亮, 谭玉凤, 姚春冀, 刘克澄
【申请人】浙江省医学科学院
【公开日】2016年4月20日
【申请日】2015年12月31日