人源dna甲基化分析中重亚硫酸盐转化dna转化效率的评估方法
【技术领域】
[0001 ]本发明涉及DNA甲基化检测领域，主要是利用TaqMan实时PCR评估重亚硫酸盐转化 人源DNA样本后胞嘧啶转化效率的方法。提供了DNA序列、引物和探针序列及应用。
【背景技术】
[0002] DNA甲基化是一种重要的表观遗传学修饰，与动植物许多生命过程如生长、发育和 分化相关，DNA甲基化异常也与人类许多疾病如肿瘤密切相关。研究和测定DNA甲基化已是 生命科学研究中重要内容。在DNA甲基化研究中，重亚硫酸盐转化DNA是一种最常见的检测 手段。重亚硫酸盐能将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，再使用后续检测手段检测修饰。重 亚硫酸盐转化DNA的转化效率决定了DNA甲基化检测的准确性，未完全转化的DNA会在随后 的检测中导致错误的假阳性结果。因此，评估重亚硫酸盐转化DNA的效率是非常必要的。本 研究提出一种简单可行的检测方法，通过TaqMan qPCR精确评估重亚硫酸盐的DNA的转化效 率。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的是建立评估重亚硫酸盐转化人源DNA样本后胞嘧啶转化效率的有效 方法，快速、方便和准确地检测DNA样本经重亚硫酸盐转化的效率。
[0004] 本发明所述的方法能够有效的评估人源的DNA样品重亚硫酸盐的转化率，为提高 DNA甲基化分析准确性提供有效方法。
[0005] 本发明精确测定重亚硫酸盐转化DNA转化效率的原理如图2，基因组DNA分别经重 亚硫酸盐转化与未经重亚硫酸盐转化，两组模板分别使用不同的实时PCR引物与探针进行 相应的检测，评估人源的DNA样品重亚硫酸盐的转化率中，建立转化与未转化的DNA标准曲 线，分别使用不同探针和引物检测转化后的DNA样本，并使用已知的DNA样本评估该β-Actin 启动子上游序列评估该方法的可靠性。
[0006] 本发明方法，包括以下步骤：
[0007] 1)设计并扩增DNA标准品及引物和探针：
[0008] 1)标准品1:是指与人源的β-actin上游一段不包含CG位点DNA同源的序列，该序列 未经重亚硫酸盐转化；
[0009] 2)标准品2:是指标准品1中未甲基化的胞嘧啶全部转化为尿嘧啶后的序列；
[0010] 3)引物1和探针1:是指根据标准品1的序列设计的用于扩增标准品1的检测引物和 探针；
[0011] 4)引物2和探针2:是指根据标准品2的序列设计的用于扩增标准品2的检测引物和 探针；
[0012 ] (2)使用重亚硫酸盐转化人源的DNA，使DNA中未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶。
[0013] (3)以未转化的任意人源DNA和相应转化的DNA的样本为模板，分别使用对应的引 物1和引物2应用Taq酶进行PCR扩增并纯化分别制备标准品1和标准品2。
[0014] (4)使用所述引物1和探针1以及引物2和探针2,以所述标准品1与标准品2按照梯 度稀释为模板，分别做标准曲线，其中标准曲线以模板的拷贝数CN对应相应的Ct值；
[0015] (5)将待测的人源的DNA样本使用重亚硫酸盐进行转化。
[0016] (6)使用引物1和探针1以及引物2和探针2,以步骤(4)转化后的DNA样本为模板，分 别检测转化后人源DNA样本中未转化的DNA与转化的DNA的Ct值。再根据步骤(4)中的标准曲 线，计算出样本中未转化的DNA与转化的DNA相应的拷贝数；
[0017] (7)使用计算公式：重亚硫酸盐转化DNA转化率（％ )=转化的DNA拷贝数/(未转化 的DNA拷贝数+转化的DNA拷贝数）X 100%，计算转化率。
