专利名称：腐胺n-甲基转移酶，编码腐胺n-甲基转移酶的重组dna分子，生物碱含量减少的转基因烟 ...的制作方法
技术领域：
本发明涉及高度纯化的腐胺N—甲基转移酶，其纯化的新方法和其反义和有义基因。特别是本发明涉及使用有意义和反义腐胺N—甲基转移酶基因生产烟碱水平在遗传上被改变的转基因烟草植物。该转基因植物在用于烟草工业的烤烟产品中是有用的。
本发明的背景为了从烟草中去掉烟碱使用了各种各样的方法。然而这些方法中，大多数对烟碱没有足够的选择性。它们从烟草中去掉了其它成份，从而对其风味和香味产生了不利影响。而且，这些方法典型地较复杂和昂贵。
烟碱和生物合成的化合物一般通过一系列生化反应形成，其中每步反应由一种不同的酶催化。产生给定化合物的特定反应系列称作途径。抑制一种途径运转并因此抑制其终产物产量的一种方法是减少该途径中一种所需酶的量。如果该酶的丰度相对于该途径中的其它酶而言在正常情况下低得足以使该途径运转中的酶速度受到限制，那么该酶丰度的任何减少将以终产物的产量降低而反映出来。如果酶的相对丰度在正常情况下不限制速度，为了减少该途径的产量，可能必须减少它在细胞中的丰度使足以产生速度限制。同样地，如果酶的相对丰度限制速度，那么其丰度的任何增加将导致途径中终产物产量的增加。
烟碱首先在烟草植物的根部形成，随后运输到叶中，并在那里贮存起来(Tso，Physiology and Biochemistry of Tobacco Plants，PP，233—234，Dowden，Hutchinson & Ross，Stroudsburg，PA(1972)。烟碱分子包含2个杂环吡啶部分和吡咯烷部分，每个杂环来自不同的生化途径。烟碱的吡啶部分来自烟酸。烟碱的吡咯烷部分通过从腐胺到N—甲基腐胺然后到N—甲基二氢吡咯的途径来提供。在烟碱生物合成中必经的步骤是从腐胺形成N—甲基腐胺(Goodwin and Mercer，Introduction to Plant Biochemistry，PP.488—491，Pergamon Press，New York，(1983))。
腐胺向N—甲基腐胺的转化由腐胺N—甲基转移酶(“PMT”)催化，以S—腺苷甲硫氨酸作为甲基供体。在烟草中为烟碱合成提供N—甲基二氢吡咯的途径中PMT表现为限速酶(Feth et al，“Regulation in Tobacco Callus of Enzyme Actiuities of theNicotine Pathway”，Planta，168，PP.402—407(1986)；Wagner etal.，“The Regulaton of Enzyme Acttvitives of the NicotinePathway in Tobacco”，Physiol，Plant，68，PP.667—672(1986))。
对PMT的相当粗糙的制品(纯化30倍)已进行了有限的鉴定(Mizusaki et al.，“Phytochemical studies on Tobacco AlkaloidsXIV.The Occurrence and Proertes of Putrescine N—Methyltransferase in Tobacco Plants”，Plant Cell Physiol，12，PP.633—40(1971))。得到该制品的纯化步骤局限于从最初的提取物中进行硫酸铵沉淀和凝胶过滤色谱同上。
反义RNA技术使产生的植物特征为酶(或其它蛋白质)的水平比由该植物正常情况下所含的水平明显要低。通常情况下，编码靶酶的基因转录产生单链mRNA，然后由核糖体翻译产生靶酶。反义RNA分子是一种其核苷酸序列与靶mRNA分子某部分互补的RNA分子。因此，反义RNA分子与靶mRNA分子将进行互补碱基配对(杂交)，导致靶mRNA分子不能翻译，更易于降解，或两种情况都发生。从而使细胞对于由靶mRNA编码的特异性酶的生产能力受到抑制。
反义技术在一些实验室中已用于产生特征为特异性酶量比正常值低的转基因植物。例如，将苯基苯乙烯酮合成酶(一种花色素生物合成途径的酶)反义基因插入烟草和短牵牛属植物基因组中已产生了苯基苯乙烯酮合成酶水平降低的植物。这些转基因烟草和短牵牛属植物开出比正常颜色浅的花(Van der Krol et al，“An Anti—sense Chalcone Synthase Gene in Transgenic Plants InhibitsFlower PTgmentaion”，Nature，333，PP.866—69(1988))。反义RNA技术在西红柿中也成功地用于抑制多聚半乳糖醛酸酶的产生(Smith et al，“Antisense RNA Inhibitkn of Polygala cturonaseGene Expression in Transgenic Tomatoes”，Nature，334，PP.724—26(1988)；Sheehy et al，“Reduction of PolygalacturonaseActivity in Tomato Fruitby Antisense RNA”，Proc.natl Acad.sci.USA，85，PP.8805—09(1988))，在烟草中已成功地用于抑制核酮糖双磷酸羧化酶小亚基的产生(Rodermel et al，“Nuclear—organelle InteractionsNuclear Antisense Gene InhibitsRibulose Bisphosphate Carboxylase Enzyme levels inTransformed Tobacco Plants”，Cell，55，PP.673—81(1988))。作为选择，用给定酶的基因以有意义(即正常的)取向转化植物可产生其特征为该酶量高于正常值的转基因植物。
通过改变PMT水平来降低或升高烟碱水平的烟草植物遗传工程尚未成为可能，因为不知道不经过PMT酶的预先纯化来克隆PMT基因的方法，而且在本发明之前也不知道PMT酶的纯化方法。
附图的简要描述
图1是12.5％银染的SDS—聚丙烯酰胺凝胶照片的翻版，显示了在烟草PMT纯化方法的连续阶段获得的蛋白质图谱。泳道1和6分子量标准蛋白质(磷酸化酶B，95.5KD；谷氨酸脱氢酶，55.0KD；卵清蛋白，43.0KD；乳酸脱氢酶，36.0KD；磷酸酐酶29.0KD；乳球蛋白，18.4KD；细胞色素C，12.4KD)。泳道240—65％硫酸铵分离物。泳道3从疏水反应柱收集的PMT活性峰馏分。泳道4来自阴离子交换柱浓缩的腐胺洗脱物。泳道5来自阴离子交换柱经自由流动等电聚焦的浓缩物的PMT活性峰馏分。
图2描绘了在12.5％未变性的聚丙烯酰胺凝胶3mm系列切片上加上来自阴离子交换柱的浓缩的腐胺洗脱物后的PMT活性。PMT酶活性以作为产物回收的每分种14c的蜕变(高出背景的)来表示，并称为“相对活性”。
图3是银染的12.5％SDS—聚丙烯酰胺凝胶照片的翻版。对该凝胶PMT活性带和周围的未变性电泳凝胶连续的3mm切片(图2)进行了纯度和表观分子量分析。命名为“sm”的泳道含有起始材料(即用于未变性凝胶的材料)。命名为“std”的泳道含有分子量标准蛋白质(磷酸化酶B，95.5KD；谷氨酸脱氢酶，55.0KD；卵清蛋白，43.0KD；乳酸脱氢酶，36.0KD，碳酸酐酶，29.0DK；乳球蛋白18.4KD；细胞色素C、12.4KD)。
图4描绘了经硫酸铵分级分离，疏水反应层折和从阴离子交换柱上进行腐胺洗脱，接着浓缩样品纯化的烟草PMT经等电聚焦所得馏分的相对PMT活性和pH。PMT酶活性以作为产物回收的每分钟14c的蜕变(高出背景的)来表示，并命名为“相对活性”。
图5是12.5％银染的SDS一聚丙烯酰胺凝胶照片的翻版。显示的PMT蛋白质带(“a1”和“a2”)被切下(电印迹到惰性膜上后)并用于氨基酸序列测定。加到凝胶上的样品是从阴离子交换柱以腐胺洗脱的物质等电聚焦馏分的等公试样。用于序列分析的实际带来自与用本图凝胶分析中相同物质的等份试样加样的聚丙烯酰胺凝胶不同(但相似)的凝胶。
本发明综述本发明首次提供了高度纯化的腐胺N—甲基转移酶(“PMT”)，和其纯化的新方法。
本发明的纯化方法包含将烟草植物提取物加到阴离子交换介质的步骤，其中所用的温度，pH值和提取物成份使PMT能被阴离子交换介质滞留。然后用含有有效量多胺的洗脱缓冲液从阴离子交换介质中洗脱PMT，其中洗脱温度、洗脱缓冲液的pH值和化学成份使除多胺外，PMT能被阴离子交换介质滞留。
在优选的实施例中，阴离子交换介质洗脱物在阴离子交换介质洗脱缓冲液存在的条件下直接将洗脱物加到对PMT具有亲合力的色谱介质上，然后洗脱结合的物质来浓缩。最优选的是，阴离子交换柱的出口与W—氨基已基琼脂糖柱的进口相连，其中从阴离子交换柱上收集的稀释的PMT接着以更浓缩的形式洗脱。
本发明的PMT分子量在大约55和65千道尔顿之间，天然等电点大约在pH5.0和6.0之间，对腐胺的Km大约在300μm和500μm之间，对S—腺苷甲硫氨酸的Km在大约100μm和150μm之间。在优选的实施例中，PMT包含一个17氢基酸的序列，它选自在序列描述中定义为SEQ ID NO1，SEQ ID NO2和SEQ IDNO3的氨基酸序列。
本发明还提供了编码腐胺N—甲基转移酶的有意义和反义重组DNA分子，包含这些重组DNA分子的载体以及用这些DNA分子和载体转化的转基因烟草细胞和植物。本发明的转基因烟草细胞和植物特征为烟碱含量比未转化的对照烟草细胞和植物更低或更高。
