基于未修饰纳米金与双链dna相互作用的比色法检测dna的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种基于未修饰纳米金与双链DNA相互作用的新型比色法检测DNA。
【背景技术】
[0002] 近年来，生物、医学、化学、物理等学科领域的研究人员都对纳米金产生了浓厚的 兴趣。与常规的宏观粒子比较，纳米金具有非常独特的物理化学性质W:(l)纳米金易于 制备；（2)具有纳米颗粒所特有的小尺寸效应、表面效应；（3)具有独特的电学效应、光学 效应、磁学效应、催化效应和特殊的生物亲和效应。运些效应使得金纳米粒子广泛应用于临 床、材料学等领域，在医学检验领域金标记技术已经成为目前的第四大标记技术。
[0003] 用巧樣酸钢还原氯金酸法制备出的纳米金由于表面吸附了带负电荷的巧樣酸根 离子而相互排斥，在溶液中处于均匀分散的稳定状态，颜色呈透亮的酒红色。但若加入一 定量的盐，稳定状态即被打破，纳米金发生团聚，粒子间距小于平均粒子直径，导致溶液颜 色很快由红色转为紫色最后呈蓝灰色溶液颜色，而且运种变化是不可逆的。基于运个原理 发展了一系列的纳米金检测DNA的方法，可归纳为两种。
[0004] 一是修饰的纳米金检测技术；纳米金上通常修饰有单链DNA(ssDNA)，如果此 ssDNA与待检测DNA相匹配而形成双链，颜色发生转变W。运种方法也存在不足，如纳米金 团聚的时间太长，修饰的过程比较费时。在金纳米粒子表面修饰的物质如抗体、DNA、半脫氨 酸等都是通过Au-S键结合的，运些带琉基的物质价格都比较贵、难W获得。
[000引二是未修饰的纳米金检测技术；Li和RothbergW指出，未修饰的纳米金对单链DNA(ssDNA)和双链DNA(dsDNA)有不同的静电作用。ssDNA的单链具有足够的柔初性 在溶液中得W部分展开，使其碱基暴露，碱基带正电，与带负电的纳米金通过静电作用力相 结合，能吸附在纳米金上。在加入盐溶液后，ssDNA保护纳米金不聚集，颜色保持红色。而 dsDNA由于带负电与纳米金相互排斥，不能吸附在纳米金上，在加盐后颜色变成蓝色至灰 色。此方法价格低廉，不需要额外的检测仪器，检测方法简单。通过利用运一原理，化SUb Lee在其文章中成功利用未修饰的纳米金检测了点突变W。
[0006] 现有的未修饰的纳米金检测DNA看似简单可行，价格低廉，但实际应用并不广泛。 此原理2004年被提出，但截至2015年，只利用此原理检测实际样品的做法很少。本发明希 望找出其中的问题所在。而其余的DNA检测方法，如琼脂糖电泳，污染环境，操作繁琐；而如 qPCR费用昂贵，要使用特殊昂贵的仪器，不便推广。
[0007] 上述设及到的参考文献如下：
[1] 姚素薇，邹毅，张卫国.金纳米粒子的特性、制备及应用研究进展[J].化工进 展，2007 (03) :310-314.
[2] 李静.纳米金比色法检测克伦特罗和凝血酶[M]:陕西师范大学，2012:68
[3] Li,比，Rothbe巧.，L.，2004.PNAS. 101，14036-14039.
