专利名称：基于引物保护解除的甲基化dna的检测方法
技术领域：
本发明涉及一种甲基化DNA检测方法，尤其涉及一种基于引物保护解除的甲基化 DNA的检测方法。
背景技术：
DNA甲基化是指DNA链上CpG位点的胞嘧啶(C)残基的5，碳上被修饰了一个甲基。DNA甲基化是最早发现的DNA修饰之一，是表观遗传学的重要组成部分。DNA甲基化特征性地发生在DNA链上的CpG 二核苷酸的胞嘧啶残基上，这常见于基因5’端表达调控序列。 DNA甲基化在基因表达的调控中具有重要作用，参与了动物胚胎发育、基因印记和X染色体失活等过程。研究表明，DNA甲基化的改变能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及蛋白质互相作用方式的改变，从而控制基因表达。DNA甲基化状态的改变是引起肿瘤的一个重要因素。CpG岛局部甲基化水平的异常升高，可以导致基因组的不稳定和抑癌基因的不表达。如果抑癌基因中有活性的等位基因失活，则发生癌症的机率就会提高。所以DNA甲基化引人注目的地方就是在肿瘤的早期检测中的应用，因为研究表明表观遗传的变化伴随肿瘤的发生与发展，检测DNA甲基化的改变可以有助于肿瘤的早期发现。目前肿瘤甲基化的研究主要集中在抑癌基因。这是因为人们发现肿瘤的发生可能与抑癌基因启动子区的CpG岛甲基化造成抑癌基因关闭有关。由于CpG岛的局部高度甲基化早于细胞的恶性增生，因此DNA甲基化的检测可以用于肿瘤发生的早期预测。CpG岛甲基化的检测方法众多，其原理分别基于甲基化敏感的限制性内切酶消化法和基于亚硫酸钠修饰DNA的PCR检测法。甲基化敏感性限制性内切酶/Southern法 (methylation-sensitive restriction Endonuclease/Southern,MSRE- Southern)是比较传统的方法，灵敏度低，样品需要量大。甲基化DNA特异性PCR法(Methylation Specific PCR, MSP)及其衍生的甲基化DNA检测方法，是目前检测DNA甲基化的常用方法，具有高灵敏度的同时，假阳性率也很高。
发明内容
本发明提供了一种甲基化DNA的检测方法，通过设计带有荧光标记的尾引物，对 DNA进行PCR扩增，然后进行电泳检测的方法，来判断是否存在甲基化DNA。本发明甲基化DNA的检测方法，步骤如下
步骤1，用亚硫酸盐处理并纯化待测DNA、标准非甲基化DNA和标准甲基化DNA ； 步骤2，确定待测基因的检测区域，在所要检测的基因区域，选择一段含有多个CpG位点的序列作为目标检测序列进行引物设计，以该段序列的5’端的一段序列作为PCR正向引物，以该段序列的3’端的一段序列的互补序列作为PCR反向引物；在双侧引物的5’端加上一段尾引物序列，在正向引物5’端加上一段T7尾引物序列，在反向引物5’端加上一段T3 尾引物序列；合成T7尾引物和T3尾引物，并对T7尾引物进行荧光标记；步骤3，以亚硫酸盐处理过的标准甲基化DNA和非甲基化DNA作为PCR模板，加入Taq DNA聚合酶和具有3’ 5’外切酶活性DNA聚合酶，用所述的正向和反向PCR引物，对亚硫酸盐处理过的待测DNA进行PCR扩增；并以亚硫酸盐处理过的标准非甲基化DNA和标准甲基化DNA作为对照；
步骤4，以步骤3所得的PCR产物为模板，以所述尾引物进行第二次PCR扩增； 步骤5，用核酸分析仪测定步骤3所得PCR扩增产物的DNA片段在毛细管电泳的迁移
率；