本发明的详细描述PMT的纯化用于PMT纯化的起始材料由烟草根组成。优选的是根从水载法生长的烟草植物收获。水载培养在高度控制能再现的条件下促进植物的生长，并能以干净的完整的状态有效收获大批的丝状根系统。
烟草种子在潮湿的植物盆栽混合物表面或接近表面处发芽。最优选的条件是大约80°F和60％相对湿度。种子发芽大约2周后，间苗(去掉多余的幼苗)便剩下的幼苗有足够的空间进行无遮蔽的生长，以便长到大约6英寸高并有大约6片叶的状态。幼苗达到大约6英寸时，一般将它们连同根系统和完整的盆栽物质小团一起移植到含有合适的营养液和营养液通气(通氧)装置的水栽装置中。水栽装置还应提供溶解性营养物的补充且大小应足以容纳烟草植物的充分生长。
去掉花头(去顶)(商品烟草培养的典型操作)促进根的生长并增加叶的烟碱含量为本领域所熟知。因此，用作PMT纯化起始材料的植物一般在发育的适当阶段去顶。种植和去顶之间的适当间隔取决于一些因素，特别包括植物品种，光照强度，光周期，土壤和空气温度，土壤湿度和矿物质营养。然而，典型地在去顶3至7天后收获根。在给定的一套生长条件下对给定烟草品种的最佳去顶时间可被本领域的普通技术人员很容易地确定。
优选的是用冷水洗涤收获的根，然后用Buchner漏斗抽吸除去残余的水。洗净的根可立即使用或收获后立即冷冻于-80℃。冷冻的根贮存于-80℃直至使用。
对于典型的PMT纯化程序，每升提取缓冲液内含大约400到600g冷冻的根组织，放在高速捣碎器内匀浆。典型地提取缓冲液含有效量的一种或多种缓冲剂，一种或多种还原剂，一种或多种重金属螫合剂，一种或多种水活度调节剂，一种或多种蛋白酶抑制剂。优选的提取缓冲液还含有效量的一种或多种酚化合物吸附剂。这些试剂的有效量取决于所用的特定试剂；而且所用的量一般可从在植物蛋白质纯化过程中所用的典型量中选出。因此，试剂和其有效量的选择是普通技术人员所熟知的。
提取缓冲液的pH值应在大约7.2和8.3之间，优选大约7.5。可以使用任一在所需pH值下提供有效pH缓冲能力的具有一定解离常数(PKa)的水溶性化合物。优选的缓冲试剂还必须是可为紫外光所透射的。合适的缓冲剂特别包括三(羟甲基)氨基甲烷(“Tris”)，咪唑，磷酸盐，N—吗啉代丙烷磺酸(“MOPS”)，N—三(羟甲基)甲基—2—氨基乙烷磺酸(“TES”)，三乙醇胺，和N—三(羟甲基)—甲基—甘氨酸(“Tricine”)。优选Tris缓冲液。
为了抑制可能出现的蛋白质巯基氧化和植物酚类化合物向反应性自由基的氧化(两者都可能使PMT失活)，向提取缓冲液中加入还原剂。合适的还原剂特别包括二硫苏糖醇(“DTT”)，二硫赤藓糖醇，2—巯基乙醇，疏基乙酸盐，谷脱甘肽，半脱氨酸、和抗坏血酸。优选DTT和抗坏血酸。
为了防止由重金属引起的蛋白酶的活化和PMT的可能失活(它们通过直接与PMT反应或通过金属促进酚类化合物氧化成可灭活PMT的种类)，向提取缓冲液中加入重金属合剂。优选的重金属螫合剂是乙二胺四乙酸(“EDTA”)，但其它常规螫合剂，如乙二醇双(B—氨基乙醚)—N，N，N′，N′—四乙酸(“EGTA”)和柠檬酸都可使用。
为了稳定PMT抵抗可能导致PMT失活的可能变性和其它更敏感的构象改变，向提取缓冲液中加入水活度调节剂。这种水活度调节剂是降低它们所加入的水溶液的水活性的非离子亲水化合物。优选甘油、乙二醇、和低分子量的聚乙二醇(例如“PEG400”)，但葡萄糖、蔗糖、果糖和山梨醇是作为水活度调节剂的其它有用的化合物的例子。
为了防止在组织均化过程中可能释放的蛋白水解酶引起的蛋白水解裂解对PMT的灭活，通常向提取缓冲液中加入蛋酶抑制剂。有用的蛋白酶抑制剂特别包括苯基甲基磺酰氟化物(“PMSF”)，亮抑蛋白酶肽，抑蛋白酶肽，胰凝乳蛋白酶抑制剂和胃蛋白酶抑制剂。优选PMF和亮抑蛋白酶肽。
优选向提取缓冲液中加入酚类化合物吸附剂以去掉植物酚类化合物，如果这类化合物存在，当植物细胞破裂时它们氧化后会灭活或沉淀PMT。典型地，将不溶性聚乙烯吡咯烷酮(“PVPP”)和Amberlite XAD—4悬浮于提取缓冲液中以吸附酚类化合物。去掉或灭活酚类化合物而对PMT酶活性无明显损害的其它物质也可包括或替代PVPP或Amberlite XAD—4。
加入根组织前，将提取缓冲液冷却到大约—15和—20°之间以形成冷冻悬浮液。在均化过程中，应不使匀浆温度升高到大约3到5℃之上。
正如本领域的普通技术人员所预料的，在该方法中所用的根组织量可改变，但应测量所用组织的近似重量，相应地调整所用的其它成份的量。
均化后，优选将不溶性物质(包括PVPP和所吸附的酚类)从匀浆中去掉。这一步骤优选在冷冻离心机中以大约10,000到20,000xg4℃沉淀大约30到90分钟来完成。不溶性物质沉淀后轻轻倒出可溶性提取物(即上清液)。可溶性提取物的最终蛋白浓度一般是大约2.5到3.5mg/ml。
将可溶性提取物用硫酸铵分级分离，根据标准方法(Scopes，Protein Purification Principles and Practice，PP.48—52，Springer—Verlag，New York(1982))从可溶性提取物中收集40％到60％硫酸铵分离物(沉淀物)。然后将该分离物以每g根重大约0.1到0.4ml溶解缓冲液进行溶解。
用于溶解40％到65％硫酸分离物的优选缓冲液含有有效量的缓冲剂，重金属螫合剂，还原剂，水活度调节剂和蛋白酶抑制剂，最优选的溶解缓冲液包含Tris缓冲剂(pH大约7.5)(大约10到20mM)，EDTA(大约1到10mM)，甘油(大约10到30％)，DTT(大约1到10mM)，PMSF(大约0.2到10.0mg/l)和亮抑蛋白酶肽(大约0.2到10.0mg/l)。用于上述目的的这些缓冲液成份包括提取缓冲液中的类似成份。技术人员可以预料这些成份可用功能相似的其它成份来替代。
然后可按标准方法对硫酸铵分离物脱盐，例如透析或筛分层析。脱盐部分按下面所述直接进行阴离子交换层析。然而在优选的实施例中，硫酸铵沉淀部分选进行疏水反应层析。
在对溶解的硫酸铵沉淀部分进行疏水反应层析前，加入盐使产生高盐浓度是以保证PMT结合到疏水反应介质上。优选的所加盐浓度为1.5N。优选的所加盐是NaU。另一有用的盐是硫酸铵。
优选的疏水反应介质包含携带共价结合的苯基、大小适于层析的交联琼脂糖凝胶的近似球形颗粒。这种苯基琼脂糖可作为“苯基琼脂糖(phenyl—Sepharose)CL—4B”以商品的形式买到(Pharmacia—LKB，Inc.，Piscaaway，NJ，Cat.NO.17—0819—01)。
使用标准程序将水合苯基琼脂糖填充到合适的层析柱上，用pH在大约7.2到8.3之间，优选大约7.5的高盐平衡缓冲液在大约4到8℃平衡。优选的高盐平衡缓冲液含有效量的缓冲剂，重金属螫合剂，水活度调节剂，还原剂，且盐液度在大约1.5到2.0M之间。最优选的高盐平衡缓冲液含大约10mM Tris(pH大约7.5)，大约1.5M NaU，大约1mMEDTA，大约2mMDFT，大约20％(v/v)甘油。
将盐调节的可溶性提取物样品(大约每ml苯基琼脂糖填充床体积0.5到2.0ml提取物)加样到平衡过的苯基琼脂糖柱上，用平衡缓冲液洗柱，直到洗脱物基本上无蛋白质物质。如果缓冲剂是可为紫外光所透射的，则可经测量大约280nm下的紫外光吸收率来确定。一般来说，用大约5到7倍柱体积的平衡缓冲液洗涤苯基琼脂糖柱。PMT保持与疏水反应介质结合。
仍吸附于苯基琼脂糖基质上的蛋白质(包含PMT)用大约4到6倍柱体积的洗脱缓冲液在4到8℃洗脱。洗脱缓冲液含从加样盐浓度(优选大约1.5M)到大约0.0M逐渐减少的线型盐梯度。接着用另外2到3倍柱体积的无盐洗脱缓冲液洗脱。优选的洗脱缓冲液包括Tris(大约10mM)(pH大约7.5)。DTT(大约2mM)，EDTA(大约1mM)和甘油(大约20％v/v)。
收集大约0.01到0.03柱体积的馏分并按下面所述分析PMT活性和280nm下的吸光率。典型地，汇集的洗脱馏分体积在大约1到2倍柱体积之间，且蛋白质浓度在大约0.4到2.5mg/ml之间。
应明白在前述缓冲液中除了优选的NaU外，还可用其它的盐，这些盐包括氮化钾和硫酸铵。
本发明纯化方法的关键步骤是新的阴离子交换层析步骤，按下面所述进行。然而，为进行该步骤，加到柱上的烟草植物提取物(例如，优选苯基琼脂糖洗脱物)必须具有能使提取物中的PMT结合到阴离子交换介质上的pH和化学组成。这就是说，提取物的pH应在大约7.2到8.3之间，含有大约在0.0和10mM之间的盐，优选的应进一步包含下列物质缓冲剂在大约5到15mM之间，还原剂在大约1到10mM之间，水活度调节剂在大约10到30％(v/v)之间，重金属螫合剂在大约1到5mM之间。最优选的是烟草植物提取物包含10mM Tris/HCl，pH7.5，2mM DTT，1mM EDTA和20％(v/v)甘油。
当然，技术人员可预料到烟草植物提取物的pH和盐浓度可根据上述的值而变化，产生的加样条件仍能使PMT结合到阴离子交换介质上。特别熟知的是盐浓度的增加一般会降低蛋白质与阴离子交换介质的结合，pH值的上升一般会增强蛋白质与阴离子交换介质的结合。因此，除了上面列举的那些外，技术人员很容易确定盐浓度与pH的各种组合，在这些组合下PMT能与阴离子交换介质结合。对pH/盐浓度可能的组合的唯一限制是pH不能高到使PMT变性和失活。一般来说，PMT不应在pH高于大约9的条件下放置较长时间。
