16S rRNA甲基化酶rmtB的LAMP检测引物、检测试剂盒及检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于细菌基因检测技术领域，特别涉及氨基糖苷类抗生素耐药基因16s rRNA甲基化酶rmtB的LAMP检测引物、检测试剂盒及检测方法。
【背景技术】
[0002] 16S rRNA甲基化酶是2003年报道的一种新耐药决定因子，介导细菌对多种氨基 糖苷类高水平耐药，最初发现于肠杆菌科中，目前在革兰氏阴性菌中已发现至少由12种等 位基因编码的10种16S rRNA甲基化酶。该类耐药决定因子的作用机制独特，能够以S-腺 苷甲硫氨酸分子为甲基供体，对核糖体RNA进行转录后甲基化，使氨基糖苷类不能与其作 用靶点相接合，从而导致多种革兰氏阴性杆菌同时对阿米卡星、庆大霉素等多种临床常用 氨基糖苷类药物高度耐药。目前已从多个国家和地区及多种临床革兰氏阴性杆菌中检测到 编码 RmtA、RmtB、RmtC、RmtD、RmtE、RmtF、RmtG、RmtH、ArmA 及 NpmA 等 16S rRNA 甲基化酶 的耐药基因及其等位基因。由于大多编码16S rRNA甲基化酶的基因常位于可移动的遗传 因子如接合型质粒、整合子、转座子、插入序列共同区上，易引起耐药性和耐药基因的传播， 因而导致临床抗感染治疗的失败。
[0003] RmtB广泛存在于黏质沙雷氏菌、肺炎克雷伯菌、大肠杆菌、阴沟肠杆菌、弗劳地枸 橼酸杆菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、奇异变形杆菌等临床菌中，且在来源于日本、中国 台湾、韩国、墨西哥、希腊、中国、比利时、埃及、美国、巴西等国家和地区的多种菌株中均有 相关报道。
[0004] 对于携带氨基糖苷类抗生素耐药基因16S rRNA甲基化酶rmtB，它的实验室诊断 主要基于PCR技术进行确证。PCR方法容易产生假阳性，并且检测成本高，操作比较复杂，检 测时间长（一般需要2-3小时），这些都影响了临床携带rmtB基因的检测结果。
[0005] 环介导等温扩增方法（LAMP)是近几年新兴的一种基因扩增方法，对仪器设备要 求不高，只需要恒温水浴锅或金属浴即可，成本低，且临床上容易做到，检测时间较短（不 超过1个小时），为快速、准确诊断基因的一种新方法。环介导等温扩增方法已经广泛应用 于检测细菌领域，并有很多相关专利获得授权。目前国内外均未见使用LAMP方法检测氨基 糖苷类抗生素耐药基因16S rRNA甲基化酶rmtB基因的报道。
【发明内容】
[0006] 为了解决PCR扩增易出现假阳性、检测成本高、操作复杂、检测时间长的问题，填 补使用LAMP检测氨基糖苷类抗生素耐药基因16S rRNA甲基化酶rmtB的空白，本发明提供 了 16S rRNA甲基化酶rmtB的LAMP检测引物、检测试剂盒及检测方法。
[0007] 本发明是通过以下措施实现的：一种16S rRNA甲基化酶rmtB的LAMP检测引物， 由一对外引物F3、B3, 一对内引物FIP、BIP和一个环引物L组成，其核苷酸序列分别如下：
[0008] 外引物 F3 :5' -CGATGCCCTCACCTCCAT-3'（SEQ No. 1);
[0009] 外引物 B3 :5' -GCCmTTTACATCGCCCG-3'（SEQ No. 2);
[0010] 内引物 FIP :5'-ATTCCTCAGTCAGGATGCGCCGGCCTCAAAAAAATACCGCG-3'（SEQ No. 3);
[0011] 内引物 BIP :5'-CCAAACAGACCGTAGAGGCTGCCAGCCTTGAGCGATTCCG-3'（SEQ No. 4);