步骤6，将步骤5所测结果与标准DNA样品结果对照，如果待测样品中出现与标准甲基化DNA样品一致的迁移率信号，则存在甲基化DNA ；反之，如果待测样品中不出现与标准甲基化DNA样品一致的迁移率信号，则表明待测样品中不存在甲基化DNA。所述步骤1中，所用的亚硫酸盐为亚硫酸钠，用所述亚硫酸盐处理待测DNA的处理步骤为以0. 3M NaOH变性待测DNA，加入由5M亚硫酸钠、0. 5mM氢醌、pH5. 0的混合液，60°C 避光温浴4小时；脱硫并纯化DNA。所述步骤2中，在所要检测的基因序列中，选择一段含有多个CpG位点的序列作为目标检测序列进行引物设计，以该段序列的5’端的一段序列作为PCR正向引物，以该段序列的3’端的一段序列的互补序列作为PCR反向引物，使PCR扩增的DNA片段大小为8(Γ180 碱基长度，使PCR扩增的序列中含有多个CpG位点，一般为纩20个。优选地，所设计的PCR 引物为1圹32碱基长度，在引物的序列中所含CpG位点不多于3个，且在所述CpG位点的C 的位置，正向引物可以用C/T混合代替C，反向引物可以用G/A混合代替G。使所设计的正向引物的3’端的最后一个碱基正好在CpG的C的位置，使这一碱基为Τ，并使这一碱基的3’ 碳原子标记一个磷酸基团；或使所设计的反向引物的3’端的最后一个碱基正好在CpG的C 的位置，使这一碱基为Α，并使这一碱基的3’碳原子标记一个磷酸基团。其中，CpG是指胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)和连接二者的磷酸酯键(P)组成的位点。A 是指腺嘌呤，T是指胸腺嘧啶。所述步骤3中，所用具有3’ 5’外切酶活性DNA聚合酶为古核菌属来源的DNA聚合酶或相同性质的DNA聚合酶；进一步优选为pfu DNA聚合酶。所述步骤4中，所用的尾引物标记可以是D4。所述步骤5中，所用的核酸分析仪可以是CEQ8000 DNA测序仪，
所述待测DNA为人类基因组DNA，所述标准非甲基化DNA与标准甲基化DNA为于待测 DNA相匹配的、已确定的纯的非甲基化人类基因组DNA和已确定的纯的甲基化人类基因组 DNA。其中，所述待测DNA样品可以是人类正常细胞DNA、癌细胞DNA、肿瘤组织基因组 DNA、血细胞DNA、血清DNA、体液DNA或排泄物DNA的样品。如
所述癌细胞为肺癌细胞、胃癌细胞、结肠癌细胞、直肠癌细胞、肝癌细胞、乳腺癌细胞、 淋巴癌细胞、膀胱癌细胞、卵巢癌细胞、肾癌细胞或胰腺癌细胞；
所述肿瘤组织为肺癌组织、胃癌组织、结肠癌组织、直肠癌组织、肝癌组织、乳腺癌组织、淋巴癌组织、膀胱癌组织、卵巢癌组织、肾癌组织或胰腺癌组织；
所述体液包括血液、脑脊髓液、胃液及各种消化液、精液、唾液、泪液、汗液、尿液、阴道分泌液等等。
本发明提供的甲基化DNA和非甲基化DNA分离技术相比现有的技术水平有分离效率高、操作简单、快捷且成本低廉等优点。有效的分离了甲基化DNA与非甲基化DNA，使得在检测甲基化DNA和PCR过程中可靠性提高，使甲基化水平被灵敏的检测出。在肿瘤早期检测、个性化治疗、病情判断和复发监控等方面有着重要的意义。综上所述，本发明一种甲基化DNA检测方法具有适用范围大、方法简单、需要样本量小、不易被干扰、适用混合样本等优点。在肿瘤早期检测、个性化治疗、病情判断和复发监控等方面有着重要的意义。
图1为本发明甲基化DNA检测方法流程图。
具体实施例方式参照图1，对本发明甲基化DNA检测方法具体介绍如下 实施方式(一)
PCR引物设计如下在所要检测的基因序列中，选择一段含有多个CpG位点的序列作为目标检测序列进行引物设计，以该段序列的5’端的一段序列作为PCR正向引物，以该段序列的3’端的一段序列的互补序列作为PCR反向引物，使PCR扩增的DNA片段大小为8(Γ180 碱基长度，使PCR扩增的序列中含有多个CpG位点，一般为纩20个。优选地，所设计的PCR 引物为1纩32碱基长度，且在引物的序列中所含CpG位点不多于3个，在所述CpG位点的C 的位置，正向引物可以用C/T混合代替C，反向引物可以用G/A混合代替G ；且使所设计的正向引物的3’端的最后一个碱基正好在CpG的C的位置，使这一碱基为Τ，并在这一碱基的 3’碳原子标记一个磷酸基团。Ρ16基因转录启动区的甲基化是肺癌等多种癌症细胞具有的特征。Ρ16基因转录启动区的序列如下，有下划线的部分为所选的要检测的区域。Homo sapiens pl6 protein (CDKN2A) gene, CpG island and partial cds, DQ325544. 1