从上面所述，很明显当加样到阴离子交换介质上的烟草根提取物是硫酸铵沉淀部分或上述疏水反应层析步骤的洗脱物时，必须用适当的缓冲液脱盐。这一步可用任一标准技术来完成。例如，用熟知的程序进行凝胶过滤层析(例如，使用Sephadex G—25)或透析。优选的是用透析完成脱盐。
在优选的方法中，从上述疏水反应层析步骤中汇合的洗脱物(或其它高盐烟草根提取物)用透析缓冲液以每ml汇合洗脱物或提取物大约15到25ml透析缓冲液的比例在大约4到8℃透析大约8到20小时。优选的是对透析缓冲液进行搅拌。优选的透析膜截留分子量为10,000KD。透析缓冲液的化学组成和pH的选择应使透析后馏分中的PMT能按上面所述被阴离子交换介质滞留。
阴离子交换介质应由大小适于层析，带有一个或多个功能性阴离子交换部分，相当坚硬的颗粒(例如，交联的琼脂糖)组成。这些阴离子交换部分特别可选自由二乙氨乙基，聚乙烯亚氨基，叔氨基，季氨基，对氨基苄基和二乙基—(2—羟丙基)氨乙基组成的一组。这类介质可以商品形式买到。优选带有二乙氨乙基(“DEAE”)部分的阴离子交换介质。最优选的是DEAE琼脂糖(“DEAE—Sepharose，Fast Flow”，Pharmacia—LKB，Inc，Piscataway，NJ，Cat，NO.17—0709—01)。
根据标准程序将阴离子交换介质平衡到平衡缓冲液的pH和盐条件。
根据标准程序将平衡的阴离子交换介质填充到其底具有滞留介质的装置(例如，多孔玻璃盘)和输出管的柱子(即，中空管)中。然后盖上柱子的顶端并与输入管联接。优选的是应将平衡缓冲液过柱并监测流过的pH和传导性以确保介质被适当平衡。
柱中应含有足够的阴离子交换介质以便当加样的烟草植物提取物中的蛋白质全部结合时占据不超过大约50％的介质容量。例如当加样烟草植物提取物是上述透析的苯基琼脂糖洗脱物时，柱内对每ml透析苯基琼脂糖洗脱物应含大约0.04到0.10ml(填充床体积)DEAE—琼脂糖。
优选的是柱子的填充和介质的平衡在与烟草植物提取物的加样温度相同的温度下进行。如果洗涤或洗脱柱的温度高于烟草植物提取物的加样温度，那么在填充柱前，含阴离子交换基质的悬浮液可能会放气。
按上面对加样到阴离子交换介质的烟草植物提取物所述，阴离子交换介质平衡缓冲液的pH和化学组成必须使PMT能被介质滞留。同样地，技术人员可很容易地确定适当的pH/化合组成的组合。优选的平衡缓冲液基本上不加盐，其pH在大约7.2到8.3之间.最优选7.5。更优选的平衡缓冲液含有效量的缓冲剂，重金属螫合剂，还原剂，和水活度调节剂。最优选的平衡缓冲液含10mMTris/HCl(pH7.5)，1mMEDTA，2mMDTT，和20％(v/v)甘油。
在柱子的平衡，加样和洗涤前和其过程中，烟草植物提取物，平衡缓冲液和阴离子交换介质的温度都优选在大约2到10℃之间，最优选的是在大约4到8℃之间。
用于烟草植物提取物的流速在大约0.1到0.3柱体积/分钟之间。从烟草植物提取物柱上流出的实际上不含PMT的溶液被弃去。然后用平衡缓冲液洗柱直到洗脱的蛋白质物质稳定在低水平。如果平衡缓冲液不含吸收280nm光的缓冲剂，用洗脱缓冲液洗柱直到280nm的UV吸光率稳定在低水平。典型地，用5到12柱体积的含10mM NaCl的平衡缓冲液洗涤阴离子交换介质，然后再用3到10柱体积的不含NaCl的平衡缓冲液洗涤。在洗涤步骤过程中PMT被阴离子交换介质滞留。
洗涤后，用含有效量多胺的洗脱缓冲液从阴离子交换介质中洗脱PMT，其中洗脱温度，洗脱缓冲液的pH和化学组成应除了多胺外，能使PMT被阴离子交换介质滞留。
洗脱缓冲液中的多胺选自由腐胺，N—甲基腐胺，精胺，亚精胺，胍基丁胺，尸胺和其混合物组成的一组。腐胺是优选的多胺，存在于洗脱缓冲液中的多胺浓度应在大约0.5到50mM之间，优选1到10mM，最优选大约5mM。
洗脱缓冲优选进一步包含有效量的缓冲剂，重金属螫合剂，还原剂，水活度调节剂。这些成份与上面所述的提取缓冲液中的一样。这些成份的有效量不需过多的实验就能被技术人员确定。洗脱缓冲液的pH应在大约7.2和8.3之间，优选大约7.5。当阴离子交换介质平衡缓冲液中加入多胺后是一种合适的洗脱缓冲液。优选的洗脱缓冲液含10mM Tris/HCl(pH7.5)，1mM EDTA，20％(体积)甘油，2mM DTT，和5mM腐胺(1，4—丁二胺)(Sigma ChemicalCO，st.Louis，MO，Cat，NO.P7505)。
从阴离子交换柱中洗脱PMT优选在大约18到26℃之间(即，室温)进行。洗脱开始前，洗脱缓冲液和阴离子交换柱应处于所选定的洗脱温度。
为了从柱上洗脱PMT，所用的洗脱缓冲液流速应在大约0.02到0.10柱体积/分之间并从柱底部收集馏分。洗脱物也可以收集到单个洗脱池中。在最优选的洗脱方法中，将大约1柱体积的洗脱缓冲液加到柱上，然后停止流动。使阴离子交换介质与洗脱缓冲液等份保持接触时间在大约1到6小时之间，优选大约1小时，然后重新开始使用洗脱缓冲液。
非常缓慢地从阴离子交换介质中洗脱PMT。典型地，用大约40到70柱体积的洗脱缓冲液洗脱阴离子交换介质，最优选的用至少50柱体积的洗脱缓冲液。按下面所述分析洗脱馏分的PMT活性以监测PMT的洗脱。
当以相当稀释的形式和相当大的体积回收PMT时，必须浓缩阴离子交换洗脱物。例如，可将洗脱物加到在阴离子交换介质洗脱缓冲液存在条件下对PMT具有亲合力的任一层析介质上，并能从中以相当浓缩的形式和良好的收率洗脱结合的物质。作为选择，可沉淀PMT。在本发明优选的方法中，在洗脱过程中阴离子交换柱的出口与浓缩柱的入口相连。以这种方式，从阴离子交换柱流出的洗脱的PMT直接流到浓缩柱中并吸附于其中。阴离子交换柱的PMT洗脱完成后，从浓缩柱上取下阴离子交换柱的出口并从浓缩柱中洗脱PMT。
优选的浓缩柱使用W—氨基已基琼脂糖(“W—氨基已基琼脂糖4B”，Sigma Chemical CO，st.Louis，MO，Cat，NO.A8894)(“AHS”)，床体积为阴离子交换柱的10到30％。用含相当高浓度的盐，优选1.5M NaCl的洗脱缓冲液从该柱洗脱PMT。优选的是洗脱缓冲液进一步包含的效量的缓冲剂，重金属螫合剂，还原剂，水活度调节剂。最优选的洗脱缓冲液包含1.5M NaCl，10mMTris/HCl(pH7.5)，1mMEDTA，20％(v/v)甘油，和2mM DTT。浓缩柱优选在4—8℃加样和洗脱。
开始4到8柱体积的浓缩柱洗脱物含主要PMT活性。将这一馏分进一步浓缩，优选在超滤装置(如“Centricon 30”，从Amicon Cop，Danvers，MA可得到)中。超滤后，样品典型的蛋白质浓度在大约0.04和0.70mg/ml之间。典型地从几个这类浓缩柱中汇集合PMT的馏分并进一步浓缩。
经过阴离子交换和样品浓缩步骤后得到的PMT以制备型等电聚焦进一步纯化。等电聚焦包括将样品混合物加入一个稳定的pH梯度中，在其两端旋加一定的电压。每种蛋白质向pH梯度中使该种类蛋白质净电荷为零处电泳迁移。使蛋白质净电荷为零的pH称为该蛋白质等电点。
可以使用各种各样的pH梯度平衡介质，特别包括蔗糖溶液和聚丙烯酰凝胶。同样地等电聚焦后可使用各种各样的分级分离pH梯度的方法来回收蛋白质。pH梯度分级分离方法的选择应与梯度平衡介质相一致。
优选的pH梯度平衡介质是装于玻璃管中的的蔗糖溶液(密度梯度)。最优选的蔗糖密度梯度包含的pH梯度范围从大约pH5到大约pH6。优选的梯度分级分离方法是通过一个活塞精确地控制液体流动。试验收集的馏分的pH和PMT活性。用于等电聚焦的装置，化学物质和方案可从一些商品途径获得。
以本发明方法分离的PMT基本上不含其它烟草蛋白质，其中PMT是制品中的优势蛋质。制品中少量污染的烟草蛋白质可根据标准技术以十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(“SDS—PAGE”)从PMT中分离。以这种方式获得用于氨基酸序列分析的足够纯的PMT。PMT的鉴定烟草PMT的特征是以SDS—PAGE测定其分子量在大约55和65千道尔顿之间，以等电聚焦测量基天然等电点在大约pH5.0和6.0之间。
烟草PMT进一步的特征为具有将S—腺苷甲硫氨酸的甲基转移到腐胺δ—氨基上的催化能力和对腐胺具有高度底物专一性。