[0018] 本发明所述的方法，适用于人源基因组经重亚硫酸盐转化效率的检测。所述的检 测序列为人源β-Actin启动子上游DNA序列，作为一个具体的实例，标准品1的序列如SEQ ID NO. 1所示，标准品2的序列如SEQ ID NO.2所示;但并不限于此。标准1和标准品2的引物，本 领域技术人员可以根据其具体序列特征针对包括人再内的不同物种的DNA进行设计。
[0019] 由于TaqMan实时PCR的高度特异性和灵敏性，该方法可以检测极低的未转化完全 的DNA样本。为了评估方法的准确性，分别应用两种方法检测5组比例按不同混合的DNA模 板，并使用该方法检测不同商业化试剂盒转化相同样本的转化效率。结果表明该方法十分 可靠。
[0020] 本发明所述DNA序列及引物和探针序列，适用于检测DNA基因组经重亚硫酸盐转化 效率的检测应用，为提高DNA甲基化分析准确性提供有效方法。
【附图说明】
[0021] 图1.不同的TaqMan探针分别检测人源转化的和未转化的DNA模板，5个下划线标注 的数字分别代表转化与未转化组的探针所在的位置。
[0022]图2.精确测定重亚硫酸盐转化DNA转化效率的原理。
[0023]图3.特异性的引物与探针分别结合经重亚硫酸盐转化转化后的DNA以及未经转化 的DNA模板。
[0024] 图4.重亚硫酸盐转化后人源DNA以及未经重亚硫酸盐转化人源DNA的标准曲线。重 亚硫酸盐转化与未转化DNA分别进行5倍梯度稀释作为模板，使用TaqMan实时PCR分别建立 标准曲线。
【具体实施方式】
[0025] 下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。
[0026] 1.1细胞
[0027] 人肾近曲小管上皮细胞(Human kidney-2，HK_2)来至本实验室。
[0028] 1.2主要试验试剂
[0029] TaqMan Universal Master Μ?χΠ 试剂购于 Invitrogen;Epimark Bisulfite Conversion Kit购于NEB公司；EpiTect Bisulfite Kit和DNeasy Blood and Tissue Kit 购于Qiagen公司；Cycle Pure Kit购于Omega BioTek公司；EZ DNA Methylation-Gold Kit 购于Zymo Research公司；TaqMan实时定量PCR引物以及探针使用Primer Express 3.0(购 于ABI公司）设计，并由上海桑尼生物科技公司合成。
[0030] 1.3引物
[0031] TaqMan探针以及引物设计
[0032] 根据已登录的人β-actin启动子上游DNA序列（GenBank:NG_007992.1)，分别设计 未转化的DNA序列SEQIDN0.1和重亚硫酸盐转化后转化的DNA序列SEQIDN0.2的TaqMan 探针以及引物（图1)。其中探针5'端为荧光报告基团FAM，3'端为淬灭基团TAMRA，未转化DNA 探针与转化的DNA探针分别靶向未转化的DNA SEQ ID N0.1与转化的DNA模板SEQ ID N0.2。 弓丨物和探针序列如下：
[0033]引物1:
[0034] 未转化DNA上游引物：5/-GATGGAGGAGGCTCAGCAAGT-3 /(SEQIDN0·3)
[0035] 未转化DNA下游引物 W-GGACCTGCTCCT CCCTTGA-3'(SEQ ID N0.4)
[0036] 探针 1:
[0037] 未转化DNA探针 dFAM-S' -ACCACCACCCAGCACACAGTGGCAGACACA-3' TAMRA(SEQ ID NO. 5)
[0038] 引物2:
[0039] 转化DNA上游引物 j'-TGGTGATGGAGGAGGITTAGTAAGT-S'(SEQ ID N0.6)
[0040] 转化DNA下游引物：5' -AACCAATAAAACCTACTCCTCCCTTAA-3' (S