CGGACCGCGTGCGCTCGGCGGCTGCGGAGAGGGGGAGAGCAGGCAGCGGGCGGCGGGGAGCAGCATGGAGCG GGCGGCGGGGAGCAGCATGGAGCCTTCGGCTGACTGGCTGGCCACGGCCGCGGCCCGGGCTCGGGTAGAGGAGGTGC GGGCGCTGCTGGAGGCGGGGGCGCTGCCCAACGCACCGAATAGTTACGGTCGGAGGCCG 甲基化DNA序列，下划线部分为要检测的区域； CGGATCGCGTGCGTTCGGCGGTTGCGGAGAGGGGGAGAGTAGGTAGCGGGCGGCGGGGAGTAGTATGGAGCG GGCGGCGGGGAGTAGTATGGAGTTTTCGGTTGATTGGTTGGTTACGGTCGCGGTTCGGGTTCGGGTAGAGGAGGTGC GGGCGTTGTTGGAGGCGGGGGCGTTGTTTAACGTATCGAATAGTTACGGTCGGAGGTCG 非甲基化DNA序列，下划线部分为要检测的区域； TGGATTGTGTGTGTTTGGTGGTTGTGGAGAGGGGGAGAGTAGGTAGTGGGTGGTGGGGAGTAGTATGGAGTG GGTGGTGGGGAGTAGTATGGAGTTTTTGGTTGATTGGTTGGTTATGGTTGTGGTTTGGGTTTGGGTAGAGGAGGTGT GGGTGTTGTTGGAGGTGGGGGTGTTGTTTAATGTATTGAATAGTTATGGTTGGAGGTTG 所设计的PCR引物
正向引物 5 ’ - GTTGYGGAGAGGGGGAGAGTAGGTAGT [P] -3 ’反向引物 5，- TTAAACAACRCCCCCRCCTCCAACAAC-3， Y=C/T 混合，R=G/A 混合，P=磷酸基团(phosphate) 在正向和反向引物的5’端分别加上T7和T3引物作为尾引物。T7 启动子序列，5，-[F]TAATACGACTCACTATAGGG-3， T3 启动子序列，5’ -ATTAACCCTCACTAAAGGGA-3’
F为荧光标记，如D4。实施方式(二)
在实施方式(一)的基础上，以所设计的引物，以标准的非甲基化DNA和甲基化DNA作为待测样品进行检测，以确定本发明的特异性和灵敏度。步骤1 采用亚硫酸盐处理并纯化已知的标准非甲基化DNA和甲基化DNA。将一定量的亚硫酸钠处理过的标准非甲基化DNA，与梯度稀释的亚硫酸钠处理过的标准甲基化 DNA混合，作为待测样品；
其中，所述亚硫酸盐具体为亚硫酸钠；所述亚硫酸盐处理待测DNA的处理步骤为，以 0. 2M NaOH变性待测DNA，加入由5M亚硫酸钠、0. 5mM氢醌、pH5. 0的混合液，60°C避光温浴 4小时；脱硫并纯化DNA。步骤2:确定待测基因检测区域，按照在实施方式(一)所述的方法设计并合成正向 PCR引物和反向PCR引物；在正向引物的5’末端加上一段20个碱基长度的T7启动子序列作为T7尾引物序列，在反向引物的5’末端加上一段20个碱基长度的T3启动子序列作为 T3尾引物序列。步骤3 =PCR扩增；PCR操作过程，由步骤1所混合的待测DNA样品作为模板 (Template),由步骤2所设计并合成的正向和反向PCR引物(primer)、PCR扩增缓冲液 (Buffer),以对尿嘧啶敏感的DNA聚合酶、四种三磷酸脱氧核糖核苷酸(dNIPs)、以具有 3’ 5’外切酶活性的DNA聚合酶与Taq DNA聚合酶按比例混合，进行PCR扩增；