Michaelic—Menten常数(Km)定义为起始反应速度等于最大反应速度的一半时的底物浓度。Km值变化幅度较大，即使对催化相同反应的不同酶种类。因此Km的测量是酶有用的“鉴定标记”。部分纯化的烟草PMT特征为对腐胺的Km在大约300和500μM之间。本发明高度纯化的烟草PMT特征为对S—腺苷甲硫氨酸的Km在大约100和150μm之间。PMT部分氨基酸序列的测定在用于氨基酸序列分析的制品中，使用SDS—PAGE标准技术从阴离子交换，样品浓缩和等电聚焦步骤后仍滞留的少量污染蛋白质中分离PMT。SDS—PAGE的详细操作方案见文献(Laemmli，“Cleavage of Structural Proteins During theAssembly of the head of Bacteriophage T4”，Nature，227，PP.680—85(1970)和电泳装置厂家提供的操作手册。以熟知技术，将含单个蛋白质的带电泳(电印迹)转移到薄片或膜上，并在其上滞留和观察。在一个熟知的方法中，蛋白质带被电印迹到覆盖有疏水多聚阳离子(如多聚(4—乙烯基—N—甲基吡啶鎓)碘化物)的玻璃微纤维片上并以非阴离子试剂(如荧光胺)观察。另一方法包括将蛋白质电印迹到聚偏二氟乙烯膜(“Immobilon—P，”Miuipore，Bedford，MA)上并以阴离子染料(如酰胺黑)观察带(Bauw et al，“Alterations in the Phenotype of plant Cells Studiedby NH2--Terminal Amino Acid Sequence Analysis of ProteinsEleetroblotted From Two Dimensional Gel—Separated TotalExtracts”，Proc.Natl.Acad.Sci.USA84，PP.4806—10(1987)；A Practical Guide to Protein and Peptide Purification forMicrosequencing，Paul T.Matsudaira(ed)，Academic Press，New YorK，(1989)。
优选上述从电泳凝胶转移分离的蛋白质和观察转移蛋白质的技术。然而本领域的技术人员可以预料到本发明不排除为进行序列分析制备电泳分离的蛋白质所用的材料和方法的改变。
由纯化PMT组成的带以表现分子量(即，大约60KD)来鉴定。将蛋白质带从电泳凝胶转移到膜上并观察转移带后，精确地切下带有纯化PMT单一带的膜片以避免被任何相邻蛋白质带的污染。
由纯化烟草PMT构成的蛋白质带(按上述分离)以标准自动方法进行氨基末端序列分析。烟草PMT蛋白质包含选自SEQ IDNO1，SEQ ID NO2，和SEQ ID NO3的氨基酸序列。
SEQ ID NO1来自“a1”带(图5)。SEQ ID NO2来自“a2”带(图5)，SEQ ID NO3是SEQ ID NO1和SEQ ID NO2共有序列。
来自紧密相邻的纯化蛋白质带的序列具有高度同源性表明烟草PMT蛋白质存在多种形式。烟草PMT蛋白质的多种形式可能来自于单个基因产物的翻译后修饰或来自于PMT基因多种形式。PMT DNA序列的克隆本发明PMT蛋白质的部分氨基酸序列(SEQ ID NO1，SEQID NO2，SEQ ID NO3)用于设计一套寡核苷酸，其中的一个或多个与烟草根cDNA文库中的PMT序列选择地杂交。该选择性杂交用于鉴定含编码部分或全部PMT蛋白质的序列的cDNA克隆。从氨基酸序列设计寡核苷酸探针的描述见Sambrook等的分子克隆—实验手册第11章(Cold Spring Harbor Press(1989))。
这类寡核苷酸探针的合成通常用可以商品形式买到的自动装置来完成。
cDNA文库的构建现在是分子生物学实验室的常规工作。通常见Sambrook等(出处同上)第8章。同样地，用寡核苷酸探针筛选cDNA文库以鉴定含感兴趣的序列的克隆对本领域的技术人员而言是平常的并完全是力所能及的。对筛选cDNA文库的寡核苷酸的使用的描述见Aambrook等(出处同上)的实验手册第11章。根据寡核苷酸探针杂交选择的cDNA克隆，对其大小，限制性位点的存在和核苷酸序列进行鉴定。这些DNA分析方法在文献中已充分描述(特别是Sambrook et al，出处同上，和Ausubel etal，Short Protocols in Molecular Biology，Green PublishingAssociates and Wiley Intergcience，New York(1989))。以这种方式获得的任一PMT cDNA克隆。本身可用作探针来鉴定其它的PMT cDNA克隆。
烟草(Nicotiana tabacum L.Var，NK326)基因组文库可以商品的形式买到(clonetch Laboratories，Inc，Palo Alto，CA)。根据卖主提供的方法筛选这种基因组文库以获得编码烟草PMT的染色体基因。
除了前面提到的方法，本领域的技术人员可使用有利的聚合酶链反应(“PCR”)方法获得所需的PMT cDNA克隆。PCR的基本原理是迅速扩增位于两个已知序列区之间的DNA片段。已发展了各种各样的PCR技术用于检测，分析和构建特定的DNA分子。PCR技术的大量应用的装置，化学物质和方法可从商业途径获得。对PCR方法的一般讨论见Sambrook等(出处同上)第14章。
实施本发明优选的PCR方法称为RNA PCR。RNA PCR有2个基本步骤(1)在反向引物存在的条件下使用RNA作模板反转录酶合成第一cDNA链，(2)Taq聚合酶合成互补的cDNA链，接着在正向和反向两种引物存在的条件下用Taq聚合酶扩增两条链。
应用RNA PCR方法使用烟草根poly(A+)RNA作模板并使用根据已知PMT部分氨基酸序列的寡核苷酸作引物可获得PMTcDNA分子。
因此，本发明提供编码烟草PMT蛋白质的重组DNA分子。用PMT DNA序列以有意义或反义取向稳定转化的转基因烟草细胞和植物的生产本发明还提供了用与调节序列以可操作的形式连接的，编码烟草PMT蛋白质和编码PMT反义RNA分子的重组DNA分子稳定转化的转基困烟草细胞和植物。
为了生产比未转化的对照烟草植物具有较低烟碱含量的烟草植物，用制备的PMT反义转录单位转化烟草细胞，该反义转录单位包含部分PMT cDNA序列，全长PMT DDNA序列，部分PMT染色体序列，或全长PMT染色体序列，将它以反义取向用合适的可操作连接的调节序列克隆。适当的调节序列包括转录起始序列(“启动子”)和多聚腺苷化/转录终止序列。
反义序列在转基因烟草植物中的表达典型地使用花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子。(例如见Cornelissen et al，“BothRNA Level and Translation Efficiency are Reduced by Anti—sense RNA in Transgenic Tobacco”，Nucleic Acids Res.17.PP.833—43(1989)；Rezaian et al，“Anti—Sense RNAs of CucumberMosaic Virus in Transgenic Piants Assesed for conter of theVirus”，Plaut Molecular Biology 11，PP.463—71(1988)；Rodermel et al，“Nuclear—organelle InteractionsNuclearAntisense Gene Inhibits Ribulose Bisphosphate CarboxylaseEnzyme Levels in Transformed Tobacco Plants”，Cell55，PP673—81(1988)；Smith et al，“Antisense RNA Inhibition ofPolygalacturonase Gene Expression in Transgenic Tomatoes”，Nature344，PP.724—26(1988)；Van der Krol et al，“An Anti—Sense Chalcone Synthase Gene in Transgenic Plants InhibitsFlower Pigmentation”，Nature333，PP.866—69(1988))。在本发明转化的烟草细胞和植物中PMT的表达优选使用CaMV35S启动子。在烟草根内其它重组基困的表达中使用CaMV启动子已被充分描述(Lam et al，“Site—Specific Mutations Alter In VitroFactor Binding ang change Promoter Expression Pattern inTransgenic Plants”，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86.PP.7890—94(1989)；Poulsen et al，“Dissection of 5′Upstream Sequencesfor Selective Expression of the Nicotiana Plumbaginifolia rbcS—8B Gene”，Mol.gen.Genet.214，PP.16—23(1988))。
尽管优选使用CaMV35S启动子，应预料到其它的启动子也可成功地用于烟草植物外源基因表达，且除CaMV35S启动子外的其它启动子的使用也落在本发明的范围内。
已知各种各样的转录终止序列。转录终止序列的来源和鉴定是其利用的先决条件。例如，胭脂氨酸合成酶(“NOS”)，章鱼碱合成酶(“OCS”)和CaMV多聚腺苷化/转录终止序列用于转基因烟草植物外源基因的表达并对PMT序列的表达有用。(例如，见Rezian et al，出处同上，和Rodermel et al，出处同上)。
然后应用标准技术(例如限制性图谱，Southern印迹杂交和核苷酸序列分析)鉴定携带以反义取向与可操作的调节序列(即，启动子和多聚腺苷化/转录终止序列)相连的PMT序列的克隆。
有相当发达的技术用于将外源性DNA导入烟草细胞基因组以生产被外源性DNA稳定转化的转基因烟草细胞。可用大量已知的烟草细胞转化方法中的任何一种来实施本发明。通常烟草细胞转化方法的分类根据其是否使用土壤杆菌(Agrobacteriun)系统的成份。