[0012] 环引物 L :5' -GCTGCATGGAATTTGCGGGG-3'（SEQ No. 5)。
[0013] 其中，外引物与内引物的摩尔比为1:8,外引物（F3或B3)与环引物的摩尔比为 1:4〇
[0014] 本发明还公开了一种含有上述检测引物的LAMP检测试剂盒。
[0015] 优选的，上述LAMP检测试剂盒，包括若干个（至少3个）装有反应液的LAMP反应 管，其中，每25yL反应液中含有：12. 5yL 2X等温反应缓冲液、l.OyL Bst DNA聚合酶、 40pmol内引物FIP、40pmol内引物BIP、5pmol外引物F3、5pmol外引物B3、20pmol环引物 L、待检细菌基因组DNA若干（一般为1-2 y L)，余量为灭菌双蒸水；
[0016] 其中，Bst DNA聚合酶的活性单位为8U/ y L ;
[0017] 2X 等温反应缓冲液中含有 40mM pH 为 8.8 的 Tris-HCl、20mM KCl、16mM MgS04、 20mM(NH4)2S04、0. 2wt% Tween20、l. 6M 甜菜碱、2. 8mM dNTP〇
[0018] 进一步，上述25 y L反应液中还含有1 y L的钙黄绿素。
[0019] 本发明还公开了采用上述引物16S rRNA甲基化酶rmtB的LAMP检测方法，其特征 是，
[0020] (1)提取待检细菌基因组的DNA ;
[0021] (2)使用上述的检测试剂盒进行检测，具体操作为：将待检细菌基因组DNA加入 LAMP反应管的反应液内，混勾，同时设阴性对照和阳性对照，阳性对照中加入反应液内的为 含有rmtB基因的基因组DNA，阴性对照中加入反应液内的为灭菌双蒸水，将LAMP反应管置 水浴锅中进行扩增，扩增条件为：63°C水浴恒温反应45-60min ;
[0022] (3)结果判断：反应结束后，凭借肉眼可见的白色沉淀判定结果，有白色沉淀为阳 性，清亮为阴性；或在扩增反应前的反应管中加入1 UL钙黄绿素，反应结束后，凭借反应液 的颜色判定结果，绿色的为阳性，仍保持橙色的为阴性。
[0023] 其中，步骤（1)中提取待检细菌基因组DNA包括以下步骤：将待检的细菌菌株过 夜培养后，取lmL的菌液12000rpm离心2min，彻底弃上清，取沉淀加入lmL无菌双蒸水，沸 水浴l〇min，12000rpm离心2min，取上清至新离心管中，测定并调整DNA浓度为300_500ng/ yL，-20°C保存备用。
[0024] 本发明的有益效果：
[0025] 1、采用LAMP技术，特异性强，比PCR检测方法灵敏度更高，不需要昂贵的PCR仪 器，只需要普通的金属浴或水浴锅即可，且结果不必用凝胶电泳方法来观察，通过肉眼观察 颜色变化即可判定结果，时间大大缩短，从普通PCR仪的2~3小时缩短到1小时之内，简 单而快速，可广泛用于兽医及人医领域包括实验室及临床基层对携带rmtB基因的氨基糖 苷类耐药细菌的快速检测；
[0026] 2、解决了现有技术时间长、工作量大、交叉污染、操作复杂等缺陷；
[0027] 3、具有特异性强、灵敏度高、快速且成本低、操作方法更简单，适于现场快速检测 的优点。
【附图说明】
[0028] 图1为实施例2扩增得到的产物通过肉眼直接观察的检测结果，其中，1号管为阴 性对照，2号管为阳性对照，3号管为检测管；1号管保持橙色不变为阴性，2号管变为绿色为 阳性，3号管变为绿色为阳性；