其中对尿嘧啶敏感的DNA聚合酶为古核菌属来源的DNA聚合酶，具体为pfu DNA聚合酶。步骤4 以步骤3的PCR产物作为PCR反应模板，以T3尾引物和荧光标记的T7尾引物、在与步骤3相同的条件下进行第二次PCR扩增；
其中，相同条件是指与步骤3相同浓度的PCR引物，PCR扩增缓冲液(Buffer)、Taq DNA 聚合酶和四种三磷酸脱氧核糖核苷酸，相同的PCR条件和PCR扩增仪； 其中，所述T7尾引物的荧光标记为D4 ；
步骤5 用核酸分析仪测定PCR扩增产物DNA片段在毛细管电泳的迁移率，判断检测结
果；
其中，所述核酸分析仪为CEQ8000 DNA测序仪；
判断是否存在甲基化DNA，判断方法为将步骤5中所测待测DNA样品的结果与标准样品的信号作对照，如果待测样品中出现与甲基化DNA标准样品一致的迁移率信号，则表明待测样品中存在甲基化DNA ；反之，则不存在。本发明一种甲基化DNA检测方法，通过上述步骤检验本发明的特异性和灵敏度。在医学领域，能够准确而灵敏地测出DNA中是否存在甲基化DNA，就能够对于肿瘤的早期检测、病情判断和癌症的复发监控提供一种很好的指标。
实施方式(三)
在实施方式(二)的基础上，以实际临床样品提取的DNA为待测样品，在与上述实施方式 (二)相同的条件下，检验本发明的实用性。其中，与上述在实施方式(二)相同的条件，指的是除以实际临床样品提取的DNA为待测样品外，所有操作与上述在实施方式(二)相同。所述临床提取的待测DNA样品，为人类正常和癌细胞DNA、肿瘤组织基因组DNA、血细胞DNA、血清DNA、各种体液DNA或各种排泄物DNA的样品。所述癌细胞可以是肺癌细胞、胃癌细胞、结肠癌细胞、直肠癌细胞、肝癌细胞、乳腺癌细胞、淋巴癌细胞、膀胱癌细胞、卵巢癌细胞、肾癌细胞或胰腺癌细胞；所述肿瘤组织可以是肺癌组织、胃癌组织、结肠癌组织、直肠癌组织、肝癌组织、乳腺癌组织、淋巴癌组织、膀胱癌组织、卵巢癌组织、肾癌组织或胰腺癌组织；所述各种体液可以是血液、脑脊髓液、胃液及各种消化液、精液、唾液、泪液、汗液、尿液、阴道分泌液等。上述内容为本发明的具体实施例的例举，对于其中未详尽描述的试剂、设备、操作方法等，应当理解为采取本领域已有的普通及常规试剂、设备、操作方法等来予以实施。以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
权利要求
1.一种基于引物保护解除的甲基化DNA的检测方法，其特征在于，步骤如下步骤1，用亚硫酸盐处理并纯化待测DNA、标准非甲基化DNA和标准甲基化DNA ；步骤2，确定待测基因的检测区域，在所要检测的基因序列中，选择一段含有多个CpG 位点的序列作为目标检测序列进行引物设计，以该段序列的5’端的一段序列作为PCR正向引物，以该段序列的3’端的一段序列的互补序列作为PCR反向引物；并将20碱基长度的T7 序列加在正向引物的5’端作为T7尾引物序列，将20碱基长度的T3序列加在反向引物的 5’端作为T3尾引物序列；合成T7尾引物和T3尾引物，并对T7尾引物进行荧光标记；步骤3，以亚硫酸盐处理过的标准甲基化DNA和非甲基化DNA作为PCR模板，加入Taq DNA聚合酶和具有3’ 5’外切酶活性DNA聚合酶，用所述的正向和反向PCR引物，对亚硫酸盐处理过的待测DNA进行PCR扩增；并以亚硫酸盐处理过的标准非甲基化DNA和标准甲基化DNA作为对照；步骤4，以步骤3所得的PCR产物为模板，以所述T3和荧光标记的T7尾引物进行第二次PCR扩增；步骤5，用核酸分析仪测定步骤4所得PCR扩增产物的DNA片段在毛细管电泳的迁移率；步骤6，将步骤5所测结果与标准DNA样品结果对照，如果待测样品中出现与标准甲基化DNA样品一致的迁移率信号，则存在甲基化DNA;反之，如果待测样品中不出现与标准甲基化DNA样品一致的迁移率信号，则表明待测样品中不存在甲基化DNA。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤1中所述亚硫酸盐具体为亚硫酸钠；所述亚硫酸盐处理待测DNA的处理步骤为以0. 3M NaOH变性待测DNA，加入由5M亚硫酸钠、0. 5mM氢醌、pH5. 0的混合液，60°C避光温浴4小时；脱硫并纯化DNA。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤2中，所设计的PCR引物为 18 32碱基长度，并使PCR扩增的DNA片段大小为8(Tl80碱基长度，并使PCR扩增的序列中含有多个CpG位点。