根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefasciens)是含有称为“FDNA”(用于转移的DNA)核昔酸序列之质粒的革兰氏阴性细菌，T—DNA能有效地转移并整合到天然双子叶植物(包括烟草)的染色体中，引起感染的植物肿瘤生长。这种天然存在的用于将外源DNA整合到植物染色体的载体系统已被广泛地研究、修饰并在植物遗传工程中利用。(Deblaere et al，“Efficient Octopine TiPlasmid—Derived VeCtors for Agrobacteriun—Mediated GeneTransfer to Plants”，Nucleic Acids Research13，PP.4777—88(1985)。用常规方法将含PMT DNA序列并以有意义或反义取向与可操作的调节序列相连的裸露的重组DNA分子连接到合适的T—DNA序列上。用聚乙二醇技术或电穿孔技术(两者都是标准技术)将它们导入烟草原生质体中。作为选择，将这种包含编码PMT的重组DNA分子的载体导入活的土壤杆菌细胞，然后将DNA转移到烟草植物细胞中(Rogers et al，“Gene Transfer in PlantsProduction of Transformed Plants Using Ti Plasmid Vectors”，Methods in Enzymology118，PP.627—40(1986))。
尽管土壤杆菌技术在本领域中广泛使用，但它并非本发明的必须内容。可经过将烟草原生质体与含DNA的脂质体融合或经电穿孔来完成以不含T—DNA载体序列的裸露DNA进行转化。(Shillito et al，“Direct Gene Transfer to Protoplasts ofDicotyledonous and Monocotyledonus Plants by a Number ofMethods，Including Electroporation”，Methods in Enzymology153，PP.313—36(1987))。不含T—DNA载体序列的裸露DNA也可经过惰性高速显微投影用于转化烟草细胞(BIOLISTICTMParticle Delivery System，Du Pont，Wilmington，DE)。
用于生产本发明的转化的烟草细胞和植物的PMT重组DNA分子和载体优选进一步包含一个显性选择性标记基因。适用于烟草的显性选择性标记特别包括编码新霉素磷酸转移酶，潮霉素磷酸转移酶和氯霉素乙酰基转移酶的抗生素抗性基因。另一适用于烟草的熟知的显性选择性标记是编码氨甲喋抗性二氢叶酸还原酶的突变的二氢叶酸还原酶基因(Deblaere et al，出处同上)。含合适的抗生素性基因的DNA载体和相应的抗生素可以商品形式买到。
经过将混合的细胞群落放入含有适当浓度的所选定的显性选择性标记基因产物对其提供抗性的抗生素(或正常情况下对烟草细胞有毒的其它化合物)之培养基中，从周围未转化的细胞群落中选出转化的烟草细胞。因此，只有那些被转化的烟草细胞能存活和繁殖。
通过应用本领域熟知的烟草细胞和组织培养技术诱导转化的细胞再生完整的，可结实的烟草植物。植物再生方法的选择应与转化方法相适应。用按人工杂交所得后代的DNA分析标准方法所揭示的PMT序列的孟德尔遗传来证实推断的转基因烟草植物基因组中PMT序列的稳定存在和取向。
从转化的细胞再生出转基因烟草植物后，通过常规植物育种方法且不需过多的实验就能很容易地将导入的PMT序列转移到其它烟草变种中。
经标准烟碱试验检测PMT反义转基因烟草植物中烟碱水平的减少。
熟悉上述重组DNA方法的人员将认识到可使用全长PMTcDNA分子或全长PMT染色体基因以有意义取向与合适的可操作连接的调节序列相连来构建转基因烟草细胞和植物。(本领域的技术人员还将认识到用于有意义取向的基因表达的合适的调节序列包括任一已知的真核翻译起始序列，还包括上述启动子和多聚腺苷化/转录终止序列)。这种转化的烟草植物特征为PMT蛋白质水平升高，因而其烟碱含量比未转化的对照烟草植物含量更高。
因此应明白使用PMT DNA序列降低或升高PMT蛋白质水平并以此降低或升高烟草植物烟碱含量都落入本发明的范围之内。
为了更好地理解本发明，提供了下述实施例。这些实施例仅用于解释本发明而不能以任何理由当作是对本发明范围的限制。
实施例缓冲液组成缓冲液A50mM Tris/HCl，pH7.55mM EDTA(游离酸)20％(v/v)甘油2mM DTT0.5(w/v)抗坏血酸钠2％(w/v)PEG4000.4mg/l PMSF(取自1mg/ml贮液)0.4mg/l亮抑蛋白酶肽(取自1mg/ml贮液)100g/l PVPP40g/l Amberlite XAD—4缓冲液B10mM Tris/HCl，pH7.51mMEDTA(游离酸)20％(v/v)甘油，2mM DTT0.4mg/l PMSF(取自1mg/ml贮液)0.4mg/l亮抑蛋白酶肽(取自1mg/ml贮液)缓冲液C10mM Tris/HCl，pH7.5
1mM EDTA(游离酸)20％(v/v)甘油2mM DTT蛋白酶抑制剂贮液将PMSF(1mg/ml)溶于二甲基甲酰胺中并以2.1ml的等份试样贮存于-20℃备用。
将亮抑蛋白酶肽(1mg/ml)溶于蒸馏水并以2.1ml的等份试样贮存于-20℃备用。粗提物的制备从水栽法生长的烟草(Nicotiana tabacum L.Var.Burleg21)植物去顶3天后收集大约1kg根。用冷水洗涤收获的根并放在Buchner漏斗上，吸出其中的水。洗涤后的根冷冻贮存于-80℃。将冷冻的根加入2.5l冻成冷冻悬浮液并装在1加仑韦林氏搅切器的缓冲液A中。用大药匙将根混合入缓冲悬浮液中，搅切器开始在低速档，接着以培养基速度档进一步匀浆。小心操作，避免匀浆温度上升到超过3—5℃。
将提取物分装到离心瓶中，以13,680xg 4℃离心70分钟沉淀不溶碎片。
倒出上清液，其体积为2.37l。向提取物中加入大约0.77gDTT。硫酸铵分级分离以每100ml提取物22.6g的量向提取物中缓慢加入结晶硫酸铵，使提取物达到含40％硫酸铵的饱和状态。4℃下搅拌含硫酸铵的提取物2小时。
在4℃下以27,500Xg离心30分钟除去40％硫酸铵沉淀。每升提取物中再加入0.33g DTT。以每100ml提取物15.3g的量向提取物中缓慢加入结晶硫酸铵，使硫酸铵浓度从40％增加到65％的饱和状态。含65％硫酸铵的提取物在4℃下搅拌过夜。在4℃以27，500xg离心70分钟沉淀40—65％硫酸铵沉淀部分并弃去上清液。
将40—65％硫酸铵沉淀溶于缓冲液B中使总体积为200ml，然后加入17.53g NaCl并在冰溶中搅拌使溶解。含NaCl的溶解的40—65％沉淀部分在4℃下以47，800Xg离心30分钟并弃去沉淀。
基本上按上面所述进行粗提物的制备和硫酸铵的分级分离3次，并将4次所得的40—65％硫酸铵沉淀部分(每次200ml)合并。该800ml合并液来自总共5.239kg的根组织。疏水反应色谱用含1.5M NaCl的缓冲液C平衡苯基—琼脂糖CL 4B(Pharmacia Inc，Piscataway，N，J，Cat.No.17—0810—01)疏水反应柱(5cm×20cm)。然后将来自5.239kg根组织的，40—65％澄清的硫酸铵分离物合并的800ml溶液加样到平衡的苯基琼脂糖柱上。用加有1.5M NaCl的缓冲液C洗柱直到获得280nm吸光率的稳定基线，声明所有未结合的蛋白质实际上已被全部洗掉。然后用2l在缓冲液C中NaCl从1.5M到0.0M递减的线性梯度溶液洗脱PMT。再用1l缓冲液C进一步洗柱。每个馏分收集12ml，按下面所述依次分析馏分(在PMT活性峰上和周围的每第三个馏分，在梯度的其它部分的每第10个馏分)的PMT活性。在4℃下以4.7ml/分的流速进行疏水反应色谱。
合并从#86至#116含PMT活性的苯基琼脂糖馏分，合并液在9l缓冲液C中持续搅拌透析大约18小时。透析样品分成各为100ml的4个等份试样并贮存于-80℃。PMT活性分析每个反应管含下列成份12.5μmol Tris/HCl pH8.30.25μmol EDTA1.25μmol 2—疏基乙醇0.9μmol腐胺0.15μmol未标记的S—腺苷甲硫氨酸0.18μmol〔14C—甲基〕S—腺苷甲硫氨酸(57nci/nmol)酶样品总体积＝0.25ml加入酶样品开始反应，30℃下反应进行30分钟。经加入用NaCl饱和的10％(w/v)NaOH 0.5ml终止反应。
经溶剂提取到氯仿中从底物分离出放射性产物N—〔14C—甲基〕腐胺。将终止的反应混合物与1ml氯仿混合转动90秒后，以1600Xgav离心5分钟分离有机相和水相。然后分析有机相的0.5ml等份试样。将0.5ml有机相的等份试样加入9.5ml液丙混合物(Beckman Instrument，Columbia，MD)中，用液闪计数器按标准程序测量放射性。
1单位的PMT活性定义为30℃下每30分钟形成1毫微摩尔的产物。
