专利名称:用于转运dna修饰酶至基因组的载体的制作方法
本发明涉及用于转运DNA修饰酶至基因组中想要的位置的载体。此外本发明还涉及包含SAINT分子的本发明的载体的用途。
根据本领域内的知识水平已知癌症和代谢疾病在许多情况下是由特定基因的不想要的调控造成的。在关于该类型的疾病的分子生物学研究中，通常使用DNA修饰酶(DNA-modifying enzyme)(例如限制性酶、甲基化酶和去甲基化酶等)。这些酶以这样的方式特异性地起作用，即其对于人、动物、植物、细菌和病毒的基因组中的特定核苷酸序列的识别具有某些特异性。通常在每基因组中发现该类型的特定核苷酸序列几次，甚至有时数千次。
从Paul S.Lovett和Michael G Bramucci，″Evidence of anon-random base sequence in a Bacillus pumilus plasmidEcoRlendonuclease digestion of pPL576″Journal of Bacteriology，July1975，pg 377/379第123(1)卷的论文中了解上述技术学。此外，从由Cold Spring Harbor出版的手册“Molecular cloningalaboratory manual”，ed.T.Maniatis获知该技术学。
本发明的目的是产生对于基因组中的一个位置是特异性的酶。
特别地本发明的目的是提供可在基因组中非常特异性地选择想要的位置的可能性。在基因组中的选择的位置(基因的调控核苷酸序列)负责疾病的情况下，本发明提供了通过将特异性酶靶向所述基因的调控核苷酸序列来关闭该基因的可能性。本发明通过权利要求
1的特征部分描述的方案提供了该可能性。
其他有利的实施方案描述于从属权利要求
2至8。
根据其他方面，本发明涉及前面提到的和SAINT分子一起的载体将载体转运至细胞的用途。
SAINT分子是已知的，例如已知为转运载体，且已在欧洲专利公开号EP-0 755 924-B1和美国专利US-5,853,694中进行了详细的描述。
根据优选的实施方案，通过间隔分子将所述酶偶联至序列识别子(sequence recogniser)。从而在序列识别体(sequence recognizingentity)和酶之间产生空间分离，因此当所述载体结合至基因组时，酶活性不被抑制。通过该方式，所述酶能够以该酶通常作用的方式行使其功能。
为了获得想要的对于基因组中偏爱位置的特异性，使用优选的三链体形成单位或嵌入DNA小沟的寡核苷酸。该类型的序列识别子具有使其自身只适合于基因组中想要的位置的结构。因此，所述特异性变得非常高，并且当基于已知的结构合成这些序列识别子时，可使其只对基因组中的一个位置是特异的。该技术学对于本领域技术人员来说是公知的且更详细地描述于F.Sanger等人，“Use of DNA polymeraseI primed by a synthetic oligonucleotide to determine thesequence in phage fl DNA”Proc.Nat.Acad.Sci.USA第70卷，no.4.pg 1209-1213，April 1973的论文中。此外，该技术描述于由Cold Spring Harbor出版的手册“Molecular cloningalaboratory manual″，ed.T.Maniatis中。
因此优选地所述序列识别子具有对于基因组中想要的位置是特异性的DNA或PNA结构。这些结构可相对容易地合成。
根据另一个优选的实施方案，优选地所述想要的酶具有低Km。通过该方式，所述酶只有当其结合所述DNA时才可发挥其作用。在所述酶未被固定至所述DNA的情况下，其将不能发挥其活性。根据优选的实施方案，优选地所述酶包含所谓的“构象开关(conformationalswitch)”。该构象开关确保所述酶在所述DNA未在想要的位置结合的情况下将不产生活性。其原因是呈现不正确折叠的蛋白结构。
为了协助载体至细胞的良好转运，优选地可将所述载体和SAINT分子或SAINT分子的组合进行组合。任选地，其他化合物可和所述组合一起存在。
特别优选地，SAINT分子通过氢键相互作用。SAINT分子包裹了序列识别子和共价地结合至所述序列识别子的酶。这样，SAINT分子没有结合至载体(复合物)但其只通过氢键相互作用。当所述复合物在和细胞膜融合之后接触细胞内容物时，该氢键开始解开。
基于21聚体(其表示具有21个单位的链)的寡核苷酸、PNA或其它实体的DNA序列对于人基因组是特异性的。21聚体只出现一次。明显地，4的21次幂远大于人基因组的大小。当TFO一结合，酶就围绕所述DNA折叠并行使其功能。然而，所述寡核苷酸仍然附着至所述DNA，从而确保所述酶只可行使一次其功能。在细胞分裂时，所述DNA将从这些稀有的蛋白中“清除”，所述酶将被移走并通过常见的遍在蛋白途径降解。
上面已基本上描述了本发明的主要内容。基于上面的描述和所附的权利要求
，本领域技术人员将能够容易地产生其他实施方案，然而，所述其他实施方案都将落在本发明的范围之内。
(按照条约第19条的修改)1.用于将DNA修饰酶/分子转运至细胞核的载体，其特征在于组合该DNA修饰酶/杂合分子与Saint分子或其几个实体的组合。
2.权利要求
1的载体，其特征在于所述Saint分子通过氢键与所述DNA修饰酶/杂合分子结合。
3.SAINT分子和权利要求
1和2的DNA修饰酶/杂合分子一起用于将酶转运至细胞或其细胞核的用途。
权利要求
1.用于将DNA修饰酶转运至基因组中想要的位置的载体，其特征在于以使所述DNA修饰酶可在结合所述DNA的状态下行使其功能的方式将所述酶结合至对于基因组中想要的位置是特异性的序列识别子。
2.权利要求
1的载体，其特征在于所述酶通过间隔子被偶联至所述序列识别子。
3.权利要求
1或2的载体，其特征在于所述序列识别子是三链体形成单位或嵌入DNA的小沟的寡核苷酸。
4.权利要求
3的载体，其特征在于所述序列识别子具有对于基因组中想要的位置是特异性的DNA或PNA结构。
5.权利要求
1至4的载体，其特征在于所述酶具有低Km。
6.权利要求
1至5的载体，其特征在于所述酶包含构象开关。
7.权利要求
1至6的载体，其特征在于其和SAINT分子或其的几种实体的组合进行组合。
8.权利要求
7的载体，其特征在于所述SAINT分子通过氢键结合至所述载体。
9.SAINT分子和权利要求
1至6的所述载体一起用于转运所述载体至细胞的用途。
专利摘要
本发明涉及将DNA修饰酶转运至基因组中想要的位置的载体，所述DNA修饰酶以这样的方式，即以所述酶能够在结合至所述想要的位置时发挥其活性的方式偶联至对于基因组中的想要的位置是特异性的序列识别子(sequence recognizer)。
文档编号C12N15/87GKCN101044240SQ200580035811
公开日2007年9月26日 申请日期2005年10月20日
发明者M·H·J·勒伊特斯 申请人:辛沃鲁克斯Ip有限公司导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan