一种儿茶酚-o-甲基转移酶酶活力检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医药技术领域，同时又属于临床诊断和检测领域。具体而言，本发 明提供了 一种测定儿茶酪-〇-甲基转移酶（COMT，Cat echo l-0-me thy 1 transferase，EC 2.1.1.6)酶活力的方法。
【背景技术】
[0002] 儿茶酪-〇-甲基转移酶（COMT，(^itechol-〇-methyltransferase，EC 2.1.1.6)，是 一种重要的代谢酶，广泛存在于哺乳动物组织和红细胞中，它存在膜结合型（membrane- bound COMT，MB-C0MT)和可溶型（soluble COMT，S-C0MT)两种形式。人体内的COMT的甲基化 反应作用底物是多种儿茶酪类化合物，如肾上腺素、去甲肾上腺素和多己胺(DA)等。在中枢 神经系统中，COMT作为代谢酶将儿茶酪结构的神经递质去活；同时对儿茶酪雌激素，儿茶酪 药物W及某些致癌物质也起到代谢作用。
[0003] COMT是体内儿茶酪类化合物的代谢的重要酶，Vall08/158Met的替换导致COMT酶 活力存在多样性，其酶活力强弱与体内儿茶酪类化合物的含量有密切关系，在突触间隙特 别是突触后膜上COMT的活性较高，可将S-腺巧蛋氨酸提供的甲基转移到儿茶酪胺苯环的3 位氧上，成为3-甲氧基4-径基衍生物，是具生物活性或毒性的儿茶酪胺的主要代谢酶，也是 中枢神经系统外多己胺的主要降解酶，该酶的功能与精神分裂症、帕金森病、抑郁症、儿童 孤独症、焦虑症、屯、境障碍、强迫症等神经系统疾病有重要的关系。
[0004] 儿茶酪-0-甲基转移酶功能改变将直接引起体内多己胺及其他儿茶酪胺类物质含 量的变化，儿茶酪胺特别是多己胺系统是精神分裂症发病机制中最引人关注的生物学因 素。目前已知COMT的Vall08/158Met功能多态性影响精神分裂症的发生、临床特征、认知功 能及治疗反应，携带低活性COMT基因型者对传统抗精神病药物的反应较差。COMT的活性测 定是研究帕金森病发病机制和治疗药物研发的重要依据，可W应用COMT的抑制剂治疗中晚 期的帕金森病，如恩他卡朋，该抑制剂可W使血浆左旋多己的浓度平稳，并使左旋多己的剂 量减少，同时异动症的发生也相应减少。
[0005] 单双相抑郁症患者红细胞COMT平均活性浓度要低于正常人水平，运也间接证明了 抑郁症的发病机制与血浆红细胞中的COMT活性浓度降低有关。也有报道说明男女患者呈现 不同的COMT水平，但均异于正常人水平，对于COMT活性浓度水平的研究对研究或诊断治疗 抑郁症有很重要的意义。
[0006] COMT酶活性存在个体差异，其表型是由C0MTH(高活性)和C0MTL(低活性)两个等位 基因决定的，COMT在大脑皮层前额叶神经元突触后儿茶酪胺的代谢活动中起着特别重要的 作用，大脑皮层额叶功能的改变，与孤独症的核屯、症状之一的认知缺陷相吻合。有研究发现 孤独症患者COMT基因的高活性基因型（G/G)的频率显著高于父母对照组，所W对于研究 COMT基因型与孤独症发病的关联性还是非常有必要的。
[0007] 有研究表明焦虑症的发病与多己胺系统的功能异常有关，对COMT基因的研究对掲 示焦虑症的发病原因有重要的意义。有研究表明女性患者COMT等位基因与基因型分布均与 对照有显著差异，但男性患者并无显著差异，表明COMT基因型与女性焦虑症患者的相关人 格特征一高避害化arm avoidance，HA)可能存在一定的相关性。
[000引雌激素代谢产物儿茶酪雌激素 （catechol estrogen，CE)可直接引起机体DNA的损 伤和突变，从而诱发癌症。在肝外组织中，雌激素的代谢是通过C0MT完成的。CE在C0MT的作 用下形成可溶于水的代谢产物排出体外，减少由于CE堆积对组织局部产生的刺激作用。如 果C0MT含量不足或活性降低，CE即可被细胞色素 P450(巧tochrome P450，CYP450)酶催化形 成相应的酿类化合物，与DNA结合发生脱嚷岭反应形成脱嚷岭化合物，运种脱嚷岭作用可促 使机体DNA损伤和突变，进一步引起肿瘤发生。
[0009] 有研究报道通过对子宫内膜癌、子宫内膜增生及正常子宫内膜的研究发现，携带 COMTVal/Val基因型的妇女相对于COMTMet/Met基因型者发生子宫内膜癌的风险可能会降 低，C0MT基因多态性与子宫内膜癌的发病风险由关，且子宫内膜癌组织中S-C0MT和MB-C0MT 蛋白的表达水平明显低于对照组，但对外周血S-C0MT活性的研究显示并无明显差异，有可 能子宫内膜癌患者体内的COM巧舌性变化体现在子宫内膜病变局部的活性降低。另外在乳腺 癌的研究中发现，乳腺癌患者中C0MT的活性要低于对照组，运对诊断W及治疗子宫内膜癌 及乳腺癌都有显著的意义。