所有的PMT试验都包括阴性对照。阴性对照由无酶的反应混合物组成，或在零时以NaOH终止反应。阴离子交换色谱2个100ml苯基—琼脂糖纯化样品的等份试样解冻后，在4℃以1.5ml/分的流速加样到用缓冲液C在4℃下平衡的DEAE—琼脂糖“Fast Flow”(Pharmacia—LKB，Piscataway，NJ，Cat.No.17—0709—01，Lot No.OB—05854)柱(1cm×14.5cm)上。
然后，用70ml含10mM NaCl的缓冲液C以1.5/分的流速洗涤DEAE—琼脂糖柱，直到获得稳定的280nm基线。然后用50ml不含NaCl的缓冲液C重新平衡柱。将柱温度升高到室温(24℃)，用含5mM腐胺(Sigma Chemical Co，St，Louis，MO，Cat.No.P7505，Lot No.39F0039)的缓冲液C补充柱的空体积。柱在24℃下不流动保持大约1小时，然后在24℃下用632ml含5mM腐胺的缓冲液C以0.7ml/分的流速洗脱PMT(15小时)。经吸附浓缩PMT从DEAE—琼脂糖柱上洗脱的PMT直接收集到维持在4℃的W—氨基已基琼脂糖4B(“AHS”)(Sigma Chemical Co，st.Louis，MO，Cat.No.A8894)柱(1cm×3cm)上。用含1.5M NaCl的缓冲液C以1.6ml/分的流速从AHS柱上洗脱PMT。收集各为12—15ml的4个馏分并按上面所述分析PMT活性。第一个馏分(14.7ml)含有超过80％的从AHS浓缩柱中回收的总PMT活性。超滤为了进一步浓缩，将13.7ml的第一AHS馏分分成6个等分并放入“Centricon 30”(Amicon，Danvers，MA)超滤装置中浓缩大约25倍。合并来自6个该装置的浓缩物，用不加盐的缓冲液C稀释大约80倍并在单个“Centricon 30”中进行第二轮超滤，直到总体积为大约150μl。将150μl浓缩物贮存于-80℃。制备性等电聚焦通过DEAE/AHS阶段(包括超滤浓缩)纯化的PMT进一步用等电聚焦纯化。用能以商品形式买到的两性电解质(Pharmacia—LKB，Piscataway，NJ)在蔗糖密度梯度(1.6cm×21cm)中进行制备型等电聚焦。根据两性电解质卖主的说明书制备pH梯度，pH跨度范围从大约5.3到大约6.3。使用从1000到4000优特(功率在1和4瓦特之间)的电压进行聚焦大约3小时。聚焦后收集各为1ml的馏分，测定各馏分的pH和PMT活性。在4℃下进行聚焦和馏分收集。
图4是等电聚焦后，相对PMT活性和pH对馏分号(即，在蔗糖密度梯度中的位置)的二元标绘图。描绘于图4中的实验数据表明烟草PMT的等电点大约为5.7。在其它等电聚焦实验中，烟草PMT的pI表现为低达5.0和高达5.8。本领域的技术人员将认识到在实施过程中有许多因素影响表观pI，因此pI的测量一般出现一些变化。PMT相对纯度的测定经过测量比活性来测定在纯化程序的连续步骤中PMT的相对纯度(表1)。表1所示的纯化(倍)值低估了从烟草根粗提物的实际纯化程度，因为在活性产率计算时将40—65％硫酸铵分离物当作100％。
表1
*从4个分离的粗提物合并的40—6％硫酸铵分离物**仅代表一半的来自苯基琼脂糖柱的物质。
以SDS—PAGE标准程序还测定了本方法连续的步骤中PMT的相对纯度。图1显示了在PMT纯化方法各步骤的样品表现出的(经银染后)SDS—PAGE蛋白质带型。凝胶中的样品如下泳道1和6，分子量标准蛋白质(在上面附图简要描述中已列出)；泳道2，40—65％硫酸铵分离物；泳道3，来自苯基—琼脂糖柱PMT活性峰的馏分；泳道4，DEAE/AHS步骤的浓缩物；泳道5，DEAE/AHS步骤浓缩物经等电聚焦后的PMT活性峰馏分。应该注意在DEAE/AHS纯化物(泳道4)中占优势的PMT带(箭头所示)在前面的疏水反应步骤(泳道3)的物质中几乎看不见。烟草PMT分子量将通过硫酸铵、苯基琼脂糖，DEAE/AHS/超滤纯化阶段的PMT物质加样到非变性电泳凝胶上分离PMT，用包含这一程序的实验测量烟草PMT的表观分子量。非变性的堆积凝胶缓冲液含有0.27M Tris/HCl(pH6.8)，10％(v/v)甘油和20mM 2—巯基乙醇。非变性的12.5％聚丙烯酰胺分辨凝胶缓冲液含0.38M Tris/HCl(pH8.8)，10％(v/v)甘油，和12mM，2—巯基乙醇。
从非变性凝胶上切下单个泳道，沿其长度切成二半，然后切成3mm切片。将每个凝胶切片的一半直接放入标准PMT试验混合物中，每个凝胶切片相应的另一半进行SDS—PAGE。
表现出最高PMT活性的非变性凝胶切片(图2)基本上含单一蛋白质，其表观分子量大约为60KD(图3)。PMT的酶促活性用本发明高度纯化的烟草PMT进行底物特异性试验。比较了1，3—二氨基丙烷和1.5—二氨基戊烷(腐胺的化学类似物)，磷脂酰乙醇胺(甲基受体)，N—甲基腐胺(PMT的正常产物)与腐胺(1，4—二氨基丁烷)作为PMT底物的能力。在标准PMT试验(如上面所述)中，当用1，3—二氨基丙烷，1.5—二氨基戊烷和磷脂酰乙醇胺代替腐胺时，未形成可检测量的放射性产物。在PMT试验中，当用N—甲基腐胺代替腐胺时，形成的放射性产物不超过在用腐胺的试验中所观察到的产物的6％。
当一种底物为不同的速度限制浓度而另一种底物过量时测量PMT活性(如上所述)来测定2种PMT底物(腐胺和S—腺苷甲硫氨酸)的表观Km值。部分纯化的烟草PMT对腐胺的Km大约为400gM。高度纯化的烟草PMT对S—腺苷甲硫酸的Km大约为125μM。部分纯化的烟草PMT对腐胺的Km值和高度纯化的烟草PMT对S—腺苷甲硫酸的Km值与公开的PMT值(Mizusaki etal，出处同上；Feth et al，“Detrmination of Putrescine N—methyltransferase By High Performance LiquidChromatography”，Phytochemistry，24，PP，921—23(1985)紧密吻合。氨基末端氨基酸序列分析用于序列分析的烟草PMT是将进行过硫酸铵分级分离，苯基—琼脂糖色谱，以腐胺洗脱的DEAE—琼脂糖色谱(接着经AHS和超滤浓缩)和自由流动的等电聚焦纯化步骤后所得的物质经SDS—PAGE分离得到的。经过对高度纯化的PMT进行SDS—PAGE后，蛋白质带电印迹到聚偏二氟乙烯膜(“Immobilon—P”，Miuipore，Bedford，MA)上并以标准程序用酰胺黑观察。“a1”带(见图5)是高度纯化的制品中仅有的表现出烟草PMT分子量特征(见图3)的2条带中的一条，将带有“a1”带的膜片切下来以便与相邻的“a2”带分离。将所分离的PMT根据厂商建议的程序在带有线上120A分析仪的应用生物系统477A型(脉冲液相测序仪)上进行氨基末端氨基酸序列分析。
烟草PMT“a1”带的氨基末端前17个氨基酸的序列是(SEQID NO1)Leu Ser Xaa Asn Phe Leu Phe Gly Thr Ala Ser SerXaa Tyr Gln Tyr Glu。
“a2”带(见图5)是仅有的表现出烟草PMT分子量(见图3)的两条带中的第二条。当制备“a2”带(图5)并以与“a1”带相同的方式分析时，“a2”带产生下列部分氨基酸序列(SEQ ID NO2)LeuSer Ser Asn Phe Leu Pne Gly Thr Ala Pro Tyr Tyr Gln Tyr Glu。60KD PMT蛋白质氨基末端序列的确定制备更大量的60KD烟草PMT蛋白质以进行进一步的氨基末端氨基酸序列分析。根据这种进一步的分析，发现“a1”带前29个氨基酸的序列是(AEQ ID NO4)Leu Ser Ser Asn Phe LeuPhe Gly Thr Ala Ser Ser Tyr Tyr Gln Tyr Glu Gly Ala Phe LeuSer Asp Gly Val Gly Leu Ser Asn。CNBr片段的部分氨基酸序列为了获得部分的(相对于氨基末端)PMT氨基酸序列，我们按上面所述分离了烟草PMT电泳带并对纯化的PMT进行溴化氰(“CNBr”)裂解(CNBr在甲硫氨酸残基处特异性地裂解多肽)。我们用SDS—PAGE分析了CNBr反应产物，发现CNBr片段的表观分子量大约为15，6.2和3KD。我们从聚丙烯酰胺凝胶上切下含CNBr片段的电泳带，从带上电印迹蛋白质并对片段进行氨基酸序列分析(如上所述)。
发现PMT 15KD CNBr片段的前13个氨基酸序列是(SEQID NO5)Phe Ile Thr Glu Asn Gly Phe Ala Gly Arg Ser GlyArg。
发现PMT 6.2KD CNBr片段的前15个氨基酸序列是(SEQID NO6)Asn Glu Pro Xaa Phe Val Ala Ile Ser Gly Tyr ArgAsp Xaa Thr。