4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，在引物的序列中所含CpG位点不多于 3个，且在所述CpG位点的C的位置，正向引物可以用C/T混合代替C，反向引物可以用G/A 混合代替G，使所设计的正向引物的3’端的最后一个碱基正好在CpG的C的位置，使这一碱基为Τ，并使这一碱基的3’碳原子标记一个磷酸基团；或使所设计的反向引物的3’端的最后一个碱基正好在CpG的C的位置，使这一碱基为Α，并使这一碱基的3’碳原子标记一个磷酸基团。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤3中，所用具有3’、’外切酶活性DNA聚合酶为古核菌属来源的DNA聚合酶或相同性质的DNA聚合酶的混合。
6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述具有3’ 5’外切酶活性DNA聚合酶为pfu DNA聚合酶，所述的核酸分析仪为CEQ8000 DNA测序仪，所用的Τ7尾引物的荧光标记为D4。
7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述Τ7和Τ3序列长度为20碱基。
8.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述待测DNA为人类基因组DNA，所述标准非甲基化DNA与标准甲基化DNA为于待测DNA相匹配的、已确定的纯的非甲基化人类基因组DNA和已确定的纯的甲基化人类基因组DNA。
9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述待测DNA样品为人类正常细胞 DNA、癌细胞DNA、肿瘤组织基因组DNA、血细胞DNA、血清DNA、体液DNA或排泄物DNA的样品。
10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于，所述癌细胞为肺癌细胞、胃癌细胞、结肠癌细胞、直肠癌细胞、肝癌细胞、乳腺癌细胞、 淋巴癌细胞、膀胱癌细胞、卵巢癌细胞、肾癌细胞或胰腺癌细胞；所述肿瘤组织为肺癌组织、胃癌组织、结肠癌组织、直肠癌组织、肝癌组织、乳腺癌组织、淋巴癌组织、膀胱癌组织、卵巢癌组织、肾癌组织或胰腺癌组织；所述体液包括血液、脑脊髓液、胃液及各种消化液、精液、唾液、泪液、汗液、尿液、阴道分泌液。
全文摘要
本发明涉及一种甲基化DNA检测方法，步骤如下步骤1，用亚硫酸盐处理待测DNA；步骤2，在要检测的目标区域内，选择一段连续序列，合成带有尾引物序列的PCR引物；步骤3，加入TaqDNA聚合酶和具有3’~5’外切酶活性DNA聚合酶进行PCR扩增反应；步骤4，以带有荧光标记的尾引物进行第二次PCR扩增；步骤5，测定DNA片段在毛细管电泳的迁移率并判定样品中是否存在甲基化DNA。本发明提高了检测结果的可靠性，灵敏度高；在肿瘤早期检测、个性化治疗、病情判断和复发监控等方面有着重要的意义。
文档编号C12Q1/68GK102399864SQ20101028309
公开日2012年4月4日 申请日期2010年9月16日 优先权日2010年9月16日
发明者王建 申请人:上海迦美生物科技有限公司