[4] Lee,比，Kang,T.,Yoon,K.A.,Lee,S.Y.,Joo,S.W.,Lee,K., 2010b. Biosens.Bioelectron. 25巧），1669-1674。
【发明内容】
[0008] 为了解决上述存在的问题，本发明探讨了dsDNA与未修饰的纳米金之间的相互作 用，找到了能运用于实际的未修饰纳米金检测DNA的方法。本发明利用未修饰纳米金与 dsDNA相互作用的性质，建立一种快速简单，无需用到额外的仪器（肉眼可见)，不污染环境， 结果可靠，灵敏度高的新型检测方法。
[0009] 本发明所采取的技术方案是： 一种检测双链DNA的方法，包括W下步骤：将待测样品加入含有未修饰的纳米金的溶 液中，混匀，再加入盐，混匀，若溶液颜色仍然保持红色说明样品中含有双链DNA。
[0010] 进一步的，上述盐为能够使纳米金发生聚团的盐。
[0011] 一种检测基因点突变的方法，包括W下步骤： 1) 根据需要检测的基因，对待测样品DNA进行等位特异性PCR扩增，PCR的引物根据突 变位点设计，只能扩增出发生点突变的基因； 2) 将PCR扩增产物加入含有未修饰纳米金的溶液中，混匀，再加入盐，混匀，若溶液颜 色保持红色说明该样品发生了相应的基因点突变。
[0012] 本发明的有益效果是： O本发明发现了dsDNA能吸附于未修饰的纳米金上。
[0013] 2)本发明基于dsDNA能吸附于未修饰的纳米金的原理，建立的新型比色法检测 DNA。
[0014] 3)本发明基于dsDNA能吸附于未修饰的纳米金的原理建立了BRAFV600E的点突 变检测。同时此方法可W推广至各种点突变的检测，及病毒检测。
[0015] 4)本发明方法快速简单，无需用到额外的仪器（肉眼可见)，不污染环境，结果可 靠，灵敏度高的新型检测DNA的方法。
【附图说明】
[0016]图1为纳米金的表征，其中A为纳米金的TEM图，B为纳米金的紫外光谱图； 图2为dsDNA与未修饰纳米金之间相互作用的研究。A为各组溶液中罗丹明B的巧光 发射光谱图；B为各组溶液中dsDNAz的巧光发射光谱；C为罗丹明B(RB)、dsDNAi和纳米金 (AuNPs)相互作用巧光强度变化原理图，其中实屯、球体表示纳米金；D为dsDNAz和纳米金 (AuNPs)相互作用巧光强度原理图，其中实屯、球体表示纳米金，G为连在dsDNAz5'的巧光 分子罗丹明绿. 图3为dsDNAz溶液体系与纳米金溶液巧光滴定图，A为在溫度308K时的巧光滴定图， 其中1~5曲线对应的纳米金溶液浓度分别为0molL1、0. 98X10 1°molL1、1. 96X10 1° molL1、29. 4X10"molL1、3. 9X10"molLSb为dsDNA2与纳米金的Van't-Hoff图； 图4为未修饰的纳米金检测dsDNA的结果图，A为不同浓度的dsDNAi与纳米金溶液混 合后的颜色变化情况；B为未修饰的纳米金比色法检测dsDNA原理图； 图5 (A)未修饰的纳米金检测BRAFV600E突变的结果图和度）各细胞的直接测序的 结果图。
【具体实施方式】
[0017] 一种检测双链DNA的方法 1) 准备好未修饰纳米金溶液； 2) 将待测样品加入未修饰纳米金溶液中，混匀； 3) 往上述混合液中再加入盐，混匀后，若溶液颜色仍然保持红色说明样品中含有双链 DNA。
[0018] 优选的，步骤1)中未修饰纳米金溶液的浓度为达到肉眼可识别其颜色为红色即 可，更优选的，未修饰纳米金溶液的浓度为0. 37nM及W上；更优选的纳米金浓度为0. 37 nM~2. 46nM。
[0019] 上述未修饰的纳米金粒径使纳米金溶液肉眼可见呈红色即可，本发明实施例所用 纳米金粒径为17. 5皿。
[0020] 优选的，上述步骤2)中待测样品与未修饰纳米金溶液的体积比为1 : (1~50)。该 体比可根据纳米金粒径的不同、纳米金浓度的不同、DNA序列长度的不同、盐的用量等具体 情况进行适当的改变。