发现PMT 3KD CNBr片段的前20个氨基酸序列是(SEQ IDNO7)Ala Asp Ile Glu His Tyr Ser Lys Leu Ile Asp Ala LeuXaa Ile Lys Gly Ile Gln Phe。PMT cDNA克隆的分离和鉴定用常规RNA PCR程序分离PMT cDNA克隆。RNA PCR程序中的模板是从烟草根分离的Poly(A+)RNA。poly(A+)RNA制备的起始材料由水载法生长的烟草植物(N.tabacum，Var.Burly21)根组成。制备poly(A+)RNA的第一步是制备总RNA。使用制备总RNA商品试剂盒(Stratagene，La Jolla，CA，Cat.NO.200345)的试剂和说明书进行烟草根总RNA的分离。使用制备poly(A+)RNA商品试剂盒(Pharma Cia LKB，Piscataway，NJ，Cat，No.27—9258—01)分离Poly(A+)RNA。首先根据标准原理，使用从纯化PMT蛋白质获得的部分氨基酸序列资料设计寡聚核昔酸PCR引物。在随后的实验中，从在先分离的cDNA克隆序列设计引物。PCR程序用商品试剂盒(“GeneAmp RNA PCR Kit”，Perkin ElmerCetus，Norwalk，CT)进行RNA PCR程序。程序基本上根据PCR试剂盒卖主的建议。对卖主的方案进行如下修改逆转录酶反应(1)反向引物浓度为2.5μm；(2)poly(A+)RNA的量是每份逆转录酶反应液大约1μg。
(3)热循环程序包括42℃60分钟99℃10分钟；4℃10分钟，1个循环与4℃热处理步骤相联；聚合酶链反应(1)引物浓度各为2.5μM；(2)经过98℃cDNA变性步骤后，最后向反应液中加入Taq聚合酶；(3)热循环程序包括的循环步骤98℃1分钟60℃10分钟1次循环连接94℃1分钟，50℃2分钟，72℃3分钟30次循环连接循环步骤72℃10分钟连接热处理步骤4℃。
经过标准氯仿提取步骤后，20％(体积)的每个PCR样品加样到2％琼脂糖凝胶上，电泳分析PCR产物。克隆程序选作进一步分析的PCR产物克隆到商品载体pBluescript II(SK+)(stratagene)上。用Klenow酶处理PCR产物的一个等份试样以产生平头DNA。Klenow反应混合物如下大约1μg PCR产生的DNA，四种脱氧核苷酸三磷酸终浓度各为80μM，2.5μl10x通用缓冲液(Stratagene)，5单位的Klenow酶(Stratagene)，加水至总体积为25μl。Klenow反应在室温进行30分钟，经75℃加热灭活10分钟终止反应。
然后将PCR产生的DNA片段与用限制性酶SmaI消化的pBluescriptII(SK+)相连。连接反应混合物如下大约1μg的平头DNA，大约0.2μg的SmaI消化的pBluescriptII，3μl10x连接缓冲液(Stratagene)，12单位的T4DNA连接酶，加水至总体积为30μl。在4℃连接酶反应过夜，75℃加热灭活10分钟终止反应。
在每次连接反应后，进行下一步细菌转化程序。商品感受态E.coli细胞(“XL1—Blu”细胞，Stratagene)悬液在冰上冷冻。向也经过上冷冻的DNA样品(按上述连接过的)中加入大约30μl悬液。在连接DNA存在的条件下，将感受态细胞在冰上放置30分钟。然后使用42℃水浴在DNA存在条件下使细胞热休克2分钟。热休克后，细胞和DNA放回冰浴中处理5分钟，加入1ml LB培养基后，细胞在37℃剧列摇动培养1小时，然后将细胞涂布到选择性培养基上。培养过夜后，检查平板上转化细胞的集落。为选择转化体，使用含100mg/l氨苄青霉素的LB培养基。
用从单个转化体集落培养物制备的DNA进行PvuII限制性分析来筛选选择的转化体。该筛选方法根据的事实是具有所需PCR产物作为插入序列的克隆应产生比PCR产物大约大0.5Kb的PvuII片段。这是因为在核苷酸位置529和977(位于克隆入PCR产物的pBluescriptII多克隆位点(MCS)的两侧)有PvuII限制性位点。(见商品卖主产品说明书的质粒pBluescriptII图谱。)用DNA序列分析进一步分析在PvuII筛选中选择的克隆。克隆PMT1.2按上面所述经RNA PCR和克隆获得克隆PMT1.2(大约1.2Kb)。模板是烟草根poly(A+)RNA，正向和反向引物分别是P—20(SEQ ID NO8)和P—22(SEQ ID NO9)。引物P—20的序列设计是根据60KD PMT蛋白质的氨基酸13—20。引物P—22的序列设计是根据PMT蛋白质15KD CNBr片段的1—7个氨基酸序列。
对克隆PM1.2进行初步的DNA序列分析。由PMT1.2的一个读码编码的推定氨基酸序列与60KD PMT蛋白质的N—末端区域显示出极高的同源性(94％)。由PMT1.2编码的推定氨基酸序列也与代表60KD PMT蛋白质内部区域的3KD CNBr片段(如上所述)显示出极大的同源性(95％)。克隆PMT—26按上面所述经RNA PCR和克隆获得克隆PMT—26(大约1.2Kb)。模板是烟草根poly(A+)RNA，正向和反向引物分别是P—24(SEQ ID NO10)和P—21(AEQ ID NO11)。P—24引物序列是根据完整60KD PMT蛋白质的氨基酸4—10并包括其5′端的BamHT位点。引物P—21序列是根据60KD PMT蛋白质15KDCNBr片段的N末端甲硫氨酸和氨基酸1—6。另外，引物P—21包括其5′端的EcoRI位点。因此，设计的实验是为了获得编码从靠近60KD PMT蛋白质N末端的第4号氨基酸到该蛋白质15KDCNBR片段的第6号氨基酸区域的cDNA克隆。
对PMT—26cDNA克隆进行初步DNA序列分析。PMT—26克隆编码60KDPMT蛋白质的大约三分之二。由PMT—26一个读码编码的推定氨基酸序列的N末端区域与60KD蛋白质N末端区域显示出极强的同源性。推定氨基酸序列的C末端区域与代表60KDPMT蛋白质内部区域的3KDCNBr片段(如上所述)显示出极大的同源性。克隆Q7按上面所述经RNA PCR和克隆获得克隆Q7(大约0.4Kb)。PCR模板是烟草根poly(A+)RNA，正向和反向引物分别是P—18(SEQ ID NO12)和P—23(SEQ ID NO13)。引物P—18的序列是根据N末端甲硫氨酸加上上述纯化的60KD蛋白质产生的15KD溴化氰片段的氨基酸1到7。反向引物P—23的序列由一个多聚(dt)区(20个脱氧胸苷)，一个EcoRI位点和在5′端的3个额外的脱氧胸苷组成。克隆PMT2—5结合部分克隆(PMT—26)的序列信息，使用RNA PCR和克隆技术(基本上如上所述)获得克隆PMT2—5(大约1.5Kb)在(RNA PCR程序中，引物浓度为1.0μM而不是2.5μM。另外，第一步循环温度限定为50℃而不是55℃，最后一步循环限定为30分钟，而不是10分钟)。模板是烟草根poly(A+)RNA，正向和反向引物分别是P—38(SEQ ID NO14)和P—36(SEQ ID NO15)。引物P—38序列是根据编码60KD PMT蛋白质N端区域氨基酸4—11(SEQ ID NO4)的克隆PMT—26(如上所述)51区的DNA序列。引物P—36由DNA克隆Q73′区设计。引物P—38和P—36都与其靶序列100％同源。
对克隆的PMT—5DNA插入序列进行DNA序列分析。与预期的一样，PMT2—5DNA序列与PMT1.2和Q7DNA序列相匹配。这一结果证实了克隆PMT1.2和Q7代表单个转录子的区域，因此编码单一蛋白质的区域。克隆PMT2—5编码除N端甲硫氨酸和氨基酸1—3(即，Leu—ser—ser)外的全部60KDPMT蛋白质。除PMT2—5外；还获得与克隆PMT2—5或Q7部分同源的其它克隆(资料未显示)。克隆PMT14—3为了在克隆PMT2—55′端加入一个NCOI限制性位点和N—端甲硫氨酸，丙氨酸和PMT氨基酸1—3的密码子，合成了一个正向引物P—37。以标准DNA PCR技术将引物P—37的序列掺入PMT2—5DNA。PMT2—5DNA作为聚合酶链反应的模板正向引物分别是P—37(SEQ ID NO16)和P—36(SEQ ID NO15)。按上面所述克隆PCR的DNA产物。用这种方法获得克隆PMT14—3。预期克隆PMT14—3编码在紧靠N端甲硫氨酸后插入一个附加的丙氨酸残基的完整60KD PMT蛋白质。经常规序列分析证实了克隆PMT14—3的这种预期结构。发现克隆PMT14—3的序列是(SEQ ID NO17)。经过对携带有意义取向PMT14—3DNA插入片段的表达载体转化的宿主细胞中产生的重组PMT蛋白质的序列分析可检测插入的丙氨酸残基对N端甲硫氨酸残基转录后加工的可能影响(如果有的话)。
以本文所述方法制备的重组DNA序列由保藏于美国典型培养物保藏中心(Rockville，Maryland)的培养物来例证。该培养物鉴定为大肠杆菌(Escherichia coli)，PMT14—3，于1993年3月11日保藏，给定的ATCC标号为69253。
用含有如下5′到3′取向或3′到5′取向SEQ ID NO17 DNA序列的根癌土壤杆菌接种烟草(Nicotiana tabacum)叶pBI121对照质粒，Kan′(能以商品形式买到)1.2A3—3B用PMT基因1.2Kb片段以反义取向转化的植物。
1.2A2—40用PMT基因1.2Kb片段以反义取向转化的植物。
1.2S3—15用PMT基因1.2Kb片段以有意义取向转化的植物。
1.2S4—16周PMT基因1.2Kb片段以有意义取向转化的植物。
愈伤组织长成植物，在植物去顶前和去顶后取叶片样品。用含内在标准的甲醇氢氧化钾从转化叶片和对照叶片中提取叶片样品中的生物碱。过滤上清液并使用分析烟碱的氮磷检测器(NPD)进行气相色谱分析。得到下面结果
正如所预料的，植物去顶后的烟碱水平地去顶前明显要高。然而，根据本发明处理的材料长成的植物与对照植物相比，由去顶引起的烟碱水平增长大幅度下降。序列描述(1)一般资料(i)申请人Wahab.Samir Z.
Malik.vedpal S.