[0010] 目前C0MT酶活力检测的方法主要有W下几种，主要检测方法是用HPLC的方法进行 检测，其原理是W3,4-二径基苯甲酸(DBA)为底物，S-腺巧甲硫氨酸(SAM)为甲基供体，在儀 离子的存在下，将SAM上得的甲基转移至DBA的3位氧上，生成产物4-径基-3-甲氧基苯甲酸 (4-OH-3-MBA)，采用HPLC对该反应的生成物进行定量测定。另一种是放射化学法。放射化学 法测定C0MT活性的是m4C标记的S-甲基14C-腺巧-甲硫氨酸（14-SAM)为标记甲基的供者。 还有是采用气相色谱法检测。综合上述几种检测方法来看，放射法的前期处理较复杂，对技 术要求较高且易造成污染，而气相色谱法和HPLC法对设备要求较高，操作相对复杂，检测周 期也较长;上述两种方法的特点均不利于推广使用。
【发明内容】
[0011] 因此，基于上述已有技术的缺陷，为了解决现有儿茶酪-0-甲基转移酶（C0MT， Catechol-〇-methyltransferase，EC 2.1.1.6)的酶活力检测方法不易推广的问题，本发明 的目的是提供一种快速、特异、准确可靠的C0MT酶活力检测方法。采用该方法可W在半自动 或全自动的分析检测设备上使用，而且检测灵敏度高，特异性高，操作简便，因而可W得到 切实的推广使用。
[0012] 针对上述发明目的，本发明是通过下述技术方案实现的：
[0013] 本发明提供一种儿茶酪-0-甲基转移酶(C0MT)酶活力检测方法，所述方法包括： (1)将含C0MT的样本与S-腺巧-1^-甲硫氨酸（SAM)和甲基受体接触W形成S-腺巧-k同型半 脫氨酸(SAH)和甲基受体的甲基化产物，（2)通过将所述SAH与S-腺巧同型半脫氨酸水解 酶（SA化se)相接触W生成高半脫氨酸化cy)和腺巧(Ado),采用光度计评估所述Ado的产生 速率W检测所述样本中所述C0MT的酶活力。
[0014] 优选地，根据前述的儿茶酪-0-甲基转移酶酶活力检测方法，其中，所述甲基受体 为儿茶酪类化合物。优选地，所述儿茶酪类化合物为儿茶酪胺苯甲酸。最优选为3，4-二径基 苯甲酸(DBA)。
[0015] 更优选地，根据前述的COMT酶活力检测方法，其中，所述方法包括：
[0016] (1)所述含C0MT的样本、所述SAM和所述甲基受体混合并反应获得反应液1;
[0017] (2)将所述S-腺巧-心同型半脫氨酸水解酶加入步骤（1)中的所述反应液1中并反 应，获得反应液2;
[0018] (3)将步骤(2)中所述的反应液2离屯、获得上清液；
[0019] (4)采用光度计检测步骤(3)中所述的上清液的光吸收值，间接或直接地评估所述 Ado的产生速率W检测所述样本中所述儿茶酪-0-甲基转移酶的酶活力。
[0020] 再优选地，根据前述的C0MT酶活力检测方法，其中，所述方法包括:在步骤(1)过程 和步骤(2)过程中加入缓冲液;优选地，所述缓冲液选自甘氨酸/氨氧化钢、巧樣酸/巧樣酸 钢、憐酸氨盐/削i酸(盐）、憐酸盐、2-吗嘟代乙横酸缓冲液、3-吗嘟丙横酸缓冲液、4-径乙 基赃嗦乙横酸缓冲液、Tris-盐酸、棚酸-棚砂、己比妥钢-盐酸缓冲液中的一种或多种。最优 选为Tris-盐酸。
[0021] 还优选地，根据前述的C0MT酶活力检测方法，其中，所述缓冲液为10~lOOOmmol/ L，优选为25~lOOmmol/L，最优选为30mmol/L。所述甲基受体为0.002~lOmmol/L，优选为 0.05~0.5mmol/L，最优选为0.4mmol/L。所述S-腺巧-k甲硫氨酸为0.02~2mmol/L，优选为 0.05~0.5mmol/L，最优选为0.2mmol/L。及所述S-腺巧-1^-同型半脫氨酸水解酶为0.01~ 100KU/L，优选为0.1 ~50KU/L;最优选为 10KU/L。
[0022] 或还优选地，根据前述的C0MT酶活力检测方法，其中，步骤（1)中所述反应的条件 为置于35°C环境中溫浴60min。优选地，步骤(2)中所述反应的条件为置于30°C环境中溫浴 1 Omin。更优选地，步骤(3)中所述离屯、为10, OOOg离屯、10分钟。
[0023] 或还优选地，根据前述的C0MT酶活力检测方法，其中，所述方法还包括在步骤（1) 前将所述含C0MT的样本进行前期处理，所述前期处理为所述含C0MT的样本与试剂混合，所 述试剂为油酸、胆酸盐、Tween 20、化ij35或牛横胆酸钢。优选地，所述试剂在上述混合后， 达到的体积百分浓度为0.05-1 %。最优选为0.5%。
[0024] 进一步优选地，根据前述的C0MT酶活力检测方法，其中，所述方法还包括，在所述 前期处理后，将所述含C0MT的样本在冰上放置30min。
[0025] 优选地，根据前述的COMT酶活力检测方法，其中，所述SAM由Ξ憐酸腺巧，甲硫氨酸 和S-腺巧甲硫氨酸合成酶化C 2.5.1.6)组成的酶反应系统所生成。
[00%]优选地，根据前述的C0MT酶活力检测方法，其中，所述含C0MT的样本选自生物组 织、体液和细胞中的一种或多种;优选地，所述生物组织选自肺、膜腺、小肠、肾、胎盘、骨骼 肌、乳腺、脑和肝脏中的一种或多种，所述体液为血液，所述细胞为红细胞。
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