[0029] 图2为实施例3中LAMP方法检测氨基糖苷类抗生素耐药基因16S rRNA甲基化酶 rmtB的灵敏度肉眼直接观察结果，其中1-9号管中加入的为倍比稀释的含rmtB基因的大 肠杆菌基因组DNA，1 ~9分别为：500ng/iiL、50ng/iiL、5ng/iiL、0.5ng/iiL、5*lCr2ng/iiL、 5*l(T3ng/iiL、5*l(r4ng/iiL、5*l(r5ng/iiL、5*l(r6ng/iiL ;结果显示，1-8 号管变为绿色，为 阳性，9号管保持橙色不变为阴性；
[0030] 图3为实施例3中普通PCR方法检测rmtB基因灵敏度检测结果，其中1-9号PCR 反应模板为倍比稀释的含rmtB基因的大肠杆菌基因组DNA，1~9分别为：500ng/y L、 50ng/ y L、5ng/ y L、0. 5ng/ y L、5*10 2ng/ y L、5*10 3ng/ y L、5*10 4ng/ y L、5*10 5ng/ y L、 5*10_6ng/ y L ;M :DL2000 ;结果显示，1-6号管能扩增到目的大小条带，为阳性，7-9号管没有 扩增到肉眼可见的目的条带，为阴性；
[0031] 图4为实施例4中LAMP方法检测rmtB基因特异性检测结果，其中，1-8号管中加 入的模板分别为阳性对照、阴性对照、大肠杆菌（ATCC 25922, rmtB阴性）、沙门氏菌（ATCC 50035, rmtB阴性）、金黄色葡萄球菌（ATCC 29213, rmtB阴性）、金黄色葡萄球菌（ATCC 25923, rmtB阴性）、铜绿假单胞菌（ATCC 27853, rmtB阴性）、肺炎双球菌（ATCC 49619， rmtB阴性）；检测结果只有阳性对照变为绿色，其他均为阴性；
[0032] 图5为实施例4中普通PCR方法检测rmtB基因特异性检测结果，其中，1-8号 管中加入的模板分别为阳性对照、阴性对照、大肠杆菌（ATCC 25922, rmtB阴性）、沙门氏 菌（ATCC 50035, rmtB阴性）、金黄色葡萄球菌（ATCC 29213, rmtB阴性）、金黄色葡萄球 菌（ATCC 25923, rmtB阴性）、铜绿假单胞菌（ATCC 27853, rmtB阴性）、肺炎双球菌（ATCC 49619, rmtB阴性）；M :DL 2000 ;结果大肠杆菌（ATCC 25922, rmtB阴性）和肺炎双球菌 (ATCC 49619, rmtB阴性）出现假阳性。
【具体实施方式】
[0033] 实施例1 :制备检测氨基糖苷类抗生素耐药基因16S rRNA甲基化酶rmtB的试剂 合 ITTT.
[0034] (1)检测引物的设计
[0035] 根据NCBI上已知的rmtB基因保守序列，采用Primer5. 0软件分别设-H对特异 性内引物FIP、BIP，一对特异性外引物F3、B3,以及环引物L，用以对氨基糖苷类抗生素耐药 基因16S rRNA甲基化酶rmtB的LAMP检测：
[0036] 外引物 F3 :5' -CGATGCCCTCACCTCCAT-3'（SEQ No. 1);
[0037] 外引物 B3 :5' -GCCmTTTACATCGCCCG-3'（SEQ No. 2);
[0038] 内引物 FIP :5'-ATTCCTCAGTCAGGATGCGCCGGCCTCAAAAAAATACCGCG-3,（SEQ No. 3);
[0039] 内引物 BIP :5'-CCAAACAGACCGTAGAGGCTGCCAGCCTTGAGCGATTCCG-3，（SEQ No. 4);
[0040] 环引物 L :5' -GCTGCATGGAATTTGCGGGG-3'（SEQ No. 5)。
[0041] ⑵检测试剂盒
[0042] 设置检测氨基糖苷类抗生素耐药基因16S rRNA甲基化酶rmtB的试剂盒，该试剂 盒包括装有反应液的LAMP反应管，
[0043]