(ii)发明题目腐胺N—甲基转移酶、编码腐胺、N—甲基转移酶的重组DNA分子，和生物碱含量减少的转基因烟草植物(iii)序列数17(iv)联系地址(A)联系人Burns.Doane，Swecker and Mathis(B)街道P.O.BOX1404(C)城市Alexandria(D)州VA(E)国家USA(F)邮编22314(V)计算机可读形式(A)媒体类型Floppy disk(B)计算机IBM PC兼容性(C)操作系统PC—DOS/MS—DOS(D)软件Patent In Release#1.0Version#1.25
(vi)最近申请资料(A)申请号(B)申请日(C)分类(vii)优先权申请资料(A)申请号US07/613，160(B)申请日14—NOV—1990(Vii)优先权申请资料(A)申请号US08/076,681(B)申请日1993年6月1日(viii)代理人/代理资料(A)姓名Sharon E.Crane—Fenry(B)登记号36，113(C)资料/文摘号PM—16961021238—072(ix)电讯资料(A)电话703—836—6620(B)电传703—836—2021(2)SEQ ID NO1资料(i)序列特征
(A)长度17个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑线型(ii)分子类型蛋白质(iii)假定的非(iv)反义非(v)片段类型N—末端(vi)原始来源(A)生物Nicotiana tabacum(B)品种Burley21(xi)序列描述SEQ ID NO1Leu Ser Xaa Asn Phe Leu Phe Gly Thr Ala Ser Ser Xaa Tyr Gln Tyr1 5 10 15Glu(2)SEQ ID NO2资料(i)序列特征(A)长度17个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑线型
(ii)分子类型蛋白质(iii)假定的非(iv)反义非(v)片段类型N—末端(vi)原始来源(A)生物Nicotiana tabacum(B)品种Burley21(xi)序列描述SEQ ID NO2Leu Ser Ser Asn Phe Leu Phe GLy Thr Ala Ala pro Tyr Tyr Gln Tyrl 5 10 15Glu(2)SEQ ID NO3资料(i)序列特征(A)长度17个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑线型(ii)分子类型蛋白质(iii)假定的非(iv)反义非(v)片段类型N—末端
(vi)原始来源(A)生物Nicotiana tabacum(B)品种Burley21(xi)序列描述SEQ ID NO3Leu Ser Xaa Asn Phe Leu Phe Gly Thr Ala Xaa Xaa Xaa Tyr Gln Tyrl 5 10 15Glu(2)SEQ ID NO4资料(i)序列特征(A)长度29个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑线型(ii)分子类型蛋白质(iii)假定的非(iv)反义非(v)片段类型N—末端(vi)原始来源(A)生物Nicotiana tabacum(B)品种Burley21(xi)序列描述SEQ ID NO4Leu ser ser Asn Phe Leu Phe Gly Thr Ala ser ser Tyr Tyr Gln Tyr1 5 10 15Glu Gly Ala Phe Leu ser Asp Gly Val Gly Leu ser Asn20 25(2)SEQ ID NO5资料(i)序列特征(A)长度13个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑线型(ii)分子类型蛋白质(iii)假定的非(iv)反义非(v)片段类型内部的(xi)序列描述SEQ ID NO5Phe Ile Thr Glu Asn Gly phe Ala Gly Arg ser Gly Arg1 5 10(2)SEQ ID NO6资料(i)序列特征(A)长度15个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑线型
(ii)分子类型蛋白质(iii)假定的非(iv)反义非(v)片段类型内部的(vi)原始来源(A)生物Nicotiana tabacum(B)品种Burley21(xi)序列描述SEQ ID NO6Asn Glu Pro Xaa Phe val Ala Ile Sar Gly Tyr Arg Asp Xaa Thr1 5 10 15(2)SEQ ID NO7资料(i)序列特征(A)长度20个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑线型(ii)分子类型蛋白质(iii)假定的非(iv)反义非(v)片段类型内部的(vi)原始来源
(A)生物Nicotiana tabacum(B)品种Burley21(xi)序列描述SEQ ID NO7Ala Asp Ile Glu His Tyr Ser Lys Leu Ile Asp Ala Leu Xaa Ile Lys1 5 10 15Gly Ile Gln Phe20(2)SEQ ID NO8资料(i)序列特征(A)长度23个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑线型(ii)分子类型DNA(基因组)(iii)假定的是(iv)反义非(ix)特征(A)名称/键misc特征(B)位置18(D)其它资料/注二“在该位置用脱氧次黄苷代替混合的核苷酸”
(ix)特征(A)名称/键misc—特征(B)位置21(D)其它资料/注二“在该位置用脱氧次黄苷代替混合的核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO8TAYTAYCART AYGARGGNGC NTT(2)SEQ ID NO9资料(i)序列特征(A)长度23个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑线型(ii)分子类型DNA(基因组)(iii)假定的是(iv)反义非(xi)序列描述SEQ ID NO9AANCCRTTYT CNGTDATRAA CAT(2)SEQ ID NO10资料
(i)序列特征(A)长度29个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑线型(ii)分子类型DNA(基因组)(iii)假定的是(iv)反义非(xi)序列描述SEQ ID NO10ATCGGATCCA AYTTYTTGTT YGGNACHGC(2)SEQ ID NO11资料(i)序列特征(A)长度28碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑线型(ii)分子类型DNA(基因组)(iii)假定的是(iv)反义非(xi)序列描述SEQ ID NO11ATGGAATTCC RTTY TCNGTD ATRAACAT(2)SEQ ID NO12资料(i)序列特征(A)长度23个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑线型(ii)分子类型DNA(基因组)(iii)假定的是(iv)反义非(xi)序列描述SEQ ID NO12ATGTTYATHA CNGARAAYGG NTT(2)SEQ ID NO13资料(i)序列特征(A)长度29个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑线型(ii)分子类型DNA(基因组)(iii)假定的是
(iv)反义非(xi)序列描述SEQ ID NO13TTTGAATTCT TTTTTTTTTT TTTTTTTTT(2)SEQ ID NO14资料(i)序列特征(A)长度24个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑线型(ii)分子类型DNA(基因组)(iii)假定的是(iv)反义是(xi)序列描述SEQ ID NO14AATTTCTTGT TCGGGACAGC CTCT(2)SEQ ID NO15资料(i)序列特征(A)长度24个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑线型
(ii)分子类型DNA(基因组)(iii)假定的是(iv)反义非(xi)序列描述SEQ ID NO15AGGCTGAACA ATTATAGTAT GATT(2)SEQ ID NO16资料(i)序列特征(A)长度45个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑线型(ii)分子类型DNA(基因组)(iii)假定的是(xi)序列描述SEQ ID NO16CATGCCATGG CTCTTTCTTC TAATTTCTTG TTCGGGACAG CCTCT(2)SEQ ID NO17资料(i)序列特征(A)长度1545个碱基对(B)类型核酸
(C)链型双链(D)拓扑线型(ii)分子类型cDNA(iii)假定的非(iv)反义非(xi)序列描述SEQ ID NO17ATGGCTCTTT CTTCTAATTT CTTGTTCGGG ACAGCCTCTT CATATTACCA GTATGAAGGA60GCTTTCCTCA GTGATGGGAA AGGCCTCAGC AACTGGGACG TTTTTACCCA TGAAGCTGGT 120CATGTTAAGG ATGGAAGCAA TGGAGATGTG GCTGTTGATC ACTACCATCG TTATTTGGAG 180GACATCAAAC TCATGGCAGA TATGGGTGTG AATAGCTTTC GTTTCTCTAT CTCATGGGCA 240AGAATTCTGC CCAAGGGAAT ATTTGGAGAA GTTAATATGG CCGGAATTGA GCACTACAGT 300AAGCTCATTG ATGCACTCCT ACAGAAAGGG ATCCAGCCGT TTGTCACATT AACACATTTT 360GACATACCAC AAGAACTTGA GGACAGATAT GGTGGTTGGC TAAGTTCACA GATACGGGAT 420GATTTCAGCT ATTTCGCAAA CATATGCTTC AAATACTTGG GAGATAGAGT TAAATACTGG 480GTAACGATGA ATGAGGCTAA CTTCGTGGCC ATTAGTGGCT ATAGAGATGG GACTTGCCCT 540CCAACTCGAT GCTCTGGTAT ATTTGGGAAT TGTAGTGCTG GGGATTCAGA AAGGGAACCC 600TTCATTGCAG CTCACAATAT GATCCTATCT CATGCAGATG CTGTCAGCAT TTACCGCACC 660AGATATCAGA AAAGTCAAGG AGGCATGATT GGCATTACTA TGGGTTTCGA ATGGTATGAA 720CCGTTAAGCA ATTCCTCAGA AGACATAGCT GCAACTCATA GAGCTCGATC ATTCTATGAC 780AGTTGGTTTT TAGACCCTAT TATATTAGGA AGATATCCTG AAGAAATGGC ACAAATTTTG 840GGATCTAATC TTCCAGAATT TTCAGTGAGT GATTTGAGAA TGTTGAGTTA TGGCCTAGAT 900TTCATTGGCA TCAATCATTA TTCAGCTGTT TATATCAAAG ATTGCTTATA TTCTGCCTGT 960GAACATGGAA ACTCTTGGTC AGAGGGTTCT TATTTAACGA CTACACAAAG AGACGGTGTC 1020TACATCGGGG AACCTGGGGA AGTGGACTGG CAATTTGTGT ATCCACAAGG GATTGAAAAA 1080GTTGTGATGT ATATAAAGGA CAGATTCAAC AATACTCCTA TGTTTATCAC TGAAAATGGC 1140TTTGCTGGGA ACAGTTCTTC TATAGAGGAT GCCTTGAACG ATGTTCATAG AGTGAAATAC 1200ATGCATAGCT ACTTAAATTC ATTGGCAAAT GCAATCAGGA AAGGTGCAGA TGTAAGGGGG 1260TACTTTGCTT GGTCCCTTCT TGATAACTTT GAGTGGCTAG ATGGATATAC CATAAGATTT 1320GGACTTTACT ATGTCAACTA CACAAATCTC CAGAGAACTC CAAAACTATC AGCCACTAAG 1380TATCCAGAGC TCATGTGTAA CTTTCACATA GAGCTTGAAG CACATACTGC CCAGAAATAG 1440CGTAAGAAGA CGGTGCATAT GTGGAGGCTT GTTGAAGATT TTTTTATTTA GTTCTCTATT 1500GTTGGAAGGC AATTACTGAG CAATCATACT ATAATTGTTC AGCCT 154权利要求
1.一种编码烟草蛋白质的重组DNA分子，其特征为具有催化S—腺苷甲硫氨酸上的甲基转移到腐胺δ氨基上的能力。
2.根据权利要求1的重组DNA分子，编码的腐胺N—甲基转移酶具有SEQ ID NO1，SEQ ID NO2或SEQ ID NO3的氨基酸序列。
3.根据权利要求1的重组DNA分子，包含质粒PMT14—3CDNA插入片段的核苷酸序列，或包含与所述DNA插入片段杂交的核苷酸序列或与所述核苷酸序列的任一种简并的核苷酸序列。
4.根据权利要求1的重组DNA分子，包含SEQ ID NO17的核苷酸序列或能与该核苷酸序列杂交的DNA序列。
5.一种载体，包含与能指导分离的DNA分子所编码的MRNA进行转录的序列以可操作的形式相连的根据权利要求2，3或4的DNA分子。
6.根据权利要求5的载体，其特征为编码与反义mRNA互补的DNA序列与能指导该反义mRNA进行转录的序列相连接。
7.以根据权利要求5或6的载体稳定转化的培养的转基因烟草细胞。
8.以根据权利要求5或6的载体稳定转化的转基因烟草植物。
9.由SEQ ID NO17编码的腐胺N—甲基转移酶。
10.由SEQ ID NO1，SEQ ID NO2或SEQ ID NO3编码的腐胺N—甲基转移酶。
全文摘要
本发明提供了高度纯化的烟草腐胺N-甲基转移酶，其纯化方法，以及PMT DNA序列的产生。纯化方法包括将烟草根提取物加样到阴离子交换介质上并用含腐胺的洗脱缓冲液特异性地洗脱腐胺N-甲基转移酶的步骤。
文档编号C12N5/10GK1127530SQ94192879
公开日1996年7月24日 申请日期1994年6月1日 优先权日1993年6月1日
发明者S·Z·瓦赫, V·S·迈克 申请人:菲利普莫里斯生产公司