[0021] 优选的，上述步骤3)中所述的盐为能够使纳米金发生聚团的盐。
[0022] 优选的，上述步骤3)中盐在如为化Cl溶液，其加入量为使盐的终浓度为0. 05M。
[0023] 一种检测基因点突变的方法 1) 根据需要检测的基因，对待测样品DNA进行等位特异性PCR扩增，即PCR的引物根据 突变位点设计，只能扩增出发生点突变的基因； 2) 将PCR扩增产物加入含有未修饰纳米金的溶液中，混匀，再加入盐，混匀，若溶液颜 色保持红色说明该样品发生了相应的基因点突变。
[0024] 下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
[00巧]实施例1dsDNA与未修饰的纳米金表面具有吸附结合作用 1.纳米金的合成与表征 方法：将圆底烧瓶中加入95血超纯水，1血1%氯金酸，磁力揽拌下加热至100。开始沸 腾后迅速一次性加入4ml1%巧樣酸S钢，充分揽拌并在100°C下保持沸腾至溶液呈酒红色 后加热20min，自然冷却至室溫，所得溶液即为纳米金溶胶，于4°C下避光保存备用。
[0026] 利用透射电子显微镜（TEM)对胶体金溶液的形貌和粒子大小进行观察；把制备的 溶胶样品直接滴在锻有碳膜的铜网上，红外灯下干燥30min后，放入透射电镜样品台拍摄 TEM图像，操作电压为200kV。采用紫外一可见分光光度法，在波长为450~600nm范围内 测定金溶胶的吸收光谱，观察其特征吸收曲线。
[0027] 结果：纳米金的TEM图像如图IA所示，由TEM图计算出纳米金的粒径为17. 5nm， 纳米金的紫外光谱图如图IB所示，从中计算出纳米金的浓度为2.71nM。
[0028] 的制备 杂交缓冲液为10ml化is(pH7. 5 - 8. 0)与50ml化Cl。把两条不同序列的ssDNA加入杂交缓冲液中95 °C加热5min后，逐渐冷却至室溫即得dsDNA。dsDNAi由ssDNAi ssDNAz杂交制成，dsDNAz由ssDNAz与SSDNA3杂交形成，具体的碱基序列如表1所示。
[0029] 表1核巧酸序列表
注：;rhodaminegreen为罗丹明绿。
[0030] 与未修饰纳米金间的相互作用 方法：罗丹明B能吸附在纳米金表面而使其自身巧光被泽灭。本实验检测了W下四组 溶液中罗丹明B的巧光强度： a:罗丹明B; b:罗丹明B、dsDNAi和纳米金（dsDNA1和纳米金先混匀静置IOmin再加入罗丹明B);C:罗丹明B和dsDNAi; d:罗丹明B和纳米金； 上述四组溶液体积均为310化，纳米金用量为20化，罗丹明B的终浓度均为3. 2X10 5mol?L，dsDNAi的终浓度为1. 29剛。罗丹明B巧光的激发波长为510皿。
[0031] 结果：上述a、b、c、d四组溶液中罗丹明B的巧光检测结果如图2A所示，从中可W 看出未加入dsDNAi和纳米金的罗丹明B巧光强度最强（a);当溶液中含有dsDNA1 (C)或纳 米金（d)时，罗丹明B的巧光强度均会变低，说明dsDNAi、纳米金均能与罗丹明B相互作用， 泽灭罗丹明B的巧光；然而，将dsDNAi和纳米金先混合后再加入到罗丹明B溶液中，dsDNA1 和纳米金对罗丹明B巧光的泽灭能力下降，运说明dsDNAi与纳米金发生了相互作用，导致 溶液中游离的纳米金和dsDNAi减少，从而与罗丹明B结合的纳米金和dsDNA1减少，即表现 出对罗丹明B巧光的泽灭能力下降。此原理可用图2C作进一步解释，当没有dsDNA存在时， 纳米金只和罗丹明B结合，当有dsDNA存在时，dsDNA与罗丹明B竞争性地与纳米金结合， 与纳米金结合的罗丹明B必须减少，从而减少对罗丹明B巧光的泽灭。
[0032] 方法：dsDNAz的5'有巧光分子罗丹明绿(见表1)，激发波长为489皿。本实验检 测W下两组溶液的巧光强